通過引起rna干擾的化合物治療腸病癥的制作方法
【專利摘要】本文公開了治療腸紊亂的方法和組合物，所述紊亂例如IBD和局限性回腸炎。優(yōu)選組合物包含siNA。還公開了通過直腸內(nèi)施用siNA化合物來特異性靶向siNA以治療腸紊亂的方法。
【專利說明】通過引起RNA干擾的化合物治療腸病癥
[0001]本申請是申請日為2006年3月14日的題為“通過引起RNA干擾的化合物治療腸病癥”的中國專利申請N0.200680008170.8的分案申請。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及通過RNAi直腸內(nèi)給藥技術(shù)對腸疾病進(jìn)行治療的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包括短干擾核酸分子(siNA)和相關(guān)的化合物，包括但不限于，小干擾RNAs (siRNA)。具體地說，本發(fā)明的組合物能夠被用于腸疾病的治療，其中包括:過度增殖性疾病，特別是結(jié)腸直腸癌；自身免疫和炎性腸病(IBD)，特別是局限性回腸炎；結(jié)腸炎，特別是潰瘍性結(jié)腸炎；腸易激綜合征；感染性腸疾病，例如假膜性結(jié)腸炎，阿米巴病或腸結(jié)核；結(jié)腸息肉；憩室??；便秘；腸梗阻；吸收不良綜合征；直腸疾病和腹瀉。
[0003]在某些實(shí)施方案中，由一種與I型輔助T(Thl)細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素-12(IL-12)水平的增高所引起的腸病癥，例如自身免疫疾病和IBD，是用此方法來進(jìn)行治療的。本發(fā)明提供了治療與IL-12過量表達(dá)有關(guān)的疾病的組合物和方法，特別是局限性回腸炎，其中包括siRNA和靶向IL12-p40亞基和/或IL12_p35亞基的相關(guān)化合物。
[0004]發(fā)明背景
[0005]以RNAi作為工具來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)
[0006]RNA干擾是指由雙鏈RNA (dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程。在20世紀(jì)90年代初期發(fā)現(xiàn)了植物具有此現(xiàn)象后，Andy Fire和Craig Mello證明了在Caenorhabditis線蟲中dsRNA能夠以一種非常高效的方式特異性地、有選擇性地抑制基因的表達(dá)(Fire et al.，1998)。第一條鏈(有義RNA)的序列與目標(biāo)信使RNA (mRNA)的對應(yīng)區(qū)域的序列相一致。第二條鏈(反義RNA)與mRNA互補(bǔ)。這樣形成的dsRNA證明比相應(yīng)的單鏈RNA分子(具體地說，反義RNA)的效率高幾個(gè)數(shù)量級。
[0007]RNAi過程起始于DICER酶與dsRNA相遇并將其切成稱為小干擾RNAs或siRNA的片段。此蛋白質(zhì)屬于核糖核酸酶III核酸酶家族。蛋白質(zhì)復(fù)合體將這些siRNAs聚集起來，并利用它們的編碼作為指導(dǎo)去搜尋和破壞細(xì)胞中具有匹配序列的RNA，例如目標(biāo)mRNA (見Bosher&Labouesse, 2000;和 Akashi et al.，2001)。
[0008]在應(yīng)用RNAi進(jìn)行基因擊倒的嘗試中，經(jīng)過驗(yàn)證，哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展了多種抗病毒感染的保護(hù)機(jī)制，其可阻礙這種方法的使用。的確，極低的病毒dsRNA水平的存在觸發(fā)一種干擾素的反應(yīng)，導(dǎo)致全面非特異性的翻譯抑制，進(jìn)而觸發(fā)調(diào)亡(Williams, 1997，Gil&Esteban, 2000)。
[0009]2000年，dsRNA被報(bào)道特異性地抑制小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎中的3個(gè)基因。翻譯停滯，和從而引起的PKR反應(yīng)，當(dāng)胚胎繼續(xù)發(fā)育時(shí)沒有被觀察到(Wianny&Zernicka-Goetz，2000)。Ribopharma AG (Kulmbach, Germany)的研究證明了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNAi的功能性，其功能在于利用短(20-24堿基對)dsRNAs切斷人類細(xì)胞基因，而又不啟動(dòng)急性期反應(yīng)。其他的研究小組也進(jìn)行了類似的試驗(yàn)，并驗(yàn)證了這些結(jié)果(Elbashir et al., 2001; Caplen et al.，2001)。經(jīng)過在人類和小鼠的多種正常和癌癥細(xì)胞品系中的測試證明短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNAs(shRNAs)能夠和它們的siRNA負(fù)體同等高效率地使基因沉默(Paddison et al.，2002)。最近，另外一組小RNAs (21-25堿基對)被顯示能夠引起對基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)作用。這些RNAs，即小時(shí)序控制的RNAs (stRNAs)，對Caenorhabditis線蟲發(fā)育過程中基因表達(dá)的時(shí)間選擇具有調(diào)節(jié)作用(關(guān)于綜述參見Banerjee&Slack, 2002 ;和 Grosshans&Slack, 2002)。
[0010]科學(xué)家們已經(jīng)在一些系統(tǒng)中使用了 RNAi,其中包括Caenorhabditis線蟲，果蜆，錐體蟲，和其它的無脊椎動(dòng)物。幾個(gè)研究小組近期提出了 RNAi在不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(特別是HeLa細(xì)胞)中對蛋白質(zhì)生物合成的特異性抑制，從而證明了 RNAi是一種可廣泛應(yīng)用的在體外使基因沉默的方法。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，RNAi已經(jīng)快速地成為了一種著名的確認(rèn)(識(shí)別和分配)基因功能的工具。使用短dsRNA寡核苷酸的RNAi有助于對僅被部分測序的基因功能的理解。
[0011]最近，Krutzfeldt和他的同事們的研究顯示一類被稱為antagomirs的特別設(shè)計(jì)合成的化合物能夠有效地使微小RNAs (miRNAs)沉默，其中微小RNAs為控制基因表達(dá)的非編碼 RNA 片段(Krutzfeldt et al.，2005)。
[0012]前文所述內(nèi)容是對與RNAi有關(guān)的相關(guān)技術(shù)的討論。提出這個(gè)討論僅僅是為了對下文所述之發(fā)明的理解，但并不承認(rèn)所描述的任何工作是對本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0013]白細(xì)胞介素-12和局限性回腸炎
[0014]白細(xì)胞介素-12(IL_12)是一種70kDa的異源二聚體糖蛋白(IL12_p70)，由一個(gè)40kDa的亞基(命名為IL12-p40)和一個(gè)35kDa的亞基(命名為IL12_p35)通過對IL-12的生物活性具有重要意義的二硫鍵的連接而組成。
[0015]IL-12是控制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和I型輔助T(Thl)細(xì)胞炎性反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子(Gately et al., 1998; Trinchieri, 1998) ? IL-12對Thl細(xì)胞發(fā)育的強(qiáng)促進(jìn)作用使它成為在對Thl細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，例如自身免疫疾病和炎性腸病(IBD)，進(jìn)行治療時(shí)理想的靶標(biāo)。
[0016]一種特殊的IBD是局限性回腸炎，其病理學(xué)特征在于由腸組織中抗原呈遞細(xì)胞引起的IL-12生成量的增加，以及由腸淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞引起的干擾素- Y和腫瘤壞死因子 _a (TNF-α )生成量的增加(Fais et al., 1994; Fuss et al., 1996;Monteieone etal.,1997;Parronchi et al., 1997;Pievy et al.，1997)。
