一種用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)學研究用生物器材領域，具體涉及一種用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的微滲透壓泵裝置。本發(fā)明包括Alzet微滲透壓泵，脂多糖和博來霉素；所述的博來霉素溶液裝載于Alzet微滲透壓泵中，所述的脂多糖溶液包被于所述的泵表面。通過體內驗證實驗顯示，皮下植入此泵裝置后1～4周即出現(xiàn)皮膚炎癥和纖維化，3～4周出現(xiàn)肺部炎癥和纖維化，以及系統(tǒng)性的免疫應答紊亂。采用本裝置誘導的研究模型，不但能夠良好模擬系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病特征，且操作過程簡易，重復性強，對系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病機制和防治措施的研究具有重要意義。
【專利說明】一種用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)學研究用生物器材領域，涉及微滲透壓泵裝置。具體涉及一種用于誘 導系統(tǒng)性硬化癥模型的微滲透壓泵裝置。

【背景技術】：
[0002] 硬皮?。╯cleroderma)是一種以皮膚及各系統(tǒng)組織纖維化為特征的結締組織疾 病。一旦內臟受累又稱為系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis, SSc),此類患者病情趨于惡 化，5年生存率為34?80%。
[0003] 系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病機制錯綜復雜，目前研究結果認為，在遺傳易感性基礎上，由于 環(huán)境因素刺激而激活機體的炎癥反應和自身免疫應答，進而血管內皮細胞受損，成纖維細 胞活化、增殖，大量合成細胞外基質，造成組織纖維化，隨著病情發(fā)展，炎癥消退，纖維化反 應仍不可逆轉，最終導致多系統(tǒng)血管病變、組織纖維化和內臟功能衰竭，病情難以逆轉，且 至今尚無有效治療手段，因此，對系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病機制和治療靶點深入探討已引起本 領域研究人員的關注。
[0004] 研究實踐顯示，建立穩(wěn)定的體內、外研究模型，對于闡明發(fā)病機制和遴選治療藥物 具有非常重要的意義。實踐顯示，目前已知的模型均存在一定的局限性：1999年Yamamoto 等人采用博來霉素皮下注射制備了皮膚硬化動物模型，此模型以局限性皮膚纖維化為主， 內臟受累發(fā)生率低，且需要每日注射，工作量大，還易導致小鼠皮膚的局限性潰爛；緊皮鼠 (Tskl /+小鼠）是原纖維蛋白Ufibrill inl，F(xiàn)BNl)基因編碼變異所致，可自發(fā)產生硬皮 病樣改變，以彌漫性皮膚肥厚為特征，與人類硬皮病不同，緊皮鼠皮下組織異常增生，而真 皮層未受明顯影響，易發(fā)展成肺氣腫樣改變而非纖維化反應，基本不出現(xiàn)血管病變，炎癥改 變亦不明顯；移植物抗宿主反應模型亦可表現(xiàn)為皮膚纖維化，皮膚脂肪層消失以及單核細 胞浸潤，但相關品系小鼠獲得成本高，培養(yǎng)環(huán)境要求較嚴格，不宜推廣。目前已知，Alzet Osmotic Pumps是體積只有膠囊大小的滲透壓泵，適合植入實驗動物體內，針對特定部位 給藥，或將藥劑用導管導入作用部位，在生命科學實驗研究中，Alzet pumps已成功的運 送上百種藥劑，包括蛋白質，多肽，生長因子，基因研究及治療中的Antisense和最新的干 擾RNA(RNAi)，抗生素，化療藥，激素，類固醇及其它短效期的化合物。通過ALZET Osmotic pumps持續(xù)給藥可以建立多種疾病的動物模型，如高血壓及Parkinson帕金森病的動物模 型，其在動物細胞給藥、動物模型建構、藥物及分子篩選、藥理藥代藥效等眾多領域發(fā)揮了 不可替代的作用。Alzet微滲透壓泵作為一種利用微滲透壓原理制備的組織相容性的藥物 緩釋系統(tǒng)，1987年Harrison JH等人采用微滲透壓泵裝載博來霉素（100mg/kg)皮下植入 C57BL/6小鼠4?8周誘導肺纖維化的動物模型。但目前尚無采用Alzet微滲透壓泵制備 硬皮病研究模型的報道。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，尤其涉及一種用 于誘導出穩(wěn)定的系統(tǒng)性硬皮病模型的微滲透壓泵裝置。本發(fā)明所述的微滲透壓泵裝置具有 穩(wěn)定性、重復性、可操作性和標準化的特點。
