N-羥基琥珀酰亞胺用于改善綴合物的穩(wěn)定性的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于在外源NHS存在的情況下產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括添加一定摩爾比的相對于在修飾反應(yīng)過程中作為雙官能接頭的水解/氨解的結(jié)果產(chǎn)生的NHS量的外源NHS。
【專利說明】N-羥基琥珀酰亞胺用于改善綴合物的穩(wěn)定性的用途
[0001] 交叉參考相關(guān)申請
[0002] 本專利申請要求2011年12月13提交的美國臨時(shí)專利申請No. 61/570, 139的利 益，將所述美國臨時(shí)專利申請通過引用并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 對癌癥和其它疾病的治療是有用的抗體-藥物綴合物通常由三個(gè)不同的元件組 成：細(xì)胞結(jié)合劑、接頭和細(xì)胞毒素劑。常用制劑方法之一包括修飾步驟，其中將細(xì)胞結(jié)合劑 與雙官能接頭反應(yīng)以形成共價(jià)地連接于具有反應(yīng)性基團(tuán)的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑；純化步驟， 其中將修飾抗體從修飾反應(yīng)的組分純化出來；綴合步驟，其中將修飾細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒 素劑反應(yīng)以從接頭（使用反應(yīng)性基團(tuán)）至細(xì)胞毒素劑形成共價(jià)化學(xué)價(jià)；和第二純化步驟，其 中將綴合物從綴合反應(yīng)的其它組分純化出來。
[0005] 盡管在制備抗體-藥物綴合物上取得了進(jìn)展，但目前的方法受到幾個(gè)因素限制。 例如，雙官能交聯(lián)劑對抗體的結(jié)合在本領(lǐng)域中目前使用的條件下是異質(zhì)的，這導(dǎo)致包含穩(wěn) 定的酰胺鍵和不穩(wěn)定的酯鍵的綴合物。據(jù)認(rèn)為綴合物中不穩(wěn)定酯鍵的存在導(dǎo)致藥物從綴合 物釋放和綴合物的不穩(wěn)定性。
[0006] 最近的臨床試驗(yàn)已顯示抗體-藥物綴合物在治療許多不同類型的癌癥中的有前 景的作用。因此，存在對改進(jìn)的制備更穩(wěn)定的并且比由目前的方法產(chǎn)生的抗體-藥物綴合 物更純的抗體-藥物綴合物的方法的需要。本發(fā)明提供了這樣的方法。本發(fā)明的這些和其 它有利方面以及另外的發(fā)明特征根據(jù)本文中提供的本發(fā)明的描述將變得顯然。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供了用于在外源N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)存在的情況下制造具有改善 的穩(wěn)定性的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法。
[0009] 發(fā)明詳述
[0010] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的抗體的綴合物（"抗 體-細(xì)胞毒素劑綴合物"）通常如下進(jìn)行制備：利用雙官能交聯(lián)試劑（通常利用交聯(lián)試劑上 的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)反應(yīng)基團(tuán)）修飾抗體，純化具有連接于其的接頭的抗體，將細(xì) 胞毒素劑綴合于具有連接于其的接頭的抗體，和純化抗體-細(xì)胞毒素劑綴合物。本發(fā)明通 過使穩(wěn)定地鍵合于細(xì)胞結(jié)合劑的接頭的量減少至最少和使導(dǎo)致綴合物不穩(wěn)定性的不期望 的副反應(yīng)降至最低來改進(jìn)這樣的方法。
[0011] 作為雙官能接頭（例如，SPP、STOB、SMCC)的水解/氨解的結(jié)果，在修飾反應(yīng)過程 中產(chǎn)生少量NHS。NHS目前被本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)作修飾反應(yīng)的不期望的（或至少中性）副 產(chǎn)物。因此，目前的方法通常包括在添加細(xì)胞毒素劑之前純化修飾抗體，這導(dǎo)致在綴合反應(yīng) 之前NHS的除去。
[0012] 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在外源NHS存在的情況下制備抗體-細(xì)胞毒素劑綴合物導(dǎo)致綴 合物的穩(wěn)定性的顯著增加，如通過游離類美登素的釋放測量的。因此，本發(fā)明提供了用于在 外源NHS存在的情況下制造具有改善的穩(wěn)定性的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法。
