專利名稱：Smoc2基因在制備檢測或治療子宮內膜癌和卵巢癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物，具體涉及生物藥，尤其涉及SM0C2基因在制備檢測或治療子宮內膜癌藥物中的應用。
背景技術：
子宮內膜癌是婦科三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡年輕化(KOUJI BANNO 等 Biomarkers in endometrial cancer!Possible clinical applications)。子宮內膜癌的高危因素有肥胖，未孕和不孕，晚絕經，糖尿病，高血壓等。子宮內膜癌的發(fā)生與雌激素的持續(xù)作用有直接關系。發(fā)病機制尚不清楚。但可以明確的是子宮內膜癌的發(fā)生和轉移與腫瘤細胞所處的環(huán)境有著密切關系。研究表明，膠原蛋白、層粘連蛋白及其受體整合素在子宮內膜癌中異常表達，且這種異常表達與腫瘤細胞的粘附、侵襲轉移、神經和血管新生、免疫紊亂等密切相關。SM0C2 (SPARC related molular calcium binding2)基因是一種細胞外基質蛋白，從生化特征角度來看屬于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白家族(SPARC)成員之一。SM0C2基因在多種組織中都有表達，尤其是在胚胎發(fā)生時期和創(chuàng)傷愈合期有較高表達。SM0C2基因是一個分子量大約為50KD左右的分泌蛋白，由四個主要的結構域組成:1)包含21氨基酸殘基的信號肽；2) —個Kazal區(qū)，即Kazal型蛋白酶抑制劑結構域，通常被認為是絲氨酸蛋白酶抑制劑(例如球蛋白樣結構域)，具有蛋白酶抑制劑的潛能；3)兩個TY結構域，即I型甲狀腺球蛋白重復序列；功能上可以抑制半胱氨酸蛋白酶活性，且可以與肝素相結合；4)兩個EF-hand鈣結合區(qū)，其功能未知。在功能上，SM0C2基因在細胞外基質組裝以及組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維護中起著非常重要的作用。SM0C2基因具有調控細胞遷移、粘附和神經新生等多重功能。另外，SM0C2基因還能夠刺激內皮細胞增殖和血管生成活性，在腫瘤生長和心肌缺血中SM0C2可作為控制血管生成的靶標。Vannahme等CCharacterization of SM0C—2, a modular extracellular calcium-binding protein.Biochem J.2003Augl;373(Pt3):805-14.
SM0C2基因可能主要是通過以下幾種方式來實現其對腫瘤微環(huán)境的調控功能:1)SM0C2基因通過調節(jié)細胞外基質的組成和結構來影響微環(huán)境中各種細胞的功能；2)作為分泌蛋白SM0C2基因可以通過與細胞表面的整合素受體或其它非整合素受體相互作用，從而在微環(huán)境和細胞間傳遞信號；3)SM0C2基因還可以通過與細胞因子(比如:TGF-13)或其受體相互作用，從而引起一系列的胞內信號傳導，最終影響腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡等多方面的功能。目前，SM0C2基因在發(fā)育和疾病上的功能研究還處于初始階段，最近在成人骨腫瘤發(fā)生和骨組織重建的研究中發(fā)現，SM0C2基因可以與多種生長因子(如:H)GF和VEGF)結合，并因此改變其活性，最終影響骨腫瘤發(fā)生和骨組織重建(Pazin DE等Developmentalexpression of Smocl and Smoc2suggests potential roles infetal gonad and reproductive tract differentiation.Dev Dyn.
2009;238(11):2877-2890.
