專利名稱：膠原/纖維蛋白膠-vegf與間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建雙層皮膚覆蓋物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，由于炎癥、潰瘍、外傷、腫瘤術(shù)后以及先天畸形等原因常造成皮膚的缺損和異常。目前皮膚缺損的常規(guī)治療方法有自體、異體或異種皮移植，由于自體皮來源有限，異體皮、異種皮移植仍存在一定的免疫排斥反應(yīng)，且有傳播疾病的危險(xiǎn)，難以滿足臨床應(yīng)用的需要，大面積的缺損僅靠創(chuàng)面自身難以實(shí)現(xiàn)皮膚的再生，需要足夠的皮膚替代物進(jìn)行修復(fù)。故尋找一種理想的皮膚替代物一直是臨床上急需解決的難題。組織工程皮膚產(chǎn)品的研制成功為治療皮膚的急性和慢性損傷提供了一個極有前景的治療方法。組織工程產(chǎn)品主要 由種子細(xì)胞和支架材料構(gòu)建而成。如何獲得一種比較理想的組織工程皮膚，種子細(xì)胞和支架材料的選擇就成了關(guān)鍵。目前，干細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)和再生中的應(yīng)用成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stemcells,UCMSCs)來源于早期中胚層，具有跨胚層向多組織細(xì)胞分化的潛能，在適宜的體外環(huán)境下可分化為皮膚細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等，是一種理想的皮膚組織工程種子細(xì)胞?，F(xiàn)有的皮膚組織工程支架尚有以下缺陷(1)構(gòu)建的皮膚樣替代物或人工皮膚并不具備完整的皮膚結(jié)構(gòu)和功能，沒有達(dá)到人工重建皮膚的目的；(2)由于組織工程皮膚常常沒有血管系統(tǒng)供給營養(yǎng)，表面的上皮容易壞死脫落；(3)皮膚組織的生長不一致，均一輸送及長時(shí)間活性保持仍不理想，嚴(yán)重制約在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種既具有良好生物相容性和生物降解性又具有特定形狀和連通三維多孔結(jié)構(gòu)，具有持續(xù)營養(yǎng)供應(yīng)的的支架材料是組織工程的一個重要方面。膠原的生物學(xué)性質(zhì)與功能具有低抗原性、生物可降解性(易被人體吸收)、細(xì)胞適應(yīng)性和促細(xì)胞增殖作用，使得膠原蛋白成為最有用的生物材料之一，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如組織工程支架材料具有廣泛用途。通過交聯(lián)或復(fù)合其他物質(zhì)可以提高膠原支架的酶穩(wěn)定性，改善膠原的力學(xué)性能可以達(dá)到改善上述缺點(diǎn)的作用，纖維蛋白膠具有良好的止血和組織黏合作用，本發(fā)明結(jié)合上述兩種生物材料的特點(diǎn)，可改善單純一種材料的局限性，并給細(xì)胞提供三維生長空間，為皮膚的修復(fù)過程形成提供所需的三維空間。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)可刺激多種細(xì)胞的增殖，主要是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與纖維蛋白混合后，與膠原復(fù)合制備雙層支架，可在一定程度上改善原有缺點(diǎn)。雙層支架復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞體可以達(dá)到更好的細(xì)胞增殖、融合和誘導(dǎo)分化的作用，促進(jìn)組織工程皮膚血管系統(tǒng)的生長，供給營養(yǎng)。具有很大的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。中國發(fā)明專利申請CN101062430A公開了一種采用膠原-殼聚糖/纖維蛋白膠的不對稱支架，該支架材料具有良好的細(xì)胞相容性，是一種適應(yīng)皮膚尤其是復(fù)合皮膚構(gòu)建的皮膚再生材料。中國發(fā)明專利CN102294055A公開了一種表皮干細(xì)胞修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途。采用表皮干細(xì)胞與修飾幾丁質(zhì)膜共同培養(yǎng)，使表皮干細(xì)胞在修飾幾丁質(zhì)膜上均勻的，充分鋪展并具有良好的生長狀態(tài)，以利于表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面中從毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化，并產(chǎn)生毛囊等附屬器，完成表皮與真皮修復(fù)效果，實(shí)現(xiàn)病損組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)再生、功能重建，用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復(fù)。中國發(fā)明專利CN102618492A公開了一種干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)軟骨支架材料及制備方法。