[0006] 本發(fā)明經過反復實驗，摸索相關實驗條件，采用Alzet微滲透壓泵（可市購）局部 予以脂多糖急性刺激，輔以博來霉素緩釋，能模擬系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)生，尤其適用于系統(tǒng)性 硬皮病發(fā)病機制和治療靶點的研究及深入探討。
[0007] 具體的，本發(fā)明的一種用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，其包括Alzet 微滲透壓泵（可市購），脂多糖和博來霉素，所述的博來霉素（Sigma)溶液裝載于 Alzet (Model2004)微滲透壓泵中，所述的脂多糖（LPS)溶液包被于所述的泵表面。
[0008] 本發(fā)明中，Alzet微滲透壓泵（可市購）為Alzet(Model2004);
[0009] 本發(fā)明中，博來霉素（Bleomycin，BLM，Sigma)工作液濃度為12mg/ml，博來霉素以 0. 25ul/h的速度持續(xù)釋放于外界環(huán)境；
[0010] 本發(fā)明中，脂多糖（LPS)生理鹽水溶液濃度為100ng/ml ;
[0011] 本發(fā)明的用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，其特征在于，通過下述方法制得：
[0012] 在無菌超凈臺中將博來霉素（Sigma)溶液裝載于Alzet (Model2004)微滲透壓泵 中，蓋緊旋帽后浸于脂多糖（LPS)溶液，在37°C溫箱中放置40小時備用；
[0013] 其中，博來霉素（Bleomycin，BLM，Sigma)工作液濃度為12mg/ml，博來霉素以 0. 25ul/h的速度持續(xù)釋放于外界環(huán)境；
[0014] 脂多糖（LPS)生理鹽水溶液濃度為100ng/ml。
[0015] 本發(fā)明基于：脂多糖可致組織細胞的急性損傷，并啟動固有免疫應答的原理，將 脂多糖包被于泵表面，作用于機體后，可激發(fā)早期啟動階段的炎癥反應和固有免疫應答； Alzet微滲透壓泵借助與外界環(huán)境中的液體進行離子交換，使水分進入泵的可吸收層，膨脹 后在壓力的作用下，使儲液倉中的博來霉素以0. 25ul/h的速度持續(xù)釋放于外界環(huán)境，在體 內實驗中，微量的體液即可通過滲透壓原理使微泵中的博來霉素作用于局部和血液循環(huán)； 博來霉素通過氧化應激、促進轉化生長因子-β釋放等機制導致組織炎癥和纖維化。
[0016] 本發(fā)明的微滲透壓泵裝置進行了驗證實驗，結果表明：應用本泵裝置可有效誘導 出系統(tǒng)性硬化癥的體內、外研究模型，其作用可通過誘導成纖維細胞活化的方式實現(xiàn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是泵裝置誘導小鼠皮膚纖維化病理改變，
[0018] 其中，A :博來霉素泵處理的模型組1周時Η&Ε染色；
[0019] B :博來霉素泵處理的模型組1周時Masson' s染色
[0020] C :生理鹽水泵處理的對照組1周時H&E染色；
[0021] D :生理鹽水泵處理的對照組1周時Masson' s三色染色；
[0022] 圖2是泵裝置誘導小鼠肺纖維化病理改變，
[0023] 其中，A :博來霉素泵處理的模型組4周時H&E染色；
[0024] B :博來霉素泵處理的模型組4周時Masson' s染色
[0025] C :生理鹽水泵處理的對照組4周時H&E染色；
[0026] D :生理鹽水泵處理的對照組4周時Masson' s三色染色。

【具體實施方式】：
[0027] 實施例1制備誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的泵裝置
[0028] 用無菌生理鹽水將博來霉素（Bleomycin, BLM，Sigma)稀釋為12mg/ml工作液， 0. 22 μ m微孔無菌濾膜過濾后4°C保存，采用Iml注射器向微泵液體儲存室注射244. 8微升 博來霉素工作液，蓋緊流量控制帽，放置于lOOng/ml的脂多糖（LPS)生理鹽水溶液中，制成 LPS+BLM泵裝置，于37°C溫箱孵育48小時后取出，備用。
[0029] 實施例2
[0030] 泵裝置誘導小鼠系統(tǒng)性硬化癥發(fā)生，建立系統(tǒng)性硬化癥研究模型
[0031] 實驗動物：雌性6?8周C57BL/6小鼠，體重18?20g，SPF級，本實驗對動物的處 理均符合國際實驗動物使用準則。