[0017]局限性回腸炎會(huì)引起小腸炎癥。此炎癥能夠引起疼痛，并能夠頻繁地引起腸空虛，進(jìn)而引起腹瀉。盡管也有可能出現(xiàn)直腸出血、體重減輕和發(fā)燒的癥狀，但局限性回腸炎最常見的癥狀是腹痛和腹瀉。出血癥狀可能是嚴(yán)重而持久的，從而導(dǎo)致貧血?；加芯窒扌曰啬c炎的兒童可能會(huì)遭受延遲發(fā)育和矮小生長的痛苦。
[0018]大多數(shù)人是首先通過含有一種幫助控制炎癥的物質(zhì)5-氨基水楊酸的藥物進(jìn)行治療的。最常使用的藥物是柳氮磺吡啶。病情不能得到改善或不能忍受此藥物的患者可以接受其它含5-氨基水楊酸的藥物的治療，普遍使用的是5-ASA劑，例如美沙拉秦片，Dipentum或頗得斯安。5-氨基水楊酸制劑可能的副作用包括惡心、嘔吐、腹瀉和頭痛。有些患者使用皮質(zhì)類固醇來控制炎癥。這些藥物是對活性局限性回腸炎最為有效，但是它們能引起嚴(yán)重的副作用，其中包括對感染更高的易感染性。一些抑制免疫系統(tǒng)的藥物也被用于治療局限性回腸炎。最普遍的處方是6-巰基嘌呤和一種相關(guān)藥物——硫唑嘌呤。免疫抑制劑是通過阻斷引起炎癥的免疫反應(yīng)而起作用的。這些藥物可能導(dǎo)致如惡心、嘔吐和腹瀉的副作用，并可能降低人體對感染的抵抗力。手術(shù)切除部分腸子能夠?qū)窒扌曰啬c炎有所幫助，但并不能治愈它。由于當(dāng)前對局限性回腸炎治療方法的副作用以及療效的缺乏，研究人員繼續(xù)尋找更加有效的治療方法。
[0019]對IL-12作用的抑制已經(jīng)被顯示能夠在許多自身免疫和慢性炎癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸种萍膊〉陌l(fā)展和臨床進(jìn)程(Caspi，1998)。這些模型包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性自身免疫眼色素層炎(EAU)、膠原質(zhì)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)、自身免疫腎炎、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和IBD的不同模型(Vandenbroeck et al.，2004)。在這些模型中，內(nèi)生IL-12的角色已經(jīng)通過IL-12p40敲除小鼠或通過施用抗IL-12抗體而被提出了。
[0020]具體地說，在患局限性回腸炎的動(dòng)物模型中抗體靶向IL-12是一種對腸炎癥有效的治療(Mannon et al.，2004)。因此，患有由三硝基苯磺酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的小鼠具有Thl介導(dǎo)的腸炎癥，其特征在于IL-12、干擾素-Y和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)生成量的大量增加。在小鼠中，對抗IL-12的單克隆抗體的使用能夠引起已形成的結(jié)腸炎消退，并且如果引起結(jié)腸炎的時(shí)刻使用，能夠阻止炎癥的形成(Neurath et al.，1995)。
[0021]抗白細(xì)胞介素-12還能夠阻止和治療出現(xiàn)在由Thl介導(dǎo)產(chǎn)生炎癥的模型中的自發(fā)性結(jié)腸炎，這種模型例如包括過量表達(dá)人類CD3 ε基因的小鼠和白細(xì)胞介素-10缺陷型小鼠(Davidson et al., 1998;Simpson et al.，1998)。
[0022]從較早2期研究獲得的數(shù)據(jù)提供了一些用抗IL_12p40的單克隆抗體進(jìn)行治療并使局限性回腸炎的患者產(chǎn)生臨床反應(yīng)和康復(fù)的證據(jù)(Mannon et al.，2004)。這種治療與在疾病位點(diǎn)上由Thl介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的減少有關(guān)。
[0023]以前從動(dòng)物模 型中獲得的證據(jù)，以及抗IL-12在局限性回腸炎患者中的臨床效果(Mannon et al.，2004)，都強(qiáng)調(diào)了 IL-12作為目標(biāo)對未來局限性回腸炎的治療的重要性。
[0024]依靠siRNA對IL-12水平的調(diào)制
[0025]靶向IL-12表達(dá)的siRNA已經(jīng)被用于獲得修飾的樹突細(xì)胞(DC)。這種修飾的樹突細(xì)胞(DC)可以被用于通過多種治療學(xué)的體外、先體外后體內(nèi)(exvivo)和體內(nèi)的方法來調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，因此已經(jīng)被用到治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體的免疫紊亂的治療方法中(W003/104456;Hill et al.，2003)。在成熟的DC中靶向IL-12表達(dá)的siRNA已經(jīng)顯示了IL-12在由成熟DC促進(jìn)的自然殺傷細(xì)胞干擾素Y (IFN-Y)分泌上關(guān)鍵性的作用(Borg etal, 2004)。此外，IL-12p35抑制因子，包括siRNA，已經(jīng)令人驚訝地證明能夠阻斷前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的分化以及脂肪細(xì)胞中甘油三酸酯的積累(W003/104495)。
[0026]靶向IL_12p40的siRNA通過脂質(zhì)體包囊作用被成功地傳遞到鼠類腹膜腔，以調(diào)節(jié)經(jīng)內(nèi)毒素挑戰(zhàn)后的局部和全身的炎癥反應(yīng)(Flynn et al.，2004)。然而，據(jù)我們所知，并不存在早期關(guān)于直腸內(nèi)施用siRNA對IL-12的負(fù)調(diào)節(jié)作用的證據(jù)，也沒有涉及到腸病理學(xué)的任何其它基因的證據(jù)。我們已經(jīng)研制了在體內(nèi)對IL-12表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)的技術(shù)，以用于治療腸紊亂；我們還研制了通過直腸內(nèi)給藥使siRNA靶向腸的技術(shù)。
[0027]發(fā)明概沭
[0028]本發(fā)明提供了利用直腸內(nèi)施用RNAi技術(shù)治療腸疾病的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包括短干擾核酸分子(siNA)和相關(guān)的化合物，包括但不僅限于，siRNA。具體地說，本發(fā)明的組合物能夠被用于制備藥物以治療腸疾病，其中包括:增殖疾病，特別是結(jié)腸直腸癌；自身免疫和炎性腸病(IBD)，特別是局限性回腸炎；結(jié)腸炎，特別是潰瘍性結(jié)腸炎；腸易激綜合征；感染性腸疾病，例如假膜性結(jié)腸炎，阿米巴病或腸結(jié)核；結(jié)腸息肉；憩室病；便秘；腸梗阻；吸收不良綜合征；直腸疾病和腹瀉。本發(fā)明包含使用siNA的組合物和方法，其中siNA包括但并不僅限于短干擾RNA (siNA)、雙鏈RNA (dsRNA)、微小RNAs (miRNAs)、antagomirs和能介導(dǎo)RNA干擾現(xiàn)象的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)分子。
[0029]本發(fā)明的方法包括對有需要的患者施用有效量的一種或多種本發(fā)明所述的SiNA來治療腸病癥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括治療劑siNA的直腸內(nèi)施用。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明與SiNA或相似的化學(xué)合成實(shí)體有關(guān)，這些實(shí)體被指定用于干擾細(xì)胞因子IL-12的p35或p40亞基mRNA表達(dá)并最終調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生成量。包含上文提到的siRNA和相關(guān)化合物的組合物和方法被計(jì)劃用于治療與IL-12過量表達(dá)有關(guān)的疾病，例如自身免疫疾病和炎性腸病(IBD)，特別是局限性回腸炎。
[0031]附圖簡沭
[0032]圖1本發(fā)明所包括的靶向IL_12p35和p40亞基的siRNA分子的寡核苷酸序列。圖中所示SEQ ID No涉及有義鏈(5’ - > 3’)；典型的是siRNA將被作為dsRNA來施用，因此將包括有義鏈和它的互補(bǔ)鏈。
