大鯢黏液蛋白、制備方法及在化妝品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種大鯢黏液蛋白、制備方法及在化妝品中的應(yīng)用。大鯢黏液蛋白分子量為17000道爾頓，含兩個亞基8500道爾頓，所述亞基含有77個氨基酸殘基；N末端為：纈氨酸-甘氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-。該大鯢黏液蛋白質(zhì)具有凝集血紅細(xì)胞活性、降低毛細(xì)血管通透性以及促進(jìn)細(xì)胞生長等作用，所制備的化妝品，可有效改善皮膚毛細(xì)管血管擴(kuò)張癥（俗稱紅血絲）。
【專利說明】大鯢黏液蛋白、制備方法及在化妝品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大鯢黏液蛋白及制備方法，尤其是一種具有凝集血紅細(xì)胞特性的大鯢黏液蛋白、制備方法及在化妝品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大鯛是我國特有的珍稀特產(chǎn),屬國家二類保護(hù)動物。主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游的溪流中。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展，大鯢資源的精深加工利用成為一個關(guān)系大鯢產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的緊迫課題。大鯢體表無鱗多皮膚腺，在生長過程中不斷分泌黏液，內(nèi)含多種活性物質(zhì)。如Guo等人在《Z.Naturforsh》上發(fā)表了從大鯢黏液中提取出的磷脂酶A2 [Z.Naturforsh, 67c, 86-92(2012)];王立峰等人從大鯢黏液中分離出抗菌肽(《中國生化藥物雜志》，2011年，第34卷第4期，269-272頁)；馮敘橋等鑒定了從大鯢黏液中制備的糖肽結(jié)構(gòu)(《食品工業(yè)科技》，2012年，第33卷第6期，128-131頁)。迄今為止，還沒有以大鯢黏液為原料，制備具有凝集血紅細(xì)胞特性的大鯢黏液蛋白的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種具有凝集血紅細(xì)胞特性的大鯢黏液蛋白、制備方法及在化妝品中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種大鯢黏液蛋白，其特征在于分子量為17 000道爾頓，含兩個亞基8500道爾頓，所述亞基含有77個氨基酸殘基；N末端為:纈氨酸-甘氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸_。
[0005]所述大鯢黏液蛋白的氨基酸含量(摩爾/100摩爾)為:天冬氨酸和天冬酰胺
4.76%，蘇氨酸7.05%,絲氨酸5.62%，谷氨酰胺和谷氨酸5.25%，脯氨酸9.02%,甘氨酸17.88%，丙氨酸4.83%，纈氨酸7.16%,異亮氨酸7.14%,亮氨酸8.25%，酪氨酸5.26%,苯丙氨酸5.27%組氨酸1.79%，精氨酸2.07%，甲硫氨酸1.，32%，賴氨酸7.22%。
[0006]一種上述大鯢黏液蛋白的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行:
a.收集大鯢黏液，將大鯢黏液在(TlO°C時(shí)進(jìn)行勻漿，向勻漿中加入f3倍體積pH 7^8含有0.15 M NaCl的0.01~0.1M Tris-HCl緩沖液，置于4°C過夜，5000g離心20 min，收集上清；
b.向所收集上清中加入(見14)2504至80%飽和濃度，靜置過夜后，500(^離心20min，收集沉淀，透析、凍干，得大鯢黏液凍干粉；
c.用pH6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl緩沖液溶解大鯢黏液凍干粉，加入到交聯(lián)的卵黏白蛋白-豬胃黏蛋白(3:1)親和層析上，先用pH 6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl緩沖液清洗，再用1.5 M NaCl溶液洗脫，收集NaCl洗脫液，透析凍干；
d.將凍干粉溶于pH 6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl沖液中，再加到分子篩層析 Sephadex G-100 (1.8 X 98cm)上，收集具有OD28tl吸收的層析峰，得大鯢黏液蛋白。[0007]一種大艦黏液蛋白在化妝品中的應(yīng)用。
[0008]所述大鯢黏液蛋白在改善皮膚毛細(xì)管血管擴(kuò)張癥化妝品中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明是以大艦黏液為原料所制備的大艦黏液蛋白，該大艦黏液蛋白質(zhì)具有凝集血紅細(xì)胞活性、抑制血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶以及促進(jìn)細(xì)胞生長等作用，所制備的化妝品，可降低毛細(xì)血管通透性，有效改善皮膚毛細(xì)管血管擴(kuò)張癥(俗稱紅血絲)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明實(shí)施例的大鯢黏液蛋白SDS聚丙酰胺凝膠電泳圖。
