一種穩(wěn)定的包裹紫杉醇固體蛋白納米粒及其質(zhì)量控制方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定的包裹紫杉醇藥物的固體蛋白納米粒及其質(zhì)量控制方法，該納米粒蛋白表面包裹表面活性劑，經(jīng)過研究篩選白蛋白與表面穩(wěn)定劑的比例以及表面穩(wěn)定劑的種類，制備了可以穩(wěn)定存放的紫杉醇納米粒，該納米?？煞€(wěn)定存放12小時以上，極大的方便了臨床使用，具有實際的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種穩(wěn)定的包裹紫杉醇固體蛋白納米粒及其質(zhì)量控制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，該納米粒包裹表面活性劑，通過篩選白蛋白載體的表面穩(wěn)定劑，制備了可以穩(wěn)定存放的紫杉醇納米粒，該納米?？煞€(wěn)定存放12小時以上，極大的方便了臨床使用，具有實際的應(yīng)用價值。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇是一種天然的抗癌原料藥，為白色結(jié)晶粉末、難溶于水及許多藥用溶媒，水中溶解度僅為0.006mg/ml，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑，紫杉醇是一個復(fù)雜的二萜類化合物，具有含氧四環(huán)的紫杉烷環(huán)及酯側(cè)鏈，分子式為:C47H51N014，分子量:853.90，在PH4~8范圍內(nèi)紫杉醇比較穩(wěn)定，堿性條件下很快分解，酸性條件下比較穩(wěn)定。
[0003]目前上市的紫杉醇靜脈注射液最早由NCI于1978年研制，該藥物由施貴寶藥廠生產(chǎn)，現(xiàn)已進(jìn)入我國市場。處方以CremophorEL50 % (v/v增溶劑)，50 % (v/v)無水乙醇為溶媒，紫杉醇濃度達(dá)6mg/ml,用5%右旋糖酐稀釋或生理鹽水稀釋至0.3~1.2mg/m,紫杉醇理化性質(zhì)可穩(wěn)定12h以上?，F(xiàn)FDA批準(zhǔn)的給藥方案是每21d靜脈滴注一次，每次將總給藥劑量的1/3用500ml5%右旋糖酐稀釋后8h內(nèi)滴完，連續(xù)滴注24h，最低給藥劑量135mg/m2。該處方給藥后數(shù)分鐘，過敏反應(yīng)發(fā)生率為39%，其中嚴(yán)重過敏反應(yīng)發(fā)生率為2%，多數(shù)為I型變態(tài)反應(yīng)，表現(xiàn)為支氣管痙攣性呼吸困難、蕁麻疹和低血壓，部分病人出現(xiàn)藥物性皮疫、呼吸急促、支氣管疫攣、低血壓等過敏反應(yīng)。研究認(rèn)為，這主要是處方中CremophorEL引起體內(nèi)組胺釋放造成。其在紫杉醇注射液中使用劑量明顯高于所有已上市制劑，目前多采取在給藥前數(shù)小時服用苯海拉明、地塞米松、氨茶堿等抗組胺劑防止過敏反應(yīng)的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，注射液中CremophorEL與聚氯乙烯塑料管和輸液袋接觸可浸提出大量的塑化劑鄰苯二甲酸二乙基乙酯，因此專家建議臨床使用玻璃、聚乙烯容器及內(nèi)襯聚乙烯的硝化甘油管為輸液器具。
[0004]如今ABRAXANE?注射用紫杉醇(白蛋白結(jié)合型)的上市引起了市場的廣泛關(guān)注，我公司的研究人員對以白蛋白為載體包裹紫杉醇的藥物進(jìn)行了深入研究，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，用非離子表面活性劑，使包裹紫杉醇的蛋白表面形成穩(wěn)定膜，會使產(chǎn)品的穩(wěn)定性大大加強(qiáng)，我們對各種表面活性劑進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)一定量的聚氧乙烯脂肪酸酯可以在白蛋白表面新成穩(wěn)定的表面膜。