采用膠原/纖維蛋白/PLGA微球復(fù)合支架材料。該三維支架材料由膠原、纖維蛋白膠，高分子聚合物PLGA控釋微球組成，支架內(nèi)部的TGF-β I濃度與支架表面的TGF-β I濃度一致。是一種新穎的干細(xì)胞體外誘導(dǎo)軟骨組織的三維支架材料，具有良好的生物相容性和可降解性，具有比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的較好的營養(yǎng)物質(zhì)分布均勻的性質(zhì)，很有希望作為軟骨組織修復(fù)材料在臨床上得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在還未有將膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料復(fù)合UCMSCs制成雙層皮膚覆蓋物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種生物相容性好，機(jī)械性能適當(dāng)，具有適當(dāng)?shù)奈⒖捉Y(jié)構(gòu)，適應(yīng)組織工程皮膚構(gòu)建的膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物。本發(fā)明的第二個目的是提供膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與UCMSCs復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是提供膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與UCMSCs復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物的 應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)第一個目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與UCMSCs復(fù)合的雙層皮膚覆蓋物，該雙層皮膚覆蓋物包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架和UCMSCs活性層，其中膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架由膠原層和纖維蛋白膠-VEGF構(gòu)成。UCMSCs主要種植于纖維蛋白膠-VEGF層，纖維蛋白膠-VEGF層與膠原層連接，雙層支架材料與間充質(zhì)干細(xì)胞共孵育即為雙層皮膚覆蓋物。作為優(yōu)選方案，上述的膠原層空隙平均直徑(130. 0 + 24. 5) ，厚度為(O. 18±0. 045) cm ;雙層支架材料厚度為(O. 25±0. 095) cm。膠原層孔隙率為(74. 8±10. 8) %，雙層支架的孔隙率為(64. 5 ±6. 9) %。為了實(shí)現(xiàn)第二個目的，本發(fā)明首先采用如下技術(shù)方案制備膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架，包括如下步驟
(1)丙二酸溶液配制膠原溶液，攪拌均勻后注入不銹鋼模具，預(yù)凍后冷凍干燥得到膠原海綿狀固體；
(2)將上述膠原海綿狀固體浸入戊二醛溶液中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，清洗后再次進(jìn)行冷凍干燥制備得到膠原多孔支架；
(3)膠原多孔支架裝入聚乙烯薄膜小袋中，封口后Y射線輻射滅菌(6°Co，2X106rad)；(4)將VEGF的PBS溶液與纖維蛋白原混合成含VEGFlmg/ml后，加入凝血酶，制備纖維蛋白膠；
(5)將步驟(4)制得的纖維蛋白膠迅速加入膠原支架層，靜置20分鐘形成雙層支架。作為優(yōu)選，其中步驟(I)中膠原溶脹液是市售新鮮豬皮通過胃蛋白酶法提取得到，膠原含量為92. 5%，丙二酸溶液濃度為0. 3%，其中步驟(2)中通過四因素三水平的正交設(shè)計(jì)膠原溶液質(zhì)量濃度為0. 3%,0. 6%,0. 9%，戊二醛采用體積百分比為0. 3%,0. 6%,0. 9%，交聯(lián)溫度為4°C，20°C，35°C，交聯(lián)時(shí)間為2小時(shí)，4小時(shí)，12小時(shí)。其中較優(yōu)的條件是膠原含量為0. 6%，戊二醛濃度0. 3%，20°C交聯(lián)4小時(shí)。作為優(yōu)選，其中步驟(5)中的纖維蛋白膠加入膠原支架的量為0. 2ml/cm2~l. 0 ml/cm2,加入時(shí)間控制為1. 0-2. 0秒。為了實(shí)現(xiàn)第二個目的，本發(fā)明還公開了膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs的雙層皮膚覆蓋物的制備方法，步驟如下
(0分離UCMSCs，用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)至第三代對數(shù)期，離心收集細(xì)胞；
(2)加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，滴加入膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的纖維蛋白膠-VEGF層(雙層支架的纖維蛋白膠-VEGF層面朝上)；