[0011]圖2是本發(fā)明實(shí)施例的大鯢黏液蛋白凝集血紅細(xì)胞活性效果圖。
[0012]圖3是本發(fā)明實(shí)施例的大鯢黏液蛋白抑制血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]依次按如下步驟進(jìn)行:
a.收集大鯢黏液，將大鯢黏液在(TlO°C時(shí)進(jìn)行勻漿，向勻漿中加入f3倍體積pH 7^8含有0.15 M NaCl的0.01~0.1M Tris-HCl緩沖液，置于4°C過夜，5000g離心20 min，收集
上清；
b.向所收集上清中加入(見14)2504至80%飽和濃度，靜置過夜后，500(^離心20min，收集沉淀，透析、凍干，得大鯢黏 液凍干粉；
c.用50毫升pH6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl緩沖液溶解150mg大鯢黏液凍干粉，加入到交聯(lián)的卵黏白蛋白-豬胃黏蛋白(3:1)親和層析上，先用pH 6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl緩沖液清洗，再用1.5 M NaCl溶液洗脫，收集NaCl洗脫液，透析凍干；
d.將凍干粉溶于pH6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl沖液中，取1.5毫升加到分子篩層析Sephadex G-100 (1.8X98cm)上，收集具有OD28tl吸收的層析峰，得5 mg大鯢黏液蛋白(ADL)?？梢灾瞥煞蹌?、片劑和針劑等商品劑型。
[0014]SDS聚丙酰胺凝膠電泳如圖1所示，圖1中1.ADL ； 2.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)；3:加入二硫蘇糖醇的ADL。
[0015]本發(fā)明的大鯢黏液蛋白分子量為17 000道爾頓，含兩個亞基8500道爾頓，每個亞基含有77個氨基酸殘基。
[0016]經(jīng)檢測該大鯢黏液蛋白的結(jié)構(gòu)，N末端為:纈氨酸-甘氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸_。每100摩爾大鯢黏液蛋白氨基酸含量(摩爾/100摩爾)為:天冬氨酸和天冬酰胺4.76%，蘇氨酸7.05%,絲氨酸5.62%，谷氨酰胺和谷氨酸5.25%，脯氨酸9.02%，甘氨酸17.88%，丙氨酸4.83%，纈氨酸7.16%,異亮氨酸7.14%,亮氨酸8.25%，酪氨酸5.26%，苯丙氨酸5.27%組氨酸1.79%，精氨酸2.07%，甲硫氨酸1.，32%,賴氨酸7.22%。
[0017]皮膚毛細(xì)管血管擴(kuò)張癥(俗稱紅血絲)是由于毛細(xì)血管擴(kuò)張，皮膚收縮造成的。抑制毛細(xì)管血管擴(kuò)張，可以抑制紅血絲的形成。血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶具有促進(jìn)毛細(xì)管血管擴(kuò)張的作用，抑制該酶即可抑制紅血絲的形成。另一方面，促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長更新，可以維持毛細(xì)血管的正常通透性，改善皮膚毛細(xì)管血管擴(kuò)張癥。[0018]實(shí)驗(yàn)一:證實(shí)大鯢黏液蛋白具有凝集人紅細(xì)胞(B型)作用
將人紅細(xì)胞(B型)懸浮于IOml 0.1mol L-1的緩沖液中，加入2 mg胰蛋白酶，在37°C條件下消化3h，然后用0.1mol L-1的緩沖液沖洗3次，再用0.1molL-1的緩沖液配成體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸浮液。在96孔U型板中，將本發(fā)明實(shí)施例的大鯢黏液蛋白25 μl用0.01mol L-1的緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，然后加入到每個孔中，在每個孔中再加入等體積攪動后的體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸浮液，30min后目測血凝結(jié)果，如圖1第一排所示，紅細(xì)胞之間形成一似網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)散的紅斑塊，證明本發(fā)明的大鯢黏液蛋白凝集血紅細(xì)胞活性。第二排為對照組，紅細(xì)胞沒有發(fā)生凝集，在“U”型血凝板小孔內(nèi)沉于孔底形成一界線清晰的紅色小點(diǎn)。
[0019]實(shí)驗(yàn)二:大鯢黏液蛋白抑制血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶的活性
