一種用于抑制prrsv感染的脫氧核酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于抑制PRRSV感染的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ?NO1。本發(fā)明的脫氧核酶能夠有效的抑制PRRSV感染。
【專利說明】—種用于抑制PRRSV感染的脫氧核酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物酶【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說涉及一種用于抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染的脫氧核酶。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征(porcine!^productive and respiratory syndrome, PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的一種急性傳染病，該病的主要特征是繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，基因組3’非編碼區(qū)(3’ -UTR)有ploy (A)尾序列，5’非編碼區(qū)(5’ -UTR)有帽狀引導(dǎo)序列。基因組還有9個相互重疊的開放閱讀框，ORFla和ORFlb主要編碼病毒的RNA復(fù)制酶和聚合酶；0RF2-7分別編碼GP2，E，GP3，GP4，GP5，基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N。
[0004]PRRSV侵入宿主細胞主要是通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合，利用細胞的內(nèi)吞作用而感染易感細胞。如豬肺泡巨噬細胞(PAM)和猴腎細胞(MA-104，Marc-145)。至今已報道了四個獨立但功能相關(guān)的PRRSV受體:唾液酸粘附素Sn，硫酸乙酰肝素HS，波形蛋白Vimentin,清道夫受體蛋白0)163。
[0005]PRRSV于1987年在美國的北卡羅納、衣阿華等州的豬群中首次爆發(fā)，此后呈全球性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。我國于1996年，由郭寶清首次在國內(nèi)某豬場分離到了 PRRSV。特別是2006年下半年，突變的PRRSV引起我國南方一些省份豬場爆發(fā)“高熱”綜合征，使我國的養(yǎng)豬業(yè)遭到了巨大的影響，以至于豬肉價格居高不下，影響了人們的生活水平。PRRSV—年四季都可發(fā)生，在每年的深秋至次年的早春，該病更為肆虐，給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失已經(jīng)遠遠超過某些A類傳染病。盡管世界各養(yǎng)豬大國對PRRSV給予了足夠的重視，但到目前為止人們對PRRSV非編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的功能、病毒的致病機制、病毒的持續(xù)性感染機制、機體對病毒的免疫機制等缺乏深入的認識而難于防治，而且一旦豬場發(fā)生PRRS后，需要花很大的費用和時間才能夠凈群，所以目前PRRS還是威脅各國養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。目前主要依靠綜合防治措施控制該病的發(fā)生和傳播。預(yù)防本病的疫苗主要是滅活苗和弱毒苗，尚未有有效的治療措施。
[0006]脫氧核酶
[0007]脫氧核酶(DNAzyme)是利用體外分子進化技術(shù)(systematic evolution ofligands by exponential enrichment, SELEX),從隨機脫氧核苷酸庫中獲得的一種具有酶活性的DNA分子。通過該技術(shù)已篩選出具有核酸酶活性、激酶活性、過氧化物酶活性等多種催化功能的脫氧核酶。作為一種潛在的強有力的RNA特異性切割工具，具有很好的應(yīng)用前景。目前最具有應(yīng)用前景的是經(jīng)典脫氧核酶“ 10-23 ”，無論是在體外應(yīng)用于RNA限制性內(nèi)切酶，還是在體內(nèi)作為RNA水平上的基因失活劑，都具有很好的應(yīng)用前景?！?0-23”型脫氧核酶由29個核苷酸組成，其中的催化中心有15個核苷酸(GGCTAGCTACAACGA)，催化中心的兩側(cè)各連有8個核苷酸的結(jié)合臂，用于結(jié)合底物RNA。DNAzyme最重要的一種性質(zhì)，也是目前研究最活躍的一個方面，是具有通過酯化作用而切割RNA分子的功能。DNAzyme這種獨特的性質(zhì)，使其有可能成為抗病毒感染、腫瘤等疾病的新型基因治療藥物和基因功能研究、核酸突變分析等的新型核酸工具酶。[0008]由于RNA核酶片段較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對靶位點的接近性差，并且合成十分困難，極易降解，使其應(yīng)用受到限制。而DNAzyme的高效性、高特異性、高穩(wěn)定性、短小精悍、易修飾、廉價低毒等特性使其作為一種新型的基因抑制工具，在多種領(lǐng)域的基因治療中得到了廣泛應(yīng)用，許多針對病毒感染性疾病設(shè)計的DNAzyme已經(jīng)進入臨床實驗評估階段。隨著各種研究數(shù)據(jù)的積累和新型高效傳送載體的開發(fā)，DNAzyme必將在病毒學(xué)研究及病毒性疾病的治療、酶學(xué)研究、生命進化研究、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和醫(yī)藥生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。
[0009]早在1997年，Santoro等就設(shè)計出可特異性切割人類免疫缺陷病毒(HIV-1) gag/pol、env、vpr、tat 和 nef mRNA 起始編碼區(qū)的 DNAzyme。Banerjea 等則在 2003 年建立了快速鑒別靶標RNA切割位點的方法，針對HIV-1病毒基因5’末端順式激活反應(yīng)元件(TAR)篩選出許多切割位點用于抑制病毒的復(fù)制。針對乙肝病毒，研究者設(shè)計的DNAzyme可在0.1~
2.5mmol/L范圍內(nèi)以劑量依賴方式特異性抑制相應(yīng)病毒基因的表達，并且抑制效率遠遠高于反義寡核苷酸。此外，于樂成等以“10-23”型DNAzyme催化基序設(shè)計的針對丙型肝炎病毒(HCV) 5’非編碼區(qū)及部分C區(qū)的DNAzyme用于治療HCV感染，也觀察到了較好的抑制效果。DNAzyme還在其他病毒(呼吸道合胞病毒、人鼻病毒)中有很好的切割效果。盡管經(jīng)典“10~23”型脫氧核酶的切割范圍很廣，但是切割效率及特異性還有待于進一步提高，尤其是避免隨機切割非靶位點帶來的副作用。目前對于脫氧核酶的結(jié)構(gòu)和功能已有初步了解，但多數(shù)研究仍處于實驗階段。還必須尋找催化效率更高特異性更強的脫氧核酶，進一步了解其結(jié)構(gòu)和功能特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種抑制PRRSV感染的脫氧核酶(ASON-Bulge-DNAzyme-PRRSV)，其核苷酸序列為 SEQ NOl:
[0011]59 -nnnnnnnnnnnnnnnnaagtacnnnnnnnnnnggctacaacgannnnnnnn-3> ；
[0012]其中η可以為a或g或c或t ;
[0013]其中5’ -aagtac-3’為一個非配對環(huán)“Bugle”，其可以增強脫氧核酶的切割效率和特異性；
[0014]其中優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N02:
[0015]5’ -ggtaaaagcacaattcaagtacagatcaaaaggggctagctacaacgagcagaagc-3> ；
[0016]其中另一個優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N03:
[0017]5’ -gtgttcccgtgcagcaaagatcttgggctgggctagctacaacgagccaatgg-3> ；
[0018]其中另一個優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N04:
[0019]5’ -tttttttttttttttttttaagtacttttttttaaggctagctacaacgatacggccgc-3> ；
[0020]其中另一個優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N05:
[0021]5’ -acttttaagttcacaggaggtacagggtgaaggggctagctacaacgaccggttgtg-3> ；
[0022]其中另一個優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N06:[0023]5’ -tcgacaagaaacatgaaagtactccaaatgcgggctagctacaacgaccagaacc-3>。
[0024]本發(fā)明的抑制PRRSV的脫氧核酶的設(shè)計原理為:
[0025]本發(fā)明的脫氧核酶的結(jié)合部位通過Watson-Crick堿基配對與底物RNA分子結(jié)合，催化部位(5’ -GGCTAGCTACAACGA-3’)在RNA分子的一個未配對的嘌呤和一個已配對的嘧啶堿基處切割RNA ;同時，于5’端加入一個6bp非配對環(huán)“Bugle”(5’ -AAGTAC-3’ )，增強脫氧核酶的切割效率和特異性；其次，所設(shè)計的脫氧核酶不形成自身分子內(nèi)Watson-Crick堿基配對，同時，能夠避開底物RNA中過長分子內(nèi)堿基配對區(qū)和其它特殊高級結(jié)構(gòu)；利用加拿大科學(xué)院ZUKER編寫的PCFOLD計算機軟件預(yù)測靶mRNA (M，5’_UTR，3’_UTR，ORFlb, CD163)切點兩翼堿基序列切割片段的結(jié)合自由能，最后，將設(shè)計好的脫氧核酶直接在核酸合成儀上大量合成。
[0026]本發(fā)明的脫氧核酶能夠有效的抑制PRRSV的感染，體外實驗證明，其能有效的控制PRRSV感染Marc-145細胞，因此，可用于PRRSV感染的預(yù)防與治療。
[0027]本發(fā)明的有益效果:
[0028]脫氧核酶既可以針對RNA，也可以切割或修飾DNA。病毒的基因組較簡單，加之病毒生存周期活細胞依賴的特殊性，使病毒對于核酸損傷特別敏感，同時也使DNAzyme在病毒感染性疾病的治療和診斷中的應(yīng)用具有很好的可操作性和可行性。本發(fā)明的脫氧核酶在切割效率和穩(wěn)定性上比經(jīng)典“10~23”脫氧核酶效果更好，可以更有效的抑制PRRSV。對該脫氧核酶的深入研 究，對PRRSV的致病機理及防治有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖lASON-Bulge-DNAzyme-PRRSV 轉(zhuǎn)染后 72h 對 PRRSV 的抑制效果。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0031]材料來源
[0032]1.細胞、病毒及PRRSV陽性豬血清
[0033]本發(fā)明中細胞Marc-145登載于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向該菌種保藏中心索取；PRRSV-S3毒株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所病毒課題組從PRRSV感染病豬的內(nèi)臟組織中分離獲得(分離方法為:豬繁殖呼吸綜合征病毒S3毒株的分離及其免疫特性研究.動物醫(yī)學(xué)，2002，23(4):87-90)，后期經(jīng)血清學(xué)試驗，分子生物學(xué)試驗，測序分析確定為美洲型PRRSV ；PRRSV陽性豬血清由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所病毒課題組攻毒PRRSV陰性仔豬獲得。
[0034]2.工具酶和主要商品試劑
[0035](I)DMEM培養(yǎng)基(HycI ine )購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco0
[0036](2) 100X青鏈霉素溶液:10,000單位/mL青霉素，10，000 μ g/ml鏈霉素溶于
0.85%NaCL溶液，-20°C保存。購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。
[0037](3) PBS 緩沖液(0.01M, pH=7.4):配制 400mL 溶液時，在 350mL ddH20 中加入:
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種用于抑制PRRSV感染的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ NOl0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN02。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN03。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN04。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN05。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫·氧核酶，其核苷酸序列為SEQN06。
【文檔編號】A61P31/14GK103525819SQ201310501257
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】李紅, 易建中, 劉成倩 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院