[0033]圖2在體外系統(tǒng)中siRNA對IL_12p35亞基表達(dá)的作用。siRNA處理降低IL_12p35基因的轉(zhuǎn)錄水平。RNA由經(jīng)過不同時(shí)間siRNAs處理的SW480細(xì)胞制備而來。利用特異性引物通過RT-PCR來分析樣品。數(shù)據(jù)顯示的是不同的轉(zhuǎn)錄在以18S作為管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的平均表達(dá)水平。
[0034]圖3在體外系統(tǒng)中siRNA對IL_12p40亞基表達(dá)的作用。A:siRNA處理降低IL-12p40基因在人類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。RNA由SW480細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí)間的劑量為200nM的siRNA SEQ ID67和SEQ ID79的處理制備而來。這些數(shù)字顯示的是不同的轉(zhuǎn)錄在以18S作為管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的平均表達(dá)水平，以及siRNA干擾后標(biāo)準(zhǔn)化后的mRNA水平相對于對照組基因表達(dá)的平均百分?jǐn)?shù)和中間標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。B:siRNA處理降低IL_12p40基因在鼠科動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。RNA由C2C12細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí)間的劑量為IOOnM的siRNA SEQID86和SEQ ID87的處理制備而來。SEQ ID86同源于人類SEQ ID67，且靶向鼠類IL_12p40亞基。此外靶向鼠類IL-12p40亞基的SEQ ID87是鼠類中評分最高的siRNA，并且它不具有人類siRNA的同源二聚體。siNA分子SEQ ID86和SEQ ID87描述如下，具有2個(gè)胸腺嘧啶核苷酸3’突出端。數(shù)值代表的是siRNA干擾后用18S標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA水平相對于對照組基因表達(dá)的平均百分?jǐn)?shù)和中間標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
[0035]圖4siRNA處理降低GFP基因在小腸中的轉(zhuǎn)錄水平。從OCT中收集的組織利用顯微鏡方法來進(jìn)行分析，并利用photoshop軟件進(jìn)行測量。數(shù)據(jù)顯示了單劑量SiRNA的處理(小鼠2-3)和重復(fù)劑量siRNA的處理(小鼠4-5)。數(shù)據(jù)顯示了每只小鼠的25張典型圖片與未經(jīng)處理的小鼠對照組相比較后的表達(dá)水平。圖中還顯示了數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0036]圖5siRNA處理降低GFP基因在小腸中的轉(zhuǎn)錄水平。從RNA later中收集的組織通過RT-PCR進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示了單劑量siRNA的處理(小鼠2_3)和重復(fù)劑量的處理(小鼠4-5)。圖中還顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0037]圖6siRNA處理降低GFP基因在大腸中的轉(zhuǎn)錄水平。從OCT中收集的組織利用顯微鏡方法來進(jìn)行分析，并利用photoshop軟件進(jìn)行測量。數(shù)據(jù)顯示了單劑量SiRNA的處理(小鼠2-3)和重復(fù)劑量的處理(小鼠4-5)。數(shù)值顯示了每只小鼠的25張典型圖片與未經(jīng)處理的小鼠對照組相比較后的表達(dá)水平。圖中還顯示了數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0038]圖7siRNA處理降低GFP基因在大腸中的轉(zhuǎn)錄水平。從RNA later中收集的組織通過RT-PCR進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示了單劑量siRNA的處理(小鼠2_3)和重復(fù)劑量的處理(小鼠4-5)。圖中還顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0039]圖8從OCT媒介(medium)中收集的樣品的數(shù)據(jù)。
[0040]圖9從RNA later媒介中收集的樣品的數(shù)據(jù)。
[0041]發(fā)明詳沭
[0042]本發(fā)明涉及利用直腸內(nèi)施用RNAi技術(shù)來治療腸疾病的方法和組合物。本發(fā)明的組合物包括了調(diào)節(jié)與腸內(nèi)壁病癥有關(guān)的靶基因表達(dá)的短干擾核酸分子(siNA)。
[0043]本發(fā)明的方法包括對有需要的患者施用有效量的一種或多種本發(fā)明所述的siNA。
[0044]siRNA 的設(shè)計(jì)
[0045]根據(jù)本發(fā)明，例如當(dāng)siNA選擇性地降低或阻止一個(gè)基因的表達(dá)時(shí)，該基因被siNA “靶向”?；蛘撸?dāng)siNA在嚴(yán)格的條件下與基因的轉(zhuǎn)錄物雜交時(shí)，siNA靶向該基因。siNA在體外或體內(nèi)都具有能夠進(jìn)行測試其靶向基因的能力。
[0046]在1999年，Tuschl等解譯了 siRNAs的沉默作用，顯示出它們的效率是一個(gè)與二聚體的長度、3’末端突出端的長度以及這些突出端的序列有關(guān)的函數(shù)。
[0047]在靶向基因中選擇同源區(qū)域的正確性與沉默效應(yīng)的精確性具有很大的相關(guān)性。一個(gè)目標(biāo)基因序列的短片段(例如，長度為19-40個(gè)核苷酸)被選擇來作為本發(fā)明所述的siNA的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)siNA是siRNA。在這個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)基因序列的短片段是目標(biāo)基因mRNA片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從目標(biāo)基因mRNA中選擇序列片段作為siRNA分子候選者的標(biāo)準(zhǔn)包括:1)一個(gè)由從天然mRNA分子的5’或3’末端含有至少50-100個(gè)核苷酸的目標(biāo)基因mRNA得到的序列；2)—個(gè)由G/C含量在30%和70%之間，最優(yōu)為大約50%的目標(biāo)基因mRNA得到的序列；3)—個(gè)由不含有重復(fù)序列(例如，AAA, CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT)的目標(biāo)基因mRNA得到的序列；4) 一個(gè)由在mRNA中易接近的目標(biāo)基因mRNA得到的序列；和5)—個(gè)由對于該目標(biāo)基因唯一的目標(biāo)基因mRNA得到的序列。目標(biāo)基因mRNA的序列片段可以達(dá)到一種或幾種上述識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，siRNA的G/C含量低于60%并且/或者缺乏重復(fù)序列。
[0048]實(shí)際上，目標(biāo)基因在一個(gè)預(yù)測程序中作為核苷酸序列被提出。這個(gè)預(yù)測程序考慮了上文所描述的用于設(shè)計(jì)最佳寡核苷酸的所有變量。此程序掃描允許被siRNA靶定的區(qū)域中任意的mRNA核苷酸序列。此分析的輸出為可能的siRNA寡核苷酸的分?jǐn)?shù)。最高的得分被用于設(shè)計(jì)典型地以化學(xué)合成制備的雙鏈RNA寡核苷酸(盡管其它長度也有可能，但典型的長度為21bp)。我們計(jì)劃測試一些本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾。這些修飾是以提高dsRNA寡核苷酸的穩(wěn)定性或可用性為目的的。
[0049]寡核苷酸候選者能夠進(jìn)一步地根據(jù)種間序列的保守性進(jìn)行過濾，以促進(jìn)從動(dòng)物到人類臨床研究的轉(zhuǎn)變。