[0005]由于聚氧乙烯脂肪酸酯，很多文獻(xiàn)報道聚氧乙烯脂肪酸酯尤其是吐溫80，在靜脈點滴時，用量超過lmg/mL會有產(chǎn)生致敏反應(yīng)，為此我們經(jīng)過了反復(fù)研究，限定了聚氧乙烯脂肪酸酯的用量，使其嚴(yán)格控制在0.04mg/ml以下，動物實驗研究表明，該濃度范圍的聚氧乙烯脂肪酸酯未產(chǎn)生致敏反應(yīng)，此外，嚴(yán)格控制吐溫80的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也非常重要。
[0006]有研究報道致敏反應(yīng)與吐溫80的酸值、色度以及水分含量有關(guān)，其中過高的酸值高可能是由于存在未參與酯化反應(yīng)的脂肪酸或是在生產(chǎn)貯存過程中發(fā)生了氧化反應(yīng)，生成了醛類或酸類物質(zhì)；較 高色度可能是由于原料油酸中的雜質(zhì)所造成；較高的水分含量可以加速產(chǎn)品的降解，生成游離脂肪酸，進(jìn)而導(dǎo)致酸值升高。吐溫80的脂肪酸鏈中除油酸外還含有亞油酸、亞麻酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸和硬脂酸等多種脂肪酸，由于組分復(fù)雜，對產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生了較大的影響。
[0007]為此，我們對聚氧乙烯脂肪酸酯中的脂肪酸含量進(jìn)行了研究，令人欣喜的發(fā)現(xiàn)油酸的含量對蛋白表面成膜使蛋白納米粒保持穩(wěn)定，顯的至關(guān)重要！我們對不同油酸含量的聚氧乙烯脂肪酸酯進(jìn)行了研究，經(jīng)過了反復(fù)研究和篩選，終于篩選出了油酸含量最佳的聚氧乙烯脂肪酸酯，通過對聚氧乙烯脂肪酸酯的用量和其油酸中的含量進(jìn)行了限定，很好的保證了產(chǎn)品的安全性。
[0008]人血白蛋白是通過低乙醇法或?qū)游龇◤娜梭w血液中提取的血漿蛋白制劑，但是血源產(chǎn)品的生產(chǎn)受到血源供應(yīng)的限制，不可避免地會有周期性缺貨發(fā)生，同時由于血液的來源不能完全得到控制，無法完全避免致病微生物的潛在威脅。日本首家研制成功了重組人血白蛋白并作為藥用輔料用于疫苗產(chǎn)品的生產(chǎn)，國內(nèi)如華北制藥、浙江海正藥業(yè)采用基因重組人血白蛋白項目采用現(xiàn)代生物技術(shù)，運用發(fā)酵生產(chǎn)重組人血清白蛋白的方案，大規(guī)模生產(chǎn)白蛋白產(chǎn)品，替代疫苗生產(chǎn)過程中作為培養(yǎng)基的血源白蛋白，降低血源產(chǎn)品的安全風(fēng)險。
[0009]利用現(xiàn)代大規(guī)模生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的重組人血白蛋白，同人血白蛋白相比具有純度高、防污染、可量產(chǎn)等優(yōu)點，專家分析認(rèn)為藥用輔料級及未來的藥用級重組人血白蛋白市場潛質(zhì)巨大，目前國內(nèi)已有廠家在申報中。
[0010]因此，該項目中白蛋白可以選擇人血來源，也可以選擇重組人血白蛋白。
[0011]制備工藝中，考慮到白蛋白在有氣泡和高剪切力的作用下容易變性，為避免制備過程中產(chǎn)生雜蛋白造成過敏反應(yīng)，我們采用了較低的高壓均化壓力和擠壓過濾相結(jié)合的工藝，盡可能使白蛋白損傷最小，使納米粒的平均粒徑控制在150nm以下,符合注射劑的要求。
[0012]綜上所述，我們通過研究篩選非離子表面活性劑種類，嚴(yán)格控制其中的各項指標(biāo)，采用溫和的制備工藝，制備了有臨床優(yōu)勢的可產(chǎn)業(yè)化的紫杉醇的固體蛋白納米粒，具有非?，F(xiàn)實的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明公開了一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，將紫杉醇溶解在適量有機(jī)溶劑中，充分分散在蛋白溶液中，使其結(jié)合在蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，加入適量蛋白表面穩(wěn)定劑，其中蛋白表面穩(wěn)定劑選自非離子表面活性劑，與蛋白的重量比為:0.1-10: 1000，優(yōu)選重量比為 1-5: 1000，更優(yōu)選 0.5-3: 1000。