(3)加入培養(yǎng)基浸沒膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料的膠原層，置于37°C、5%C02飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。作為優(yōu)選，其中步驟(2)中細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為5. 0X 105個/ml，5. 0*106個/ml，5. 0 X 107個/ml，加入細(xì)胞懸液的量為 0. lml/cm2，0. 5ml/cm2，1. 0ml/cm2,步驟(3)中與雙層支架材料孵育時(shí)間為0. 5小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，其中較優(yōu)的條件是細(xì)胞密度為5. 0Xl07個/ml，加入細(xì)胞懸液的量為0. 5ml/cm2，孵育時(shí)間為2小時(shí)。為了實(shí)現(xiàn)第三個目的，本發(fā)明公開了上述膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs的雙層皮膚覆蓋物在構(gòu)建組織工程皮膚中的應(yīng)用。本發(fā)明制備的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs的雙層皮膚覆蓋物具有含有細(xì)胞因子和細(xì)胞的活性層和膠原層。含有VEGF的纖維蛋白膠層，其中VEGF起到刺激干細(xì)胞增殖，向表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用；膠原層支架空隙平均直徑(130. 0±24. 5)Mffl，孔徑分布均勻，機(jī)械強(qiáng)度適宜。本發(fā)明制備膠原/纖維蛋白-VEGF復(fù)合UCMSCs的雙層皮膚覆蓋物具有可降解性，降解速率可控，優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性，良好的細(xì)胞相容性，而且各種原料廉價(jià)易得，制備條件可控，是一種適應(yīng)皮膚缺損尤其是適合皮膚構(gòu)建的仿生皮膚覆蓋物材料。


圖1是雙層支架膠原層掃描電鏡照片。圖2是雙層支架纖維蛋白膠-VEGF層掃描電鏡照片。圖3是雙層支架的機(jī)械性能測定結(jié)果。圖4是雙層支架體外降解速率。圖5是凡士林對照組用于小鼠全層皮膚缺損2周照片。圖6是膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料用于小鼠全層皮膚缺損2周照片。
圖7是UCMSCs用于小鼠全層皮膚缺損2周照片。圖8是雙層皮膚覆蓋物用于小鼠全層皮膚缺損2周照片。圖9是對照組用于小鼠全層皮膚缺損2周時(shí)皮膚石蠟切片，HE染色照片。圖10膠原/纖維蛋白-細(xì)胞因子雙層材料用于小鼠全層皮膚缺損2周時(shí)皮膚石蠟切片，HE染色照片。圖11是UCMSCs用于小鼠全層皮膚缺損2周時(shí)皮膚石蠟切片，HE染色照片。圖12是雙層皮膚覆蓋物用于小鼠全層皮膚缺損2周時(shí)皮膚石蠟切片，HE染色照片。圖13是雙層皮膚覆蓋物用于小鼠全層皮膚缺損2周時(shí)皮膚電鏡照片，其中新生的毛細(xì)血管圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料的制備
(1)膠原溶脹液與丙二酸溶液配制質(zhì)量濃度為O.6%的膠原溶液，攪拌均勻后注入不銹鋼模具，預(yù)凍后冷凍干燥得到膠原海綿狀固體；
(2)將上述膠原海綿狀固體浸入O.3%戊二醛溶液交聯(lián)，20°C交聯(lián)4小時(shí)，清洗后再次進(jìn)行冷凍干燥制備得到膠原多孔支架；
(3)膠原多孔支架裝入聚乙烯薄膜小袋中，封口后Y射線輻射滅菌(6°Co，2X106rad)；
(4)將VEGF的PBS溶液與纖維蛋白原混合成含VEGFlmg/ml溶液后，加入等體積100IU/ml的凝血酶，制備纖維蛋白膠；
(5)將纖維蛋白膠迅速加入膠原支架層，靜置20分鐘形成雙層支架。實(shí)施例2膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料的制備物化性質(zhì) 2-1雙層支架材料的形貌觀察
將制備好的雙層支架材料置入液氮冷凍定型后，取出切成小試片，取其表面和截面置于金屬片上，真空噴金處理后，掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)和截面形貌，估算支架平均孔徑。膠原層支架空隙平均直徑(130. 0±24. 5) Mffl，孔徑分布均勻。膠原層厚度為(O. 18±0· 045) cm ;復(fù)合后的雙層材料厚度為O. 25cm O. 35cm。2-2雙層支架材料孔隙率檢測
常溫下，25ml的刻度瓶加入無水乙醇至刻度，稱重記為Hi1，把重m的樣品浸入其中，24h時(shí)用吸管吸去刻度以上的無水乙醇，再稱重記為m2,把浸滿無水乙醇的樣品取出，稱量刻度瓶與剩余無水乙醇的質(zhì)量，記為m3。支架材料的孔隙率K按下式計(jì)算K( %)=(m2-m3_m) / (Hi1-m3) X 100%。經(jīng)計(jì)算膠原層孔隙率為(74. 8±10. 8) %，雙層支架的孔隙率為(64. 5±6. 9) %。2-3雙層支架材料的機(jī)械性能檢測