[0050]除與目標(biāo)區(qū)域完全互補(bǔ)的siNA之外，簡并的siNA序列可以被用于靶向同源區(qū)域。W02005/045037描述了靶向這樣的同源序列的siNA分子的設(shè)計(jì)，例如通過摻入不規(guī)范堿基對，比如錯(cuò)配和/或擺動(dòng)堿基對，以提供額外的目標(biāo)序列。例如在錯(cuò)配被確定的位置，不規(guī)范堿基對(如錯(cuò)配和/或擺動(dòng)堿基)能夠用于產(chǎn)生靶向多于一個(gè)基因序列的siNA分子。在一個(gè)非限制的例子中，不規(guī)范堿基對，如UU和CC堿基對，被用于生成具有靶向共享序列同源性的不同目標(biāo)序列能力的siNA分子。同樣地，利用本發(fā)明所述siNAs的一個(gè)優(yōu)勢是單個(gè)siNA能夠被設(shè)計(jì)為包含與在同源基因中保守的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸序列。通過這種方法，使用單個(gè)siNA，而不是使用多個(gè)siNA分子，就能夠抑制多于一種基因的表達(dá)，從而靶向不同的基因。
[0051]序列的同一性可以由在本領(lǐng)域中熟知的序列比較和比對運(yùn)算法則(見Gribskov和Devereux,《序列分析引物》，Stockton Press, 1991,以及其中引用的參考文獻(xiàn))，以及通過例如在BESTFIT軟件中用默認(rèn)參數(shù)執(zhí)行的計(jì)算核苷酸序列間百分比差異的Smith-Waterman運(yùn)算法則來計(jì)算(例如,Wisconsin大學(xué)遺傳計(jì)算小組)。優(yōu)選的是在siNA和目標(biāo)基因部分之間高于90%，95%,或99%的序列同一性。或者，siNA和天然RNA分子間的互補(bǔ)性可以通過雜交被功能性地定義，也可以通過它降低或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的能力來功能性地定義。siNA影響基因表達(dá)的能力能夠在體內(nèi)或體外以經(jīng)驗(yàn)來確定。
[0052]本發(fā)明中優(yōu)選的siNA分子是雙鏈結(jié)構(gòu)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子含有平頭末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈siNA分子含有突出的核苷酸(例如，1-5個(gè)核苷酸的突出端，優(yōu)選為2個(gè)核苷酸的突出端)。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，突出的核苷酸為3’突出端。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，突出的核苷酸為5’突出端。任何類型的核苷酸能夠成為突出端的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，突出的核苷酸是核糖核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突出的核苷酸是脫氧核糖核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突出的核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突出的核苷酸是修飾的或非經(jīng)典型核苷酸。這些突出的核苷酸可能含有非經(jīng)典型核苷酸間鍵(例如除去磷酸二酯鍵以外的其它鍵)。
[0053]siNA 二聚體的合成
[0054]siNA能夠通過本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法合成。RNA更優(yōu)選利用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)DNA/RNA合 成儀化學(xué)合成。另外，siRNA能夠通過商業(yè)的RNA寡聚物合成供應(yīng)商獲得，包括但不限于Proligo (漢堡，德國)，Dharmacon Research (Lafayette, CO,美國),Glen Research(Sterling, VA,美國),ChemGenes(Ashland, MA,美國)，Cruachem(Glasgow,英國)，Qiagen (德國)Ambion (美國)以及 Invitrogen (蘇格蘭)?；蛘?，本發(fā)明所述的siNA分子能夠通過含有在啟動(dòng)子的控制下的siNA反式互補(bǔ)序列的載體對細(xì)胞轉(zhuǎn)染來進(jìn)行表達(dá)。一旦被表達(dá)，siNA能夠通過本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)從細(xì)胞中提取出來。
[0055]當(dāng)對單鏈RNA分子進(jìn)行操作時(shí)，退火步驟是必要的。為了將RNA退火，濃度為50 μ M的各種RNA寡聚物溶液各30 μ I混合于IOOmM的乙酸鉀，30mM pH值為7.4的HEPES-K0H和2mM的乙酸鎂中。此溶液再在90°C培育I分鐘后，離心分離15秒，之后再在37°C培育I小時(shí)。
[0056]在siRNA是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)的實(shí)施方案中，siRNA分子的兩條鏈可以由一個(gè)連接體區(qū)域所連接(例如，核苷酸連接體或非核苷酸連接體)。
[0057]siNA的化學(xué)修飾
[0058]本發(fā)明所述的SiNA可能包含一個(gè)或多個(gè)被修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯鍵。在本領(lǐng)域中所熟知的化學(xué)修飾具有提高siNA穩(wěn)定性、可用性和/或細(xì)胞獲取的能力。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到可能摻入RNA分子中的其它類型的化學(xué)修飾(關(guān)于這些修飾類型的總述參見國際公布 W003/070744 和 W02005/045037)。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾能夠被用于提高的抗降解能力和吸收能力。這種修飾的例子包括核苷酸間的硫代磷酸酯鍵、2’ -O-甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈siRNA的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟基核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基(universal base) ”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向脫氧脫堿基殘基結(jié)合(通常見于GB2406568)。
[0060]在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾能夠增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性或提高靶向效率。修飾包括siRNA的兩條互補(bǔ)鏈間的化學(xué)交叉連接,siRNA—條鏈3’或5’末端的化學(xué)修飾,糖修飾,核堿修飾和/或主鏈修飾，以及2’ -氟基修飾的核糖核苷酸和2’ -脫氧核糖核苷酸(通常見于國際公布 W02004/029212)。
[0061]在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾能夠增強(qiáng)或降低目標(biāo)mRNA和/或互補(bǔ)siNA鏈中的互補(bǔ)核苷酸間的親和力(通常見于國際公布W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸能夠被2-硫代，5-炔基，5-甲基，或5-丙炔基嘧啶取代。另外，未修飾的嘌呤能夠被7-deza, 7-烷基，或7_鏈烯基嘌呤所取代。
[0062]在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)siNA是雙鏈siRNA時(shí)，3’-末端突出核苷酸被脫氧核糖核酸所替代(通常見于Elbashir et al.，2001)。
[0063]siRNA 二聚體的體外測試
[0064]為了檢測SiRNA干擾作用的特異性，采用了表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0065]在檢測IL_12p35和p40亞基的情形中，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是人類SW480細(xì)胞和鼠科動(dòng)物肌肉細(xì)胞C2C12。這些細(xì)胞經(jīng)過與相應(yīng)的siRNA 二聚體的溫育后，對p35和p40的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。為了在培養(yǎng)的細(xì)胞中將siRNA擊倒作用與特異性表現(xiàn)型聯(lián)系起來，有必要證明目標(biāo)蛋白質(zhì)的減少或至少證明目標(biāo)mRNA的減少。