)，SM0C2基因還可直接與FGF和TGF-β相互作用從而調節(jié)其介導細胞功能。(Maier S 等 The widely expressed extracellular matrix protein SM0C_2promoteskeratinocyte attachment and migration.Exp Cell Res.2008;Augl;314(13):2477-2487.)ffilk JB等.Secreted modular calcium-bindingprotein2haplotypes are associatedwith pulmonary function.2007;175(6):554-560.)另有研究表明，活化的芳香烴受體(Ahr)可以結合到SM0C2基因啟動子上，從而在轉錄表達水平調控SM0C2基因表達，因此干預SM0C2基因表達可以調節(jié)微環(huán)境芳香烴化合物對發(fā)育的不 良影響..Liu P等The developmentally-regulatedSmoc2gene is repressed by Ary1-hydrocarbon receptor (Ahr) signaling.Gene.2009;15:433(1-2):72-80.)SM0C2基因作為一種細胞與基質間相互作用的調節(jié)因子越來越受到研究者的關注。但是SM0C2基因在婦科腫瘤微環(huán)境的中作用機制，以及它在微環(huán)境中的特異受體或相互作用蛋白仍未知，尤其是S0MC2基因在婦科腫瘤方面的功能還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計SM0C2基因相關制藥的應用。本發(fā)明提供了 SM0C2基因在制藥中的應用?；蛎Q:SM0C2中文名:分泌模塊化鈣結合蛋白2;又稱為:平滑肌相關蛋白2英文名:SM0C2(SPARCrelated modular calcium binding2)序列:見序列表I (SEQ ID N0.1)。具體地，本發(fā)明提供了 SM0C2基因在制備檢測或治療子宮內膜癌藥物中的應用。本發(fā)明所指的SM0C2基因包括其完整的DNA編碼序列，其RNA序列，其突變體，以及其功能上活性的片段。需理解的是，當編碼相同的氨基酸時，密碼子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產生的保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。在得到了 SM0C2的核酸片段的情況下，可根據核苷酸序列來設計特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。本發(fā)明中，SM0C2多核苷酸序列可插入到重組表達載體中?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含SM0C2的DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。轉化載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞；動物細胞等。在獲得了核酸序列后，可根據核酸序列設計特異性核酸探針。設計探針的方法是本領域常規(guī)的，可見Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述。檢測生物樣品中是否存在SM0C2蛋白或核酸的示范性方法包括獲得測試受試者的生物樣品，使該生物樣品接觸能與SM0C2mRNA或基因組DNA雜交的標記的核酸探針。用于本發(fā)明診斷試驗的其它探針如本文所述。核酸探針與擴增的標記序列接觸。該探針優(yōu)選連接到一種發(fā)色團，但可被放射標記。在另一個實施例中，探針連接到一種結合伴侶上，如抗體或生物素，或另一種攜帶可檢測結構域的結合伴侶上。在傳統的方法中，檢測可通過Southern印跡以及與標記的探針雜交來進行。Southern印跡所涉及的技術是本領域技術人員所熟知的(參見Sambrook等，1989)。常規(guī)的檢測還有生物芯片、熒光顯影技術、細胞流式計數等。另一方面，本發(fā)明還包括對SM0C2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于SM0C2基因產物或片段?！拜^佳地”指那些能與SM0C2基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。抗SM0C2蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中,檢測活檢標本中的SM0C2蛋白，還可以作為用于預防子宮內膜癌轉移和侵襲的特異性治療劑。