取每種雙層支架材料樣品各五個，剪成條狀，計(jì)算其表面積，用電子拉力試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行拉伸強(qiáng)度的測試(夾具間距為20mm，拉伸速度為100mm/min)。檢測其斷裂強(qiáng)度及斷裂伸長率。斷裂強(qiáng)度=斷裂拉力/截面積；斷裂伸長率=(斷裂長度-拉伸前長度)/拉伸前長度。
雙層支架材料的斷裂強(qiáng)度為(O. 61±0. 10) N/mm2，斷裂伸長率為(24. 5±3. 1)%。2-4雙層支架材料的降解性能檢測
膠原酶溶液的配制稱取膠原酶(228U/mg)，加入PBS (pH6. 8)緩沖液中溶解，使其濃度為10U/ml，加入CaCl2，使其濃度為O. 005M，加入少量NaN3 (O. 01% ) 雙層支架材料冷凍干燥后精確稱重為Wtl,加入8ml (10U/mg)膠原酶溶液,置于(37±1) °C，(75±l)rpm空氣浴振蕩器中計(jì)時(shí)反應(yīng)。每樣做三個平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)24，48，72，96，120小時(shí)時(shí)，各取出一片，加入Iml EDTA溶液(O. 2M)終止反應(yīng)。用三蒸水漂洗3次，每次10分鐘。冷凍干燥后稱重W1，按公式D%= (W0-W1) /W0 X 100%計(jì)算降解百分率。結(jié)果如圖4，在上述含有膠原酶的降解溶液中，膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料24小時(shí)降解率達(dá)14. 6% ;降解第120小時(shí)肉眼觀察雙層支架材料大部分已經(jīng)崩解，只有一些絮狀纖維和少量的沉淀。而單純的纖維蛋白由于機(jī)械強(qiáng)度較低，在24小時(shí)時(shí)即出現(xiàn)崩解現(xiàn)象，48小時(shí)即成為絮狀沉淀。實(shí)施例3制備膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與UCMSCs復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物
(O分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)至第三代對數(shù)期，離心收集細(xì)
胞；
(2)加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為5.OX IO6個/ml的細(xì)胞懸液，在實(shí)施例1制備的雙層支架的纖維蛋白-VEGF層滴加入細(xì)胞懸液O. 5ml/cm2 ；
(3)加入培養(yǎng)基浸沒膠原層，置于37°C、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育2小
時(shí)。 實(shí)施例4膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與UCMSCs復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物用于組織工程皮膚構(gòu)建
4-1動物模型的制備及應(yīng)用
KM小鼠48只，雌雄各半，體重18-22g，隨機(jī)分為四組，背部剃毛，硫化鈉脫毛后，24小時(shí)后，水合氯醛麻醉，利刀在背部游離出皮膚，剪下直徑為Icm的圓形皮膚，形成機(jī)械全層皮膚損傷模型。分別涂抹或移植凡士林(A組)，膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料(B組)，UCMSCs細(xì)胞懸液(C組)和膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架材料與UCMSCs復(fù)合構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物(D組)于創(chuàng)面上，用敷料粘貼固定。4-2創(chuàng)面愈合情況的觀察和組織學(xué)檢查
記錄并比較分析各組創(chuàng)面愈合情況的差異，并與術(shù)后，2周，3周時(shí)間創(chuàng)面及周圍組織取材，常規(guī)石蠟包埋切片進(jìn)行，HE染色。A、B、C和D四組創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為(24.4±3.0)天、(18. 6±2. 3)天、(20. 5±2. 8)天和(16. 7±2. 2)天，差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性意義(P〈0. 05)。在2周時(shí)其中雙層支架材料(B組)和雙層皮膚覆蓋物(D組)移植組創(chuàng)面愈合良好，尤其是雙層皮膚覆蓋物(D組)。術(shù)后I周對照組創(chuàng)面約20%皮膚發(fā)黑、結(jié)痂、壞死，2周時(shí)仍見壞死組織且瘢痕攣縮明顯，I周時(shí)測定創(chuàng)面的愈合百分率為43. 25±3. 50%ο D組愈合百分率為58. 20±3. 16%。2周時(shí)A、B、C和D組創(chuàng)面愈合百分率分別為56. 32±3. 47%、58. 12±6· 10%,68. 79±4· 78%和71. 27±4· 26%。D組創(chuàng)面上皮化程度高，覆蓋物與創(chuàng)面邊緣融合較好，與基底貼附緊密，組織學(xué)檢查上皮形成較好，基底層平坦，新生毛細(xì)血管較多。
權(quán)利要求