[0066]目標(biāo)基因的mRNA水平量能夠通過實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)來測定。此外，蛋白質(zhì)水平能夠利用本領(lǐng)域中熟知的多種方法來確定，例如對不同目標(biāo)的特異性抗體的Western印跡分析法允許了對目標(biāo)蛋白質(zhì)的減少的直接監(jiān)視。
[0067]siRNA能通過本領(lǐng)域中任意熟知的轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入細(xì)胞中。單一的siRNA 二聚體轉(zhuǎn)染的是能夠被操作的，例如利用陽離子脂質(zhì)，如Lipofectamine2000試劑(Invitrogen),隨后再進(jìn)行在轉(zhuǎn)染后24，48和72小時(shí)的沉默效率的測定。
[0068]典型的轉(zhuǎn)染流程操作如下:在6孔平板的一個(gè)孔中，我們對鼠科動(dòng)物C2C12細(xì)胞使用最終濃度為IOOnM的siRNA，或者對人類SW480細(xì)胞使用最終濃度為200nM的siRNA來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000試劑流程的指導(dǎo),在轉(zhuǎn)染的前一天,我們在每個(gè)孔中的3ml適宜的含有DMEM、10%血清、抗生素和谷氨酰胺的培養(yǎng)基中接種2_4xl05個(gè)細(xì)胞，并在標(biāo)準(zhǔn)的生長條件(37°C和5%的CO2)下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞必須匯合30-50%ο我們在250 μ I的DMEM中稀釋12.5 μ I濃度為20 μ M的siRNA 二聚體(相當(dāng)于最終濃度為IOOnM)或25 μ I濃度為20 μ M的siRNA 二聚體(相當(dāng)于最終濃度為200nM)，并混勻。6 μ I的Lipofectamine2000也被稀釋于250 μ I的DMEM中，并混勻。經(jīng)過室溫下5分鐘的培養(yǎng)后，在20分鐘的室溫培養(yǎng)過程中，使稀釋后的低聚物(siRNA 二聚體)和稀釋后的Lipofectamine結(jié)合以形成復(fù)合體。然后，我們將此復(fù)合體滴加到在2ml新鮮的培養(yǎng)在低抗生素含量的培養(yǎng)基中的細(xì)胞上，并通過前后搖動(dòng)培養(yǎng)皿輕輕地使之混勻，以確保轉(zhuǎn)染復(fù)合物的均勻分布。我們在標(biāo)準(zhǔn)的生長條件下培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染的后一天，去除這些復(fù)合物并添加新鮮和完全的培養(yǎng)基。為了監(jiān)視基因沉默，在轉(zhuǎn)染后24，48和72小時(shí)收集細(xì)胞。
[0069]轉(zhuǎn)染的效率可能依賴于細(xì)胞類型，但也可能依賴于傳代數(shù)和細(xì)胞的匯合。形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的時(shí)間和方式(例如倒置混合法對比旋渦混合法)也至關(guān)重要。低轉(zhuǎn)染效率是沉默失敗最為常見的原因。良好的轉(zhuǎn)染是非平凡的問題，需要對每一個(gè)新的待用的細(xì)胞品系進(jìn)行仔細(xì)地檢查。轉(zhuǎn)染效率可以利用轉(zhuǎn)染報(bào)道基因，例如CMV-驅(qū)動(dòng)的EGFP表達(dá)質(zhì)粒(例如來自Clontech)或B-Gal表達(dá)質(zhì)粒,來測定，并在下一天通過相差和/或突光顯微鏡方法來估算。
[0070]依賴于目標(biāo)蛋白質(zhì)的充足性和壽命(或周轉(zhuǎn)更新)，在1-3天后或更晚時(shí)，擊倒表現(xiàn)型可能會(huì)變得明顯起來。在沒有觀察到表現(xiàn)型的情形中，可以通過免疫熒光檢驗(yàn)法或Western印跡法觀察到蛋白質(zhì)的缺失。
[0071]轉(zhuǎn)染后，從細(xì)胞中提取的總RNA片段經(jīng)過脫氧核糖核酸酶I的預(yù)處理，并通過隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用至少覆蓋一個(gè)外顯子-外顯子連接區(qū)的特異性引物對擴(kuò)增的PCR被用作擴(kuò)增前mRNA的對照。也需要非靶向的mRNA的RT-PCR作為對照。mRNA有效的缺失和無法覺察的目標(biāo)蛋白質(zhì)的減少可以顯示出在細(xì)胞中可能存在大儲(chǔ)量的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)?；蛘撸琑T-PCR擴(kuò)增能夠更精確地測定mRNA減少和消失。RT-PCR能夠最明確地，最敏感地和最高重復(fù)率地定量測定模板初始數(shù)量。在光循環(huán)儀器中，RT-PCR在每個(gè)PCR循環(huán)中監(jiān)控在反應(yīng)過程中發(fā)射的、作為擴(kuò)增子生成的指示劑的熒光。這個(gè)信號與在反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的量成正比例增加。通過在每個(gè)循環(huán)中記錄熒光發(fā)射的量，有可能監(jiān)控在指數(shù)生長期中PCR反應(yīng)，其中PCR產(chǎn)物的量的第一次顯著增加與目標(biāo)模板的初始量相關(guān)。
[0072]為了校驗(yàn)差異表達(dá)的IL-p35和p40基因在細(xì)胞培養(yǎng)物中的干擾模式，實(shí)施了定量RT-PCR。在定量RT-PCR反應(yīng)中，大約500ng的總RNA被用于進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后進(jìn)行由反應(yīng)中每個(gè)基因的特異性引物引導(dǎo)的PCR擴(kuò)增。PCR條件包括一個(gè)初始的在95°C反應(yīng)30秒的步驟，以及隨之其后周期性重 復(fù)40次在95°C反應(yīng)5秒，62°C反應(yīng)10秒和72V反應(yīng)15秒。ISSmRNA的量化被用作管家基因，并作為對照來標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。在樣品中，當(dāng)被選定內(nèi)生/內(nèi)在對照基因的表達(dá)與總RNA的比例更充足并保持恒定時(shí)，相關(guān)基因表達(dá)的比較表現(xiàn)最佳。通過利用無變化的內(nèi)生對照作為活性參考，mRNA目標(biāo)的量化能夠被用于標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)反應(yīng)中總RNA加入量的差異。根據(jù)制備商提供的流程，由光循環(huán)儀獲得的擴(kuò)增曲線與對照試劑盒DNA結(jié)合起來進(jìn)行分析,其中對照試劑盒DNA祀向體外轉(zhuǎn)錄beta珠蛋白DNA模板。為了估計(jì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的特異性，進(jìn)行了解鏈曲線分析。由此產(chǎn)生的解鏈曲線允許了引物二聚體和特異性PCR產(chǎn)物間的辨別。
[0073]siNA的直腸內(nèi)給藥
[0074]直腸內(nèi)siNA遞送的研究是在GFP C57BL/6-TG (ACTB-EGFP)小鼠中進(jìn)行的。此轉(zhuǎn)基因小鼠品系是從“Jackson實(shí)驗(yàn)室”購買而來的。之所以使用轉(zhuǎn)基因小鼠是因?yàn)榇宿D(zhuǎn)基因的純合小鼠在出生后兩周內(nèi)就會(huì)死亡。此轉(zhuǎn)基因小鼠品系含有一個(gè)在雞的beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子的控制下“增強(qiáng)的” GFP (EGFP)cDNA，使得除了紅血球和毛發(fā)之外的所有組織都在激發(fā)光下呈現(xiàn)綠色。此品系產(chǎn)生自C57BL/6小鼠。此品系編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的cDNA與雞的beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子鄰接。此構(gòu)建體還包括牛的珠蛋白多腺苷酸化信號。含有EcoRl位點(diǎn)的PCR弓I物被用于將擴(kuò)增的EGFPcDNA引入到pCAGGS表達(dá)載體中，此載體含有雞的beta肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子，beta肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子和牛的珠蛋白多腺苷酸化信號。利用Bam-Hl和Sall酶切，并凝膠純化此含有啟動(dòng)子和編碼序列的完整的插入片段。