[0014]本發(fā)明公開的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯脂肪酸酯，更優(yōu)選聚氧乙烯油酸酯，其中油酸在聚氧乙烯油酸酯中的含量為10-50%，優(yōu)選15-30%，其質(zhì)量控制方法采用GC法。
[0015]本發(fā)明公開了一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其中白蛋白可以是人血白蛋白，也可以是通過基因工程方法得到的重組人血白蛋白。
[0016]本發(fā)明公開了一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其中制備方法為將紫杉醇溶解在5-20倍量的有機(jī)溶劑中，充分分散在蛋白質(zhì)溶液中，加入處方量的表面活性劑，調(diào)節(jié)PH為3.0-6.0，分別通過0.45um和0.22um的濾膜擠壓過濾即得，有機(jī)溶劑選自氯仿或二氯甲燒。
[0017]本發(fā)明公開了一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其中制備方法為將紫杉醇溶解在8-15倍量的有機(jī)溶劑中，充分分散在蛋白質(zhì)溶液中，加入處方量的表面活性劑，調(diào)節(jié)PH為3.0-6.0，在200-600bar高壓均化法，分別通過0.45um、0.22um的濾膜擠壓過濾，除去有機(jī)溶劑，低溫冷凍干燥即得。
[0018]本發(fā)明公開了一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其中還含有生物相容性酸及鹽，所述生物相容性酸指鹽酸、磷酸或其金屬鈉鹽、檸檬酸或其金屬鈉鹽、草酸或其金屬納鹽、冰醋酸或其堿金屬鹽、氫氧化鈉、氫氧化鉀和碳酸鈉中的一種或幾種。
[0019]本發(fā)明聚氧乙烯脂肪酸酯(聚山梨酯80)中的聚氧乙基的含量測定方法如下:
[0020]本法系依據(jù)聚山梨酯80中的聚乙氧基(Polyethoxylated)和銨鈷硫氰酸鹽反應(yīng)形成藍(lán)色復(fù)合物，可溶于二氯甲烷，用比色法測定聚山梨酯80含量。
[0021]測定法:取供試品一瓶，用20ml去離子水溶解，取1.0ml于離心管中，加乙醇-氯化鈉飽和溶液5mL，搖勻，每分鐘3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，再用乙醇-氯化鈉飽和溶液1.0mL小心沖洗管壁，洗液與上清液合并，每分鐘3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，上清液置55°C水浴中，用空氣吹掃法將其濃縮至0.1~0.5mL，加ImL水溶解。準(zhǔn)確加入二氯甲烷4.0mLjt氰鈷銨溶液(稱取硝酸 鈷6.0g、硫氰酸銨40.0g,加水溶解并稀釋至200mL) 3.0mL,加塞，混勻，室溫放置1.5小時，每15分鐘振蕩I次，測定前靜置半小時，棄上層液，照紫外-可見分光光度法(附錄II A)，在波長620nm處測定下層二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白對照。
[0022]精密量取聚山梨酯80對照品溶液(取聚山梨酯80約lOOmg，精密稱定，加水溶解后置IOOmL量瓶中，加水稀釋至刻度)O μ L、25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L，加入預(yù)先加入ImL水的離心管中混勻，準(zhǔn)確加入二氯甲烷4.0mL、硫氰鈷銨溶液3.0mL，加塞，混勻，自“室溫放置1.5小時”起，同法操作。
[0023]用上述聚山梨酯80系列濃度(μ g/mL)與相應(yīng)的吸光度作直線回歸，相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.98，將供試品吸光度代入回歸方程，求得供試品聚山梨酯80含量(μ g/mL)。樣品中所含聚氧乙基與聚山梨酯80的換算方法為:
[0024]C(聚氧乙基)=C(聚山梨酯80) X0.8053
[0025]每瓶中的聚氧乙基含量為
[0026]M(聚氧乙基)=C(聚氧乙基)X20
[0027]油酸含量測定
[0028]①色譜條件:采用GC測定本品中油酸的含量
