專利名稱：一種單核細胞抗體在治療炎癥相關(guān)抑郁癥中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及Ly6c單克隆抗體在治療中樞炎癥誘導的抑郁癥方面的應用。
背景技術(shù)：
抑郁癥是一種情緒心理障礙綜合癥，其病因復雜，已經(jīng)成為全球第四大疾病，造成了嚴重的社會和經(jīng)濟負擔。目前臨床上抑郁癥的一線治療藥物主要為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)。新一代的 SSRIs 有著較好的安全性和耐受性，然而也存在著起效慢以及對部分人群無效的缺點。臨床上對許多重度抑郁癥患者仍缺乏有效的藥物治療策略，這也對深入研究抑郁癥的發(fā)病機理及開發(fā)新型的治療藥物提出了迫切的需求。近年來，免疫失調(diào)在抑郁癥發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注。臨床上，抑郁癥常常與其它多種炎癥性疾病共存，如腫瘤、結(jié)腸炎、心血管疾病、HIV感染、腦外傷、腦膜炎等。同時，動物模型及臨床病人中均可觀察到機體中樞和血液中炎癥反應的明顯激活，并且藥物治療及生活方式干預的效果往往與炎癥反應的程度密切相關(guān)。由此可見，調(diào)控炎癥/免疫反應是預防和治療抑郁癥的有效途徑。Ly6chi單核細胞又稱為促炎性單核細胞，是一種參與炎癥/免疫調(diào)節(jié)的單核細胞亞群。研究表明，Ly6chi單核細胞在感染、腫瘤及自身免疫性疾病中均發(fā)揮著重要的作用。干預Ly6chi單核細胞活化或趨化環(huán)節(jié)有可能成為治療炎癥性疾病的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種炎癥性抑郁癥治療的新途徑，即可通過Ly6c抗體來選擇性干預Ly6chi單核細胞 介導的神經(jīng)炎癥反應從而達到改善抑郁樣行為的藥效。首先我們證實了在側(cè)腦室注射脂多糖(LPS)誘導的小鼠抑郁模型中，Ly6chi單核細胞可以從血液測向中樞炎癥部分趨化浸潤，然后，我們通過特異性地富集血液中的Ly6chi單核細胞證實其可以加重抑郁樣行為；最后，我們通過腹腔注射Ly6c抗體特異性地干預Ly6chi單核細胞的活性，從行為學指標來證明Ly6c抗體在治療炎癥相關(guān)抑郁癥治療方面的新用途。


圖1:側(cè)腦室注射LPS誘導小鼠抑郁樣行為。A，小鼠強迫游泳實驗中的不動時間；B，小鼠的糖水偏好指數(shù)。**，存在顯著性差異。圖2 =FITC標記的Ly6chi單核細胞向中樞浸潤。圖3:選擇性富集Ly6chi單核細胞加重抑郁樣行為。A，血液中Ly6chi單核細胞的流式細胞術(shù)分析；B，小鼠強迫游泳實驗中的不動時間。圖4:Ly6c抗體可以改善小鼠抑郁樣行為。
具體實施例方式實施例1.神經(jīng)炎癥誘導的小鼠抑郁癥模型的建立及行為學分析實驗材料:C57BL/6小鼠，SPF級別，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物有限公司。實驗方法:1.側(cè)腦室LPS注射:小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，小心并正確固定于小鼠立體定位儀上。頭部皮膚消毒后，小心暴露出頡骨，以前鹵點(bregma)為零點定位，按小鼠腦立體定位坐標(L:1.0mm,P:0.5mm,DV:2.5mm)找到側(cè)腦室的頭骨表面位置。模型組動物于側(cè)腦室注射LPS (3 μ g/3 μ L生理鹽水)誘發(fā)急性腦部炎癥，對照組于側(cè)腦室注射等體積生理鹽水。注射結(jié)束后原位停留3 4分鐘后將微量注射器針端緩慢移出，防止有液體溢出。實驗過程中應注意觀察小鼠的體溫，保持手術(shù)器械和操作步驟的清潔，防止感染。2.強迫游泳實驗:將小鼠小心放入高30cm，直徑24cm的玻璃燒杯(杯中水深約12cm)中的水面，水溫25±4°C。采用攝像機錄像記錄小鼠的活動狀態(tài)，實驗過程持續(xù)6分鐘。實驗過后，由兩個實驗人員在 單盲情況下進行不動時間的計算，其不動狀態(tài)的評判標準為小鼠停止掙扎或顯漂浮狀態(tài)，四肢不動狀態(tài)或僅有很小的四肢運動使頭部懸浮于水面。不動時間定義為后4分鐘的不動時間。