[0075]用于小鼠腸內(nèi)注射的siRNA 二聚體是從Dharmacon購買而來的。Dharmacon研究公司(Lafayette, CO)已經(jīng)研制出能在體內(nèi)用作治療劑的新一代被修飾的siRNA,并命名為siSTABLEv2。Dharmacon的siSTABLEv2siRNA與未被修飾的siRNA相比，已經(jīng)顯示出在血清中更強(qiáng)的穩(wěn)定性。常規(guī)的siRNA在含有血清的環(huán)境中通常在幾分鐘內(nèi)就會(huì)降解，使SiRNA在體內(nèi)的使用產(chǎn)生問題。正如Dharmacon的網(wǎng)頁(http://www.dharmacon.com/does/siSTABLE%20v2%20Flier.pdf)所描述的，此siSTABLEv2的修飾巨大的提高了 siRNA在血清中的穩(wěn)定性。
[0076]用于負(fù)調(diào)節(jié)EGFP mRNA表達(dá)的siRNA靶向EGFP mRNA中的下列序列:5’ -GGC UAC⑶C CAG GAG CGC ACC-3’ (SEQ ID N088)。siRNA 二聚體的有義鏈為 5’-P GGC UAC ⑶CCAG GAG CGC ACC-3’ (SEQ ID N089)，反義鏈為 5’-P U GCG CUC CUG GAC GUA GCC UU-3’(SEQ ID N090)。這個(gè)序列是由Dharmacon作為合成前對照siRNA綠色熒光蛋白二聚體提供的。
[0077]在直腸內(nèi)遞送實(shí)驗(yàn)中使用了 C57BL/6-TG(ACTB-EGFP)小鼠(雄性，8周)。直到實(shí)驗(yàn)的前一天，這些動(dòng)物生活在能自由獲取食物和水源的籠子中。為了直腸內(nèi)治療的沉默，小鼠在接受處理的前一天禁食。典型的給藥方式是小體積(120μυ的直腸內(nèi)注射。對照組小鼠僅經(jīng)過賦形劑處理。所有的動(dòng)物都在第一次注射的兩天后被脫頸椎處死。SiRNA在小鼠中的應(yīng)用流程如下:在每次實(shí)驗(yàn)施用中，60 μ I的SiRNA 二聚體與60 μ I的NaCl (1.8%w/v)預(yù)混和，以達(dá)到生理水平。所有的動(dòng)物都在第一次注射的兩天后被處死。
[0078]下表顯示了使用的實(shí)驗(yàn)條件。每個(gè)條件都被重復(fù)分析過兩次。小鼠2和3是經(jīng)過與GFP相比單次，劑量為250 μ g (19nanomols)的siRNA的直腸內(nèi)處理的。而小鼠4和5是經(jīng)過連續(xù)兩天內(nèi)兩次，每次劑量為125 μ g的siRNA處理的。
小鼠序+I?-__立腸內(nèi)治療處Jl_
1賦形剤對照劑呈_
2__中-次，劑Iti為 250 μ g 的 siRNA
[_]3__中次，剤M為 250 μ g 的 siRNA
4兩次，劑M為甸24小時(shí)125 μ g的
__SiRNA_
5兩次，MMH 24小時(shí)125 P g的
__siRNA_
[0080]表:直腸內(nèi)siRNA遞送實(shí)驗(yàn)條件的示意性分布。表中顯示了 siRNA劑量。
[0081]樣品組織是通過兩種方法收集和分析的:一種是在OCT媒介中，另一種是在RNAlater (Ambion)中。直到數(shù)據(jù)處理前，OCT塊被儲(chǔ)存于_80°C。OCT塊在_20°C下被恒冷切片機(jī)(Leica CM1850)切割成12 μ m的薄片。收集到的薄片在與數(shù)碼相機(jī)相(DP70)連接的突光顯微鏡(Olympus BX51)中，通過488nm濾光器進(jìn)行分析。為了進(jìn)行樣品間的比較,對所有樣品的感光條件(IS0200)、分辨率圖像尺寸(2040x1536)和曝光時(shí)間都作了相同的設(shè)定。利用Adobe Photoshop (版本8.0)軟件以GFP表達(dá)為指數(shù)進(jìn)行綠色熒光的測量。通過這種方法對每個(gè)被分析的組織收集了 25個(gè)不同的數(shù)據(jù)。從RNA later中提取的組織儲(chǔ)存于-20°C。RNA later在提取RNA之前已經(jīng)被去除了。RNA是根據(jù)制備商提供的流程，利用Trizol試劑(Invitrogen)提取而來的。在通過上述的RT-PCR測量GFP表達(dá)前,進(jìn)行了脫氧核糖核酸酶的處理。
[0082]藥物制劑和給藥途徑
[0083]本發(fā)明可以包括一個(gè)或多個(gè)種類的SiNA分子的同時(shí)施用。這些種類可以被挑選出來去靶向一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因。
[0084]在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明所述的治療方法中施用了單一類型的siNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中的一個(gè)siNA與本發(fā)明中的另一個(gè)siNA，以及/或者一個(gè)或多個(gè)對腸內(nèi)壁疾病狀態(tài)具有治療、預(yù)防或控制作用的非siNA治療劑聯(lián)合施用。短語“聯(lián)合”并不僅限于多種治療劑在精確的同一時(shí)刻施用，而是指本發(fā)明所述的siNA和其他的試劑按照某種順序，在一定的時(shí)間間隔內(nèi)施用于患者，以使聯(lián)合使用的療效高于用其他方法施用這些試劑的療效。例如，每個(gè)治療劑可以同時(shí)或者按照任意的順序在任意的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行順序施用。但是，如果不同時(shí)施用，它們的施用應(yīng)該在時(shí)間上充分的接近，以提供預(yù)期的治療效果。每種治療劑都能夠以任意的適當(dāng)形式和合適的途徑單獨(dú)施用。
[0085]本發(fā)明中的siNA可以通過任何本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)配制為藥物組合瓦(例子參 JAL , Alfonso, G.et al.，1995，in:The Science and Practice of Pharmacy, MackPublishing, Easton PA, 19th ed.)。在本發(fā)明所述方法應(yīng)用中含有一個(gè)或多個(gè)siNA的制劑可以具有多種形式，并可能依賴于不同的患者特異性因子(例如，患者的紊亂類型和嚴(yán)重性、施用的siNA的類型、年齡、體重、反應(yīng)和過去的病史)，制劑中siNA的數(shù)量和類型，組合物的形式(例如，液態(tài)、半液 態(tài)或固態(tài))，治療方案(例如，治療劑是隨著時(shí)間緩慢輸注給藥；還是單一推注，一天一次，一天多次或幾天一次給藥)，以及/或者給藥途徑(例如，局部、口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)或舌下等途徑)。
[0086]本發(fā)明所述的SiNA分子以及其制劑或組合物可以直接或局部的施用，如本領(lǐng)域所公知。例如，siNA分子可以包括遞送媒介物，包括脂質(zhì)體，用于施用于受試者。載體和稀釋物以及它們的鹽能夠以制藥學(xué)可接受的制劑形式存在。核酸分子能夠通過不同的為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法在細(xì)胞中施用，這些方法包括，但不僅限于，脂質(zhì)體的包囊作用，離子電滲療法或與其他媒介物的結(jié)合，如與能生物分解的聚合體、水凝膠、環(huán)糊精聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLGA微球體、能生物分解的毫微膠囊、以及生物粘合微球體的結(jié)合，或者通過proteinaceous載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的核酸分子也能夠與聚乙烯亞胺及其衍生物配制或復(fù)合，例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PE1-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PE1-PEG-triGAL)衍生物復(fù)合。