血樣或尿液中的SM0C2的直接測定可以作為腫瘤的輔助診斷和預后的觀察指標，也可作為腫瘤早期診斷的依據。抗體可以通過ELISA、Western印跡分析,或者與檢測基團偶聯,通過化學發(fā)光、同位素示蹤等方法來檢測。本發(fā)明也包括試劑盒，以進行這里描述的任何方法。在一個非限制的實例中，所述試劑盒將以適當的容器形式包含這些試劑中的一種或多種。所述試劑盒也可包含用于RNA分離、擴增細胞中RNA的純化的試劑、標記等。本發(fā)明所述檢測或治療子宮內膜癌藥物包括用RT_PCR、PCR、免疫檢測、原位雜交、基因芯片檢測或治療子宮內膜癌的藥物或試劑盒。所述用RT-PCR檢測子宮內膜癌的藥物至少包括一對特異性擴增SM0C2基因的引物。所述用免疫檢測檢測子宮內膜癌的藥物包括與SM0C2蛋白特異性結合的抗體、多克隆抗體和單克隆抗體。所述用原位雜交檢測子宮內膜癌的藥物包括與SM0C2核酸序列雜交的探針。所述用基因芯片檢測子宮內膜癌藥物包括與SM0C2核酸序列雜交的探針。所述用于檢測子宮內膜癌的試劑盒包含用于RNA分離、擴增細胞中RNA的純化的試劑、標記等。 試劑盒的組分可以以水介質的形式或以凍干的形式來包裝。試劑盒中適當的容器通常至少包括一種小瓶、試管、長頸瓶、寶特瓶、針筒或其它容器，其中可放置一種組分，并且優(yōu)選地，可進行適當地等分。在試劑盒中存在多于一種的組分時，試劑盒中通常也將包含第二、第三或其它附加的容器，其中分離地放置附加的組分。然而，不同組合的組分可被包含在一個小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常也將包括一種用于容納反應物的容器，密封以用于商業(yè)銷售。這種容器可包括注?；虼的５乃芰先萜鳎渲锌杀Ａ羲璧男∑?。本發(fā)明的又一目的是提供了 SM0C2基因在制備治療子宮內膜癌藥物中的應用。本發(fā)明所述治療藥物包括:通過RNA干擾抑制SM0C2基因表達的雙鏈核糖核酸、基于SM0C2抗原蛋白的腫瘤疫苗或抑制SM0C2蛋白活性的蛋白質。本發(fā)明所述治療子宮內膜癌藥物可以通過口服、皮膚或腸胃外方式給藥。本發(fā)明所述治療子宮內膜癌藥物可以通過本領域常規(guī)技術制成口服、吸入、注射或栓劑等劑型。本發(fā)明人通過下列試驗:A、發(fā)明人利用組織微陣列技術構建了包含157例子宮內膜癌，30例正常增生期子宮內膜，30例正常分泌期子宮內膜標本的組織芯片，并利用免疫組織化學技術檢測SM0C2在這些標本中的表達情況，發(fā)現SM0C2在子宮內膜正常組織中陽性表達率遠低于在子宮內膜癌中陽性表達率(16.68%vs73.25%)，且SM0C2表達強度與子宮內膜癌肌層侵襲深度(P< 0.0001)和子宮內膜癌腫瘤分級(p=0.0167)呈正相關。B、根據上述實驗結果尤其是大樣本量的臨床資料分析，本發(fā)明人已經證實了SM0C2基因與子宮內膜癌的生物學特性及子宮內膜癌患者預后存在必然聯系。該基因的蛋白編碼產物SM0C2蛋白作為一種分泌型糖蛋白，可以在血清中得到檢測，為子宮內膜癌等疾病的早期診斷和預后判斷提供一種新的手段。因此，SM0C2基因可以用于制備檢測或治療子宮內膜癌藥物。本發(fā)明在子宮內膜癌癌研究和臨床引用領域首次提出利用基于血清/組織中SM0C2基因及其產物的檢測來達到早期診斷子宮內膜癌或對接受手術治療的子宮內膜癌患者進行預后判斷。本發(fā)明的實驗建立在基因水平上的實時定量PCR驗證和蛋白水平上的大樣本臨床樣本驗證，結果可靠，且根據實驗結果，SM0C2無論是在細胞水平還是蛋白水平上都能夠顯著區(qū)分腫瘤與非腫瘤、高危腫瘤與低危腫瘤，結果的重復性好，具有成為良好的臨床可操作的生物標志物的潛質以及良好的臨床應用前景，有較大的應用價值和社會效益。


圖1實施例1低分化子宮內膜癌免疫組化染色結果(腫瘤組織，強陽性)圖2實施例1中分化子宮內膜癌免疫組化染色結果(腫瘤組織，陽性)圖3實施例1高分化子宮內膜癌免疫組化染色結果(腫瘤組織，強陽性)圖4實施例1低分化子宮內膜癌免疫組化染色結果(腫瘤組織，強陽性)圖5實施例1增生期子宮內膜免疫組化染色結果(對照，陰性)圖6實施例1為5株內膜癌細胞中SM0C2的mRNA表達量水平，縱坐標代表細胞系中SM0C2的mRNA表達水平，橫坐標從左到右依次表示子宮內膜癌細胞系AN3CA，Ishikawa,HEC-1A, HEC-1B, KLE圖7SM0C2干擾后子宮內膜癌細胞AN3CA的CCK-8細胞增殖實驗結果， 表示SM0C2干擾對照組，■表示SM0C2的I號干擾片段，▲表示SM0C2的2號干擾片段，橫坐標表示細胞增殖時間(天)，縱坐標為在450nm波長處檢測的OD值，結果表明干擾掉SM0C2基因后細胞增殖能力下降。圖8過表達SM0C2后子宮內膜癌細胞HEC-1A的CCK-8細胞增殖實驗結果， 表示過表達SM0C2的對照組，■表示過表達SM0C2基因的實驗組，橫坐標表示細胞增殖時間(天)，縱坐標為在450nm波長處檢測的OD值，結果表明過表達SM0C2基因后細胞增殖能力明顯增強。