1.膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物，其特征在于該雙層皮膚覆蓋物包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架和UCMSCs的活性層，其中VEGF分布在纖維蛋白膠層，兩層具有不同的孔隙率。
2.權(quán)利要求1所述膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物，其中膠原層孔隙直徑為(130. O±24. 5) Mffl，膠原層厚度為(O. 18±O. 045) cm，膠原/纖維蛋白膠-VEGF 雙層支架材料厚度為(O. 25±O. 095) cm。
3.權(quán)利要求1所述膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物，其中膠原層孔隙率為(74. 8± 10. 8) %，膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的孔隙率為(64. 5 ±6. 9) %。
4.權(quán)利要求1所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備，步驟如下(O膠原溶脹液與丙二酸溶液配制質(zhì)量濃度為O. 39Γ1. 0%的膠原溶液，攪拌均勻后注入不銹鋼模具，預(yù)凍后冷凍干燥得到膠原海綿狀固體；(2)將上述膠原海綿狀固體浸入戊二醛溶液進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，清洗后再次進(jìn)行冷凍干燥制備得到膠原多孔支架；(3)將膠原多孔支架裝入聚乙烯薄膜小袋中，封口后Y射線6°Co，2X106rad輻射滅菌；(4)將VEGF的PBS溶液與纖維蛋白原混合成含VEGFlmg/ml后，加入凝血酶，制備纖維蛋白月父;(5 )將上述纖維蛋白膠迅速加入膠原支架層，靜置20分鐘形成膠原/纖維蛋白膠-VEGF 雙層支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備步驟(I)中膠原溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為O. 3%, O. 6%, O. 9%ο
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備步驟(2)中化學(xué)交聯(lián)的條件優(yōu)選為戊二醛溶液體積百分比O. 3%，20°C，12小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的制備步驟(5)中的纖維蛋白膠加入膠原支架的量為O. 2ml/cm2-l. O ml/cm2，加入時(shí)間控制為1. 0-2. O秒。
8.權(quán)利要求4所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于還包括膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架復(fù)合UCMSCs的制備，步驟如下(O分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)至第三代對數(shù)期，離心收集細(xì)胞；(2)加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為5.OX IO5個/mf 5. OX IO7個/ml的細(xì)胞懸液，滴加到膠原/纖維蛋白膠-VEGF雙層支架的纖維蛋白-VEGF層，加入細(xì)胞懸液的量為O.1ml/ cm2-l· O ml/cm2 ；(3)加入培養(yǎng)基浸沒膠原層，置于37°C、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育O. 5^4小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合UCMSCs雙層皮膚覆蓋物在構(gòu)建組織工程皮膚中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建的雙層皮膚覆蓋物及其制備方法和應(yīng)用。具體的說是采用膠原與含有VEGF的纖維蛋白膠復(fù)合制成雙層組織工程支架材料，與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育后制成仿生的雙層皮膚覆蓋物。本發(fā)明所制備的膠原/纖維蛋白膠-VEGF復(fù)合間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建雙層皮膚覆蓋物降解性能與皮膚生長速率適宜，機(jī)械性能可控，是一種新穎仿生皮膚覆蓋物，促進(jìn)表皮和真皮的修復(fù)，促進(jìn)血管內(nèi)皮的生長，用于皮膚表層及全層創(chuàng)面修復(fù)，加速愈合，達(dá)到理想的創(chuàng)面修復(fù)效果，對臨床皮膚創(chuàng)面的修復(fù)具有重要意義。另外，本發(fā)明還公開了上述雙層皮膚覆蓋物的應(yīng)用。
文檔編號A61L27/24GK103041453SQ20131001886
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者陳紅麗, 南文濱, 張慧, 李永海, 劉涌濤, 劉瑞, 林俊堂, 豐慧根 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院