[0087]本發(fā)明所述的siNA分子可以與膜破壞劑和/或陽離子脂質(zhì)或協(xié)助脂質(zhì)分子復(fù)合。[0088]可以在本發(fā)明中使用的遞送系統(tǒng)包括，比如說，含水或不含水凝膠，膏狀物，多種乳狀液，微乳狀液，脂質(zhì)體，油膏，含水或不含水的溶液，洗劑，氣溶膠，碳?xì)浠衔锘|(zhì)及粉末，而且還包括賦形劑，例如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和親水聚合體(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一個(gè)實(shí)施方案中，制藥學(xué)上能接受的載體是脂質(zhì)體或透皮增強(qiáng)劑。
[0089]本發(fā)明所述的藥物制劑的形式是適合施用的，例如，系統(tǒng)或局部的施用，進(jìn)入細(xì)胞或受試者，包括如人。適合的形式部分地依賴于用途和進(jìn)入的途徑，例如口服、經(jīng)皮膚或注射。本領(lǐng)域已知的其他因素還包括一些需要考慮的事項(xiàng)，例如毒性以及阻止此組合物或制劑發(fā)揮作用的形式。
[0090]本發(fā)明還包括制備用于儲(chǔ)存或施用的組合物，此組合物包括在制藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中藥物有效量的所需化合物。用于治療應(yīng)用的可接受的載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域已被熟知。例如，防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑都能夠被提供。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。另外，還能夠使用抗氧化劑和懸浮劑。
[0091]藥學(xué)有效劑量是指阻止、抑制發(fā)生、或治療(在某種程度上減輕癥狀，最好消除所有的癥狀)疾病狀態(tài)所需要的劑量。藥學(xué)有效劑量依賴于疾病的種類，所用的組合物，給藥途徑，被治療的哺乳動(dòng)物的種類，考慮的特別的哺乳動(dòng)物的生理特征，協(xié)作的藥物治療，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員將會(huì)識(shí)別的其他因素。
[0092]本發(fā)明所述的制劑能夠以包含常規(guī)無毒性藥學(xué)可接受載體、佐劑和/或媒介物的劑量單位形式進(jìn)行給藥。制劑能夠制成適合于口服的形式，例如片劑、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳狀液、硬的或軟的膠囊、或者糖漿或酏劑。預(yù)期為口服的組合物能夠根據(jù)制藥領(lǐng)域中任何已知的方法來制備，并且此組合物還能夠含有一個(gè)或多個(gè)甜味劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑以使得制出的藥物美觀且美味。片劑含有有效成分和無毒的藥學(xué)可接受賦形劑的混合物，此賦形劑適合于片劑的制備。
[0093]這些賦形劑可為，例如惰性稀釋物；如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒和崩解劑，如玉米淀粉或褐 藻酸；粘合劑，如淀粉、凝膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可為未包被的或利用已知技術(shù)進(jìn)行包衣。在一些情形中，利用已知技術(shù)制備的這種包衣能夠延遲藥片在胃腸內(nèi)的崩解和吸收，從而提供更長時(shí)間的持續(xù)作用。例如，能夠使用時(shí)間延遲物質(zhì)，如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
[0094]用于口服的制劑也能夠以硬明膠膠囊的形式出現(xiàn)，在此膠囊中，活性成分與惰性固態(tài)稀釋劑混合，例如與碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合?；蛘?，用于口服的制劑也能夠以軟明膠膠囊的形式出現(xiàn)，在此膠囊中，活性成分與水性或油性的媒介物混合，例如與花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
[0095]水性懸浮液是含有活性材料和適合于制備水性懸浮液的賦形劑的混合物。這種賦形劑為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、氫丙烷基-甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠和阿拉伯樹膠；為天然產(chǎn)生的磷脂的分散或潤濕劑，例如卵磷脂，或烯化氧和脂肪酸的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯硬脂酸酯，再或者為氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，如十七碳乙烯氧基鯨臘醇(heptadecaethyleneoxycetanol),又或者為氧化乙烯和源自脂肪酸的偏酯類以及己糖醇的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，還或者為氧化乙烯和源自脂肪酸的偏酯類以及己糖醇酐的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。水性懸浮液還能含有一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑，以及一種或多種以蔗糖或糖精為例的甜味劑。
[0096]油性懸浮液能夠通過在以花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油為例的植物油中懸浮有效成分來配制，又或者懸浮于礦物油中，如液體石蠟。油性懸浮液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或十六烷醇。還能加入甜味劑和調(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這些組合物還能夠通過添加例如抗壞血酸的抗氧化劑被保存。
[0097]適合于通過添加水而制備水性懸浮液的可分散性粉末和顆粒是活性成分與分散劑或潤濕劑，懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合物。適合的分散劑、潤濕劑或懸浮劑已于上文中舉例說明了。另外的賦形劑，如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑也能被添加。
[0098]本發(fā)明所述的藥物組合物也能呈現(xiàn)為水包油型乳狀液的形式。其中油相可為植物油或礦物油或它們的混合物。適合的乳化劑可為例如阿拉伯樹膠或黃芪膠的天然形成的樹月旨，例如大豆、卵磷脂，源自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯的天然形成的磷脂，例如山梨聚糖單油酸鹽的酐，以及例如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸鹽的上述偏酯和氧化乙烯的濃縮產(chǎn)物。此乳化劑也能含有甜味劑和調(diào)味劑。
[0099]糖漿和酏劑能夠利用甜味劑配制，如丙三醇、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。此制劑還能含有緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑和著色劑。此藥物組合物可為無菌可注射水性或油性懸浮液形式。
[0100]此懸浮液能夠根據(jù)已知技術(shù)利用上述適合的分散劑或潤濕劑以及懸浮劑來制備。
[0101]無菌可注射制劑也能為在無毒的parentally可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液或懸浮液。在這些被使用的可接受的媒介物和溶劑中包括水、Ringer's溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌固體油也可作為溶劑或懸浮媒介來常規(guī)施用。為達(dá)到這個(gè)目的，任何無刺激性的固體油都能夠被施用，例如人工合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸，如油酸，也用在注射劑的配制中。
[0102]本發(fā)明所述的核酸分子能以栓劑的形式施用，例如直腸給藥。這種組合物能夠通過混合藥物與適合的無刺激的賦形劑制備而成。此種賦形劑在平常的溫度下為固態(tài)，但在直腸溫度下為液態(tài)，從而在直腸中融化并釋放藥物。這種材料包括可可油和聚乙二醇。
[0103]本發(fā)明所述的核酸分子能夠在無菌媒介中腸胃外給藥。依賴于媒介物和使用濃度，這種藥物能懸浮或溶解于該媒介物中。有利地，例如局部麻醉劑的佐劑、防腐劑和緩沖劑能夠被溶于媒介物中。