[0032] 采用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，常規(guī)75%乙醇消毒皮膚后，在小鼠左后頸部下 Icm處開橫向切口，將LPS+BLM泵裝置頭側朝下埋植于小鼠皮下，手術縫合傷口，分別于植 入泵后的第1，2,3,4周處死小鼠，收集小鼠的外周血、皮膚、肺組織、脾臟和引流淋巴結進 行檢測；對照組采用Alzet泵裝載等體積生理鹽水，余處理同實驗組。
[0033] 采用SPSS16. 0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差（[土 s)表示，多組間比 較采用方差分析（ANOVA)進行比較，P < 0. 05為差異有顯著意義。
[0034] 皮膚組織病理結果顯示：
[0035] 與生理鹽水對照組相比較，皮下植入LPS+BLM泵裝置1周后，皮膚組織即可出現(xiàn) 大量炎性細胞浸潤，真皮層增厚，成纖維細胞增生，膠原纖維沉積，造模后2?4周，炎性細 胞浸潤逐漸消退，纖維化程度進行性加重，于第3周最為明顯：表皮層變薄，真皮層增厚，大 量成纖維細胞聚集成灶，皮膚腺體減少，被纖維條索取代，第4周時表皮萎縮，真皮層膠原 變性，結果表明，本發(fā)明的LPS+BLM泵裝置能誘導小鼠皮膚呈典型的"炎癥水腫期-纖維化 期-萎縮期"的硬皮病病理改變；
[0036] 肺組織病理結果顯示：
[0037] 與生理鹽水對照組相比較，皮下植入LPS+BLM泵裝置第3周后小鼠肺間質和肺泡 腔有大量炎癥細胞浸潤，肺組織結構尚完整；造模4周后肺間隔增厚，大量膠原纖維沉積， 肺泡腔結構紊亂，呈典型的"炎癥水腫期-纖維化期"的間質性肺炎病理改變；
[0038] 免疫指標結果顯示：
[0039] 采用流式細胞分析技術發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對照組相比較，皮下植入LPS+BLM泵裝置 的小鼠引流淋巴結和脾臟中Th2(CD4+IL4 +)，Thl7(CD4+IL17+)，Th22(CD4+IL22+)的細胞比例 明顯上調，采用ELISA檢測皮損處和外周血中IL-Ιβ，IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-22和 TGF-β的水平，顯示出明顯上調。
[0040] 結果證實，本發(fā)明的LPS+BLM泵裝置可誘導出皮膚、肺部的炎癥和纖維化的病理 改變，以及特征性的免疫應答紊亂，符合系統(tǒng)性硬化癥的發(fā)病特點，本LPS+BLM微滲透壓泵 可作為誘導穩(wěn)定的系統(tǒng)性硬化癥體內研究模型的裝置。
【權利要求】
1. 一種用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，其特征在于，其包括Alzet微滲透壓泵，月旨 多糖和博來霉素；所述的博來霉素溶液裝載于Alzet微滲透壓泵中，所述的脂多糖溶液包 被于所述的泵表面。
2. 按權利要求1所述的用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，其特征在于，所述的Alzet 微滲透壓泵為Alzet (Model2004)。
3. 按權利要求1所述的用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，其特征在于，所述的博來 霉素工作液濃度為12mg/ml，博來霉素以0. 25ul/h的速度持續(xù)釋放于外界環(huán)境。
4. 按權利要求1所述的用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置，其特征在于，所述的脂多 糖（LPS)生理鹽水溶液濃度為100ng/ml。
5. -種制備用于誘導系統(tǒng)性硬化癥模型的裝置的方法，其特征在于，通過下述方法制 得： 在無菌超凈臺中將博來霉素溶液裝載于Alzet (Model2004)微滲透壓泵中，蓋緊旋帽 后浸于脂多糖溶液制成LPS+BLM泵裝置，在37°C溫箱中放置40小時備用； 其中，博來霉素工作液濃度為12mg/ml，博來霉素以0. 25ul/h的速度持續(xù)釋放于外界 環(huán)境； 脂多糖生理鹽水溶液濃度為l〇〇ng/ml。
【文檔編號】A61K38/14GK104367990SQ201310361919
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月16日 優(yōu)先權日:2013年8月16日
【發(fā)明者】梁敏銳, 鄒和建, 何睿, 呂嬌艷 申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院