按照莊書斐等報(bào)道的方法測定大鯢黏液蛋白抑制血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶的活性(《中國藥理學(xué)報(bào)》，2002年第23期，第117-123頁)。
[0020]利用96孔板，測試大鯢黏液蛋白抑制血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶(Fl0)活性。Fl0可以磷酸化PolvE4Y (谷氨酸與酪氨酸多肽聚合物)，PolvE4Y磷酸化程度可以通過抗磷酸化單克隆抗體PY20識別。將100μl的PolvE4Y溶液(lmg/L,溶于0.02 M的Tris-HCl緩沖液中，PH7.5，含有0.15M NaCl，TBS)加入到ELISA專用96孔板每一孔中，4°C下放置一夜，棄去上清。加入100μl的Fl0 (0.0001Μ)和100μl本發(fā)明所得大鯢黏液蛋白(ADL)溶液，在37°C下孵育1h后，用TBS洗3次后，用5%的BSA封閉30min。用含有0.1%的Tween的TBS沖洗3次后，每孔加入100μl的ΡY20 (20ug/L)，在室溫下放置2h。用TBS洗3次后，添加100μl辣根過氧化物酶HRP偶聯(lián)的抗ΡΥ20抗體，在室溫下放置lh。用TBS沖洗3次后，加入100μl ρΗ5.5的0.1M檸檬酸緩沖液到每一孔中，該緩沖液含有1.3 mM H2O2以及IOmM的O-鄰苯二胺。顏色變化后用100μl的IM H2SO4終止反應(yīng)。于492nm處測定吸光值。以Fltl為陽性對照，不同濃度的大鯢黏液蛋白對血管內(nèi)皮生長因子受體1激酶(Fl0)的抑制率如圖3所示，ADL在20ug/ml濃度下對血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶(Fl0)的抑制率達(dá)到80、0%。證明本發(fā)明的大鯢黏液蛋白具有非常強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮生長因子受體I激酶活性。
[0021]實(shí)驗(yàn)三.含有ADL的護(hù)膚霜對成纖維細(xì)胞生長促進(jìn)活性測定:
本發(fā)明所得的大鯢黏液蛋白應(yīng)用于化妝品中，使用時(shí)與現(xiàn)有的化妝品混合即可，也可以在化妝品的基料中摻入含有總重量0.1~1%的大鯢黏液蛋白制成化妝品，化妝品基料可以是現(xiàn)有的普通化妝品。
[0022]1.樣品制備
護(hù)膚霜為表1所示配方:
表1
【權(quán)利要求】
1. 一種大鯢黏液蛋白，其特征在于分子量為17 OOO道爾頓，含兩個亞基8500道爾頓，所述亞基含有77個氨基酸殘基；N末端為:纈氨酸-甘氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸_。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鯢黏液蛋白，其特征在于:所述大鯢黏液蛋白的氨基酸含量(摩爾/100摩爾)為:天冬氨酸和天冬酰胺4.76%，蘇氨酸7.05%,絲氨酸5.62%，谷氨酰胺和谷氨酸5.25%，脯氨酸9.02%,甘氨酸17.88%，丙氨酸4.83%，纈氨酸7.16%,異亮氨酸7.14%,亮氨酸8.25%，酪氨酸5.26%，苯丙氨酸5.27%組氨酸1.79%，精氨酸2.07%，甲硫氨酸1.，32%,賴氨酸7.22%。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述大鯢黏液蛋白的制備方法，其特征在于依次 按如下步驟進(jìn)行: a.收集大鯢黏液，將大鯢黏液在(TlO°C時(shí)進(jìn)行勻漿，向勻漿中加入f3倍體積pH 7^8含有0.15 M NaCl的0.01~0.1M Tris-HCl緩沖液，置于4°C過夜，5000g離心20 min，收集上清； b.向所收集上清中加入(見14)2504至80%飽和濃度，靜置過夜后，500(^離心20min，收集沉淀，透析、凍干，得大鯢黏液凍干粉； c.用pH6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl緩沖液溶解大鯢黏液凍干粉，加入到交聯(lián)的卵黏白蛋白-豬胃黏蛋白親和層析上，先用pH 6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl緩沖液清洗，再用1.5 MNaCl溶液洗脫，收集NaCl洗脫液，透析凍干； 將凍干粉溶于pH 6-9,0.01-0.1 M Tris-HCl沖液中，再加到分子篩層析S印hadexG-100上，收集具有OD28tl吸收的層析峰，得大鯢黏液蛋白。
4.一種大艦黏液蛋白在化妝品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述大鯢黏液蛋白在制備化妝品中的應(yīng)用，其特征在于在改善皮膚毛細(xì)管血管擴(kuò)張癥化妝品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K8/64GK103613654SQ201310393629
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】李偉, 佟長青, 曲敏, 金橋 申請人:張家界（中國）金馳大鯢生物科技有限公司