[0104]對除人類以外的動(dòng)物給藥時(shí)，此組合物也能被加入到動(dòng)物的飼料和飲用水中?？梢员憷氖桥渲苿?dòng)物飼料和飲用水組合物，使得動(dòng)物就能夠與它們的飲食一起獲得治療適宜量的組合物。將組合物制成能夠添加在飼料和飲用水中的預(yù)混合物也是一種很方便的方法。本發(fā)明所述的核酸分子也能夠與其他治療化合物聯(lián)合起來對某個(gè)個(gè)體用藥，從而提高整體治療效果。利用多種化合物處理適應(yīng)癥能夠在降低副作用的同時(shí)提高有益作用。
[0105]或者,本發(fā)明所述的某些siNA分子能在細(xì)胞內(nèi)從真核的啟動(dòng)子表達(dá)。具有表達(dá)siNA分子能力的重組載體能夠被遞送并持久的保存于目標(biāo)細(xì)胞中。或者，載體能夠被用于瞬間表達(dá)核酸分子。這樣的載體能夠根據(jù)需要重復(fù)施用。siNA分子一經(jīng)表達(dá)就會(huì)與目標(biāo)mRNA相互作用并引起RNAi反應(yīng)。表達(dá)siNA分子的載體的傳遞是系統(tǒng)性的，例如，通過靜脈或肌內(nèi)給藥，通過對從受試者移植出來的目標(biāo)細(xì)胞給藥、接著再引入該受試者中，或者通過其它任何允許導(dǎo)入預(yù)期的目標(biāo)細(xì)胞的方法。
[0106]結(jié)果
[0107]實(shí)施例1.siNA的設(shè)計(jì)
[0108]對應(yīng)于IL_12p35 (白細(xì)胞介素12A，天然殺傷細(xì)胞刺激因子1，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞成熟因子1，ρ35)和p40 (白細(xì)胞介素12B，天然殺傷細(xì)胞刺激因子2，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞成熟因子2，p40)亞基的GenBank登記號分別為NM_000882和NM_002187。
[0109]在上述的有專利權(quán)的預(yù)測程序中導(dǎo)入了對應(yīng)的mRNA核苷酸序列，并且獲得了針對目標(biāo)IL-12p35和p40亞基的siNA分子。此分析的輸出為可能的siNA寡核苷酸的分?jǐn)?shù)，最高分?jǐn)?shù)被用于設(shè)計(jì)通常由化學(xué)合成的雙鏈RNA寡核苷酸(典型的長度為19個(gè)堿基)。
[0110]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的siNA組合物是圖1中SEQ ID NOs:1_81的任意一個(gè)；典型的是以有義鏈和反義鏈的二聚體的形式給藥。本發(fā)明也包括含有40或更少個(gè)核苷酸的siNA并包含SEQ ID NOs:1-81的任何一個(gè)的核苷酸序列。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，siNA的長度為21-30個(gè)核苷酸，并且包括圖1中SEQ ID NOs:1_81的任意一個(gè)。下文所描述的實(shí)驗(yàn)中用到的全部siNA分子被設(shè)計(jì)為含有2個(gè)胸苷核苷酸3’突出端。
[0111]實(shí)施例2.1L-12P35的體外測定
[0112]為了確定IL_12p35目標(biāo)基因的抑制作用，在細(xì)胞培養(yǎng)物中分析了圖1中的一組siRNA。具有最佳特性的siRNA被選定進(jìn)行檢驗(yàn)，并被應(yīng)用于適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物，例如SW480。依據(jù)制備商的流程指導(dǎo)利用RT-PCR分析了 siRNA對于目標(biāo)基因的作用。以18S作為管家基因?qū)蚰繕?biāo)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。圖2包括被檢驗(yàn)的一些不同的siRNA以及它們能干擾目標(biāo)基因的不同功效。這些結(jié)果對應(yīng)于在表達(dá)P35的SW480細(xì)胞中與圖1的SEQ ID8和SEQ ID17。這些數(shù)值代表的是siRNA干擾后標(biāo)準(zhǔn)化后的mRNA水平相對于對照組基因表達(dá)的平均百分?jǐn)?shù)和 中間標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。在與對照細(xì)胞相比的SW480中，siRNA處理后P35轉(zhuǎn)錄水平隨著SEQ ID8和SEQ ID17的siRNA的加入而急劇下降?；虮磉_(dá)的降低依賴于siRNA沉默作用的效率。事實(shí)上，與對照組相比，siRNASEQ ID8的處理經(jīng)過24小時(shí)會(huì)將P35的基因表達(dá)降低為56%。
[0113]實(shí)施例3.1L_12p40的體外測定
[0114]為了確定IL_12p40目標(biāo)基因的抑制作用，分析了圖1中含有的一組siRNA。由已描述方法設(shè)計(jì)的具有最佳特性的siRNA在人類和鼠類細(xì)胞中被進(jìn)行檢驗(yàn)。利用RT-PCR分析P40的轉(zhuǎn)錄水平，并以18S作為管家基因?qū)ζ溥M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這些結(jié)果對應(yīng)于在表達(dá)p40的SW480細(xì)胞中的SEQ ID67和SEQ ID79 (圖3A);和在表達(dá)p40的C2C12細(xì)胞中的SEQ ID86和SEQ ID87 (圖3B)。siNA分子SEQ ID86和SEQ ID87如圖所描述，含有2個(gè)胸苷核苷酸3關(guān)出?而。
[0115]在SW480中，經(jīng)用對應(yīng)于SEQ ID67的siRNA處理后p40轉(zhuǎn)錄水平與對照細(xì)胞相比急劇下降可達(dá)到65%。在C2C12細(xì)胞中，與對照組相比，經(jīng)對應(yīng)于SEQ ID86的siRNA處理48小時(shí)將使基因表達(dá)降低為61%。值得注意的是，SEQ ID67和SEQ ID86分別對應(yīng)于人類和鼠類IL-12p40基因的同源區(qū)域。
[0116]圖2和圖3實(shí)驗(yàn)的總結(jié)被示于下表中:
【權(quán)利要求】
1.引起RNA干擾的化合物在制備用于治療腸紊亂的藥物中的應(yīng)用，其中所述化合物是直腸內(nèi)給藥于患者的。
2.靶向IL-12的siNA在制備用于治療腸紊亂的藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述腸紊亂為炎性腸病(IBD)。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述IBD為局限性回腸炎。
5.權(quán)利要求2到3的應(yīng)用，其中所述siNA選自SEQID NOl到SEQ ID N085。
6.一種靶向白細(xì)胞介素12的RNAi化合物，其包含選自SEQ ID NOl到SEQ ID N085的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中所述RNAi為dsRNA,siRNA或shRNA。
8.權(quán)利要求6的化合物，其靶向白細(xì)胞介素12的35kDa亞基(IL12_p35)，并且包含選自SEQ ID NOl到SEQ ID N033的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求6的化合物，其靶向白細(xì)胞介素12的40kDa亞基(IL12_p40)，并且包含選自SEQ ID N034到SEQ ID N085的核苷酸序列。
10.一種藥物組合物，包含一種或多種權(quán)利要求6所述的siNA。
11.權(quán)利要求10的組合物，其被配制用于直腸內(nèi)給藥。
12.—種治療腸紊亂的藥物組合物，其包含引起RNA干擾的化合物，被配制用于直腸內(nèi)給藥。.
13.權(quán)利要求6到9中任一項(xiàng)的化合物在制備用于治療與IL12-p40和/或IL12_p35相關(guān)的疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物抑制IL12-p40和/或IL12-p35的表達(dá)。
14.權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述疾病為自身免疫紊亂或炎性腸病(IBD)。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中所述紊亂是多發(fā)性硬化、糖尿病或局限性回腸炎。
【文檔編號】A61K31/00GK103432592SQ201310314024
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2005年3月14日
【發(fā)明者】伊雷妮·加斯孔, 安娜·I·希門尼斯, 瑪麗亞·康塞普西翁·希門尼斯, 吉塞·P·羅曼, 安吉拉·塞斯托 申請人:西倫蒂斯私人股份公司