不同小鼠間應將燒杯中換入新水。3.糖水偏好實驗:小鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝食，預適應糖水(I %蔗糖)或正常飲水(分別置于IOOmL水瓶中左右放置)2天。側(cè)腦室給予LPS造模后，單獨飼養(yǎng)，觀察并記錄24h內(nèi)小鼠對于糖水和正常水的分別攝入量。糖水偏好指數(shù)=糖水消耗量/(糖水消耗量+正常飲水消耗量)X 100%實施例2.Ly6chi單核細胞特異性的FITC標記實驗材料:FITC-微球(FITC-dyed(YG),2.5 % [wt/vol])購于美國 Polyscience公司，clodronate脂質(zhì)體購于美國FormuMax公司。實驗方法:C57BL/6小鼠尾靜脈注射200 μ L clodronate脂質(zhì)體，20hr后尾靜脈注射250 μ LFITC-微球，通過細胞吞噬作用將Ly6chi單核細胞選擇性標記。24hr后進行側(cè)腦室LPS注射誘導抑郁癥模型。實施例3.Ly6chi單核細胞的中樞浸潤分析實驗材料:流式相關(guān)抗體均購自美國biolegend公司，Percoll淋巴細胞分離液購自GE公司，流式細胞儀為BD FACSCalibur，流式細胞數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件分析。實驗方法:1.腦部單核細胞的分離:小鼠深度麻醉后，經(jīng)升主動快速灌注冰PBS (4°C )灌注200mL左右移除血液，直到肝臟發(fā)白，完成灌注。小心分離并取出腦組織，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中。每個腦組織加入6mL冰PBS進行勻漿，勻漿液與100% Percoll溶液制成含30% Percoll的細胞懸液(IOmL),小心滴加于2mL70% Percoll溶液上，800g, 18°C條件下離心30min后小心吸出30%與70% Percoll界面間的渾濁帶即為淋巴細胞群落。用PBS洗滌兩次后制成100 μ L細胞懸液進行流式抗體染色實驗。2.流式細胞術(shù):向細胞懸液中加入ant1-⑶16/32抗體，冰浴避光孵育15min后加入流式抗體:ant1-Ly6c-PE，anti_CDllb_APC，冰浴避光孵育30min后用冰PBS洗滌3次，1%多聚甲醛固定后上機檢測。實施例4.Ly6chi單核細胞的選擇性富集
實驗材料:clodronate脂質(zhì)體購于美國FormuMax公司。試驗方法:C57BL/6小鼠尾靜脈注射200 μ L clodronate脂質(zhì)體，72hr后血液中Ly6chi單核細胞可得到富集。實施例5.Ly6chi單核細胞的選擇性抑制實驗材料:Anti_Ly6c抗體(LEAFPurified antinouseLy-6C)購自 Biolegend公司。試驗方法:C57BL/6小鼠腹腔注射100 μ gAnti_Ly6c抗體，可以特異性地耗竭Ly6chi單核細胞 。
權(quán)利要求
1.Ly6c抗體在炎癥性抑郁癥治療中的應用。
2.Ly6c抗體在炎癥性抑郁癥治療中的應用，其涉及到Ly6chi單核細胞在炎癥性抑郁癥中的病理作用以及采用Ly 6c單克隆抗體可以改善抑郁癥的新用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及Ly6c單克隆抗體在治療中樞炎癥誘導的抑郁癥方面的應用。神經(jīng)炎癥誘導的小鼠抑郁癥模型中，血液中的Ly6chi單核細胞可以向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，提示其參與中樞炎癥反應。對血液中的Ly6chi單核細胞特異性地富集可以明顯加重抑郁樣行為。同時，給予Ly6c抗體來特異性地抑制Ly6chi單核細胞的功能可以顯著地改善抑郁樣行為。以上結(jié)果表明，Ly6chi單核細胞在炎癥相關(guān)抑郁癥中的重要作用以及Ly6c抗體在治療炎癥相關(guān)抑郁癥方面的新應用。
文檔編號A61P29/00GK103110945SQ20131006731
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者王廣基, 鄭嘯, 謝昊, 郝海平, 梁艷, 戴琛, 謝林 申請人:中國藥科大學