[0029]以丁二酸二乙二醇聚酯(PEGs)為固定相，涂布濃度為10%，柱溫165°C，氣化室215°C，檢測器215°C，載氣:高純氮150KPa，氫氣70KPa，空氣50KPa，氫火焰離子化檢測器(FID)。
[0030]②標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制:
[0031]取油酸對照品適量，精密稱定，用氯仿稀釋制成每ImL含1000、750、500、250、IOOyg的溶液，即得。
[0032]③供試品溶液的制備
[0033]取本品I瓶，加0.9%氯化鈉溶液20mL使內(nèi)容物分散后，加入2M的氫氧化鈉溶液20mL，30°C水溶中磁力攪拌12h后，加入2M的鹽酸溶液20mL中和，向其中加入20mL氯仿，渦旋30s，靜置分層后，棄掉上部水層，60°C水浴中，用氮吹法將其濃縮至5mL，即得。
[0034]④測定方法
[0035]取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液個5 μ L，分別注入GS記錄色譜圖，以濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸計算，每瓶中所含油酸量為
[0036]M(油酸)=C(油酸)Χ5
具體實施例:
[0037]具體實施例一:聚氧乙烯脂肪酸酯(吐溫80)與白蛋白不同重量比固體納米粒的制備
[0038]具體實施例一:
[0039]聚氧乙烯脂肪酸酯(吐溫80)與白蛋白不同重量比固體納米粒的制備[0040]聚氧乙烯脂肪酸酯(吐溫80)中聚氧乙基含量的測定:
[0041]測定法:取自制不同油酸含量的吐溫80 1.5mg，分別用20ml去離子水溶解，取
1.0ml于離心管中，加乙醇-氯化鈉飽和溶液5mL，搖勻，每分鐘3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液，再用乙醇-氯化鈉飽和溶液1.0mL小心沖洗管壁，洗液與上清液合并，每分鐘3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，上清液置55°C水浴中，用空氣吹掃法將其濃縮至0.1~0.5mL，加ImL水溶解。準(zhǔn)確加入二氯甲燒4.0mL、硫氰鈷銨溶液(稱取硝酸鈷6.0g、硫氰酸銨40.0g，加水溶解并稀釋至200mL)3.0mL，加塞，混勻，室溫放置1.5小時，每15分鐘振蕩I次，測定前靜置半小時，棄上層液，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2010版二部附錄II A)，在波長620nm處測定下層二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白對照。
[0042]精密量取聚氧乙烯脂肪酸酯(吐溫80)對照品溶液(取對照品約lOOmg，精密稱定，加水溶解后置IOOmL量瓶中，加水稀釋至刻度)O μ L、25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L，加入預(yù)先加入ImL水的離心管中混勻，準(zhǔn)確加入二氯甲烷4.0mL、硫氰鈷銨溶液3.0mL,加塞，混勻，自“室溫放置1.5小時”起，同法操作。
[0043]用上述吐溫80系列濃度(μ g/mL)與相應(yīng)的吸光度作直線回歸,相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.98，將供試品吸光度代入回歸方程，求得供試品吐溫80含量(yg/mL)。樣品中所含聚氧乙基與吐溫80的換算方法為:
[0044]C (聚氧乙基)=C (吐溫 80) X 0.8053
[0045]每瓶中的聚氧乙基含量為
[0046]M(聚氧乙基)=C(聚氧乙基)X20 ;
[0047]油酸含量測定
[0048]①色譜條件:采用GC測定本品中油酸的含量
[0049]以丁二酸二乙二醇聚酯(PEGs)為固定相，涂布濃度為10%，柱溫165°C，氣化室215°C，檢測器215°C，載氣:高純氮150KPa，氫氣70KPa，空氣50KPa，氫火焰離子化檢測器(FID)。
[0050]②標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制:
[0051]取油酸對照品適量，精密稱定，用氯仿稀釋制成每ImL含1000、750、500、250、IOOyg的溶液，即得。[0052]③供試品溶液的制備
[0053]取本品I瓶，加0.9%氯化鈉溶液20mL使內(nèi)容物分散后，加入2M的氫氧化鈉溶液20mL，30°C水溶中磁力攪拌12h后，加入2M的鹽酸溶液20mL中和，向其中加入20mL氯仿，渦旋30s，靜置分層后，棄掉上部水層，60°C水浴中，用氮吹法將其濃縮至5mL，即得。
[0054]④測定方法
[0055]取標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液5 μ L，分別注入GS記錄色譜圖，以濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸計算，每瓶中所含油酸量為
[0056]M(油酸)=C(油酸)Χ5
[0057]實驗結(jié)果如下:
[0058]1.標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種穩(wěn)定的包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其特征在于紫杉醇溶解在有機(jī)溶劑中，與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合，蛋白表面穩(wěn)定劑結(jié)合在蛋白表面形成穩(wěn)定的膜，其中蛋白表面穩(wěn)定劑選自非離子表面活性劑，與蛋白的重量比為:0.1-10: 1000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非離子表面活性劑，其特征在于選自聚氧乙烯脂肪酸酯，更優(yōu)選聚氧乙烯油酸酯，其中油酸在聚氧乙烯油酸酯中的含量為12-50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非離子表面活性劑，其特征在于表面穩(wěn)定劑蛋白的重量比優(yōu)選為 1-5: 1000，更優(yōu)選為 0.5-3: 1000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的非離子表面活性劑，其特征在于選自聚氧乙烯脂肪酸酯中油酸所占重量比優(yōu)選15-30%，其質(zhì)量控制方法采用GC法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其特征在于可以是人血白蛋白，也可以是通過基因工程方法得到的重組人血白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其特征在于制備方法為將紫杉醇溶解在5-20倍量的有機(jī)溶劑中，將紫杉醇有機(jī)溶劑溶液充分分散在蛋白質(zhì)溶液中，加入處方量的表面活性劑，調(diào)節(jié)PH為3.0-6.0，在200-800bar高壓均化法，分別通過0.45um、0.22um的濾膜擠壓過濾，除去有機(jī)溶劑，低溫冷凍干燥即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中一種包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒，其特征在于制備方法為將紫杉醇溶解在8-15倍量的有機(jī)溶劑中，充分分散在蛋白質(zhì)溶液中，加入處方量的表面活性劑，調(diào)節(jié)PH為3.0-6.0，在200-600bar高壓均化法，分別通過0.45um、0.22um的濾膜擠壓過濾，除去有機(jī)溶劑，低溫冷凍干燥即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或 4所述的包裹紫杉醇的固體蛋白納米粒制劑，其特征在于還含有生物相容性酸及鹽，所述生物相容性酸指鹽酸、磷酸或其金屬鈉鹽、檸檬酸或其金屬鈉鹽、草酸或其金屬納鹽、冰醋酸或其堿金屬鹽、氫氧化鈉、氫氧化鉀和碳酸鈉中的一種或幾種。
【文檔編號】A61P35/00GK103908430SQ201310003646
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月7日
【發(fā)明者】張文芳, 朱云峰, 李偉 申請人:蘇州納晶醫(yī)藥技術(shù)有限公司