具體實施例方式實施例1、SM0C2在子宮內膜癌病人組織中的表達情況主要試劑SM0C2多克隆抗體(ab78069)及二抗多克隆抗兔IgG(ab6721)均購自abeam公司。1.1子宮內膜癌組織芯片陣列的構建1.2免疫組織化學染色1.4染色前將石蠟切片置于80°C烘箱中烘烤20分鐘，然后按二甲苯IOmin，1/2 二甲苯 lOmin，100% 酒精 10min，95% 酒精 10min，85% 酒精 10min，75% 酒精 IOmin 流程脫蠟。將脫蠟完畢的切片按如下流程染色:自來水沖洗5-10min，抗原修復IOmin待自然冷卻至后于37V 0.3%H202中3min用IXPBS清洗后10%BSA室溫封閉I小時再孵育一抗4°C過夜，第二天用I XPBS洗3遍HRP 二抗室溫孵育l_2hl XPBS清洗后DAB發(fā)色IOs然后流水沖洗15min用蘇木精染色30-45s，自來水沖洗5min。之后按75%酒精5min，85%酒精5min，95%酒精5min，100%酒精5minl/2 二甲苯5min，二甲苯5min流程進行脫水，脫水后用中性樹脂封片，鏡下觀察。1.4組織芯片結果判斷顯微鏡下觀察內膜癌組織樣本中SM02表達染色情況，子宮內膜癌組織標本表達量顯著高于陰性對照組。( 見圖1，2，3，4中陽性表達量顯著高于圖5的陰性對照)1.5統計學分析進一步統計學分析發(fā)現子宮內膜癌組織與陰性對照組相比具有顯著的統計學差異。(如下表)子宮內膜癌組與對照組SM0C2表達情況對比
權利要求
1.SM0C2基因在制備藥物中的應用，其特征在于，所述SM0C2基因序列為SEQ ID N0.1。
2.SM0C2基因在制備檢測子宮內膜癌藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測子宮內膜癌藥物包括用RT-PCR、PCR、免疫檢測、原位雜交、基因芯片診斷內膜癌的藥物或試劑盒。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用RT-PCR檢測子宮內膜癌的藥物至少包括一對特異性擴增SM0C2基因的引物。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用PCR檢測子宮內膜癌的藥物至少包括一對特異性擴增SM0C2基因的引物。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用免疫檢測子宮內膜癌的藥物包括與SM0C2蛋白特異性結合的抗體、多克隆抗體和單克隆抗體。
7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用原位雜交檢測子宮內膜癌的藥物包括與SM0C2核酸序列雜交的探針。
8.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用于檢測子宮內膜癌的試劑盒包含用于RNA分離、擴增細胞中RNA的純化的試劑或標記的SM0C2基因。
9.SM0C2基因在制備治療子宮內膜癌藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述治療子宮內膜癌藥物包括:通過RNA干擾抑制SMOC2基因表達的雙鏈核糖核酸、基于SMOC2抗原蛋白的腫瘤疫苗或抑制SMOC2蛋白活性的 蛋白質。
全文摘要
本發(fā)明提供了SMOC2基因(SPARC related modular calcium binding2，中文名分泌模塊化鈣結合蛋白2;平滑肌相關蛋白2)在制備檢測或治療子宮內膜癌藥物中的應用。本發(fā)明人利用組織微陣列技術構建了包含157例子宮內膜癌，30例正常增生期子宮內膜，30例正常分泌期子宮內膜組織標本的組織芯片，并利用免疫組織化學技術檢測SMOC2在這些標本中的表達情況，發(fā)現SMOC2在子宮內膜正常組織中陽性表達率遠低于在子宮內膜癌中陽性表達率，且SMOC2表達強度與子宮內膜癌肌層侵襲深度和子宮內膜癌腫瘤分級呈正相關。因此，SMOC2基因可用于制備檢測或治療子宮內膜癌藥物。本發(fā)明的實驗結果可靠，重復性好，具有良好的臨床應用前景，有較大的應用價值和社會效益。
文檔編號A61K39/395GK103103264SQ20131001631
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權日2013年1月16日
發(fā)明者張蓉, 張學利, 楊廣東, 朱琳艷, 陸歡 申請人:上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院