[0013] 本發(fā)明提供了用于制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括添 加外源NHS。如本文中所用，"外源NHS"是指在方法過程中從外部來源添加的NHS，并且不 是指在修飾反應(yīng)過程中作為雙官能接頭的水解/氨解的結(jié)果產(chǎn)生的NHS。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的 方法,所述方法包括添加約0. ImM至約300mM的外源NHS。例如，本發(fā)明的方法包括添加 約 0· ImM、約 0· 2mM、約 0· 3mM、約 0· 4mM、約 0· 5mM、約 0· 6mM、約 0· 7mM、約 0· 8mM、約 0· 9mM、 約 L OmM、約 L ImM、約 L 3mM、約 L 5mM、約 L 7mM、約 L 9mM、約 2. OmM、約 2. ImM、約 2. 3mM、 約 2. 5mM、約 2. 7mM、約 2. 9mM、約 3. OmM、約 3. ImM、約 3. 3mM、約 3. 5mM、約 3. 7mM、約 3. 9mM、 約 4. OmM、約 4. ImM、約 4. 3mM、約 4. 5mM、約 4. 7mM、約 4. 9mM、約 5. OmM、約 5. ImM、約 5. 3mM、 約 5. 5mM、約 5. 7mM、約 5. 9mM、約 6. OmM、約 6. ImM、約 6. 3mM、約 6. 5mM、約 6. 7mM、約 6. 9mM、 約 7. OmM、約 7. ImM、約 7. 3mM、約 7. 5mM、約 7. 7mM、約 7. 9mM、約 8. OmM、約 8. ImM、約 8. 3mM、 約 8. 5mM、約 8. 7mM、約 8. 9mM、約 9. OmM、約 9. ImM、約 9. 3mM、約 9. 5mM、約 9. 7mM、約 9. 9mM、 約 10mM、約 llmM、約 12mM、約 13mM、約 14mM、約 15mM、約 16mM、約 17mM、約 18mM、約 19mM、 約 20mM、約 25mM、約 30mM、約 35mM、約 40mM、約 45mM、約 50mM、約 55mM、約 60mM、約 65mM、約 70mM、約 75mM、約 80mM、約 85mM、約 90mM、約 95mM、約 lOOmM、約 llOmM、約 120mM、約 130mM、 約 140mM、約 150mM、約 160mM、約 170mM、約 180mM、約 190mM、約 200mM、約 210mM、約 220mM、 約 230mM、約 240mM、約 250mM、約 260mM、約 270mM、約 280mM、約 290mM 或約 300mM 外源 NHS。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括添加約〇. ImM至約5mM、約0. ImM至約10mM、約1. OmM 至約5mM、約1. OmM至約10mM、約5. OmM至約10mM、約10mM至約20mM、約20mM至約30mM、 約30mM至約40mM、約40mM至約50mM、約50mM至約60mM、約60mM至約70mM、約70mM至約 80mM、約 80mM 至約 90mM、約 90mM 至約 100mM、約 100mM 至約 llOmM、約 llOmM 至約 120mM、約 120mM 至約 130mM、約 130mM 至約 140mM、約 140mM 至約 150mM、約 150mM 至約 160mM、約 160mM 至約 170mM、約 170mM 至約 180mM、約 180mM 至約 190mM、約 190mM 至約 200mM、約 200mM 至 約 220mM、約 220mM 至約 240mM、約 240mM 至約 260mM、約 260mM 至約 280mM 或約 280mM 至約 300mM外源NHS。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括添加約10mM至約200mM、約20至 約150mM、約50至約150mM或約20至約100mM外源NHS。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括添加相對于作為雙官能接頭的水解/氨解 的結(jié)果在修飾反應(yīng)過程中產(chǎn)生的NHS的量的一定摩爾比的外源NHS。本領(lǐng)域技術(shù)人員可測 定在特定修飾過程中產(chǎn)生的NHS的量，因?yàn)楫a(chǎn)生的NHS的量基本上與使用的雙官能接頭的 量相等。本領(lǐng)域技術(shù)人員隨后可向反應(yīng)混合物中添加相對于在修飾反應(yīng)中產(chǎn)生的NHS的量 的一定摩爾比的外源NHS。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對于在修飾反應(yīng)過程中產(chǎn)生的NHS的量添 加約2至約200倍的外源NHS。例如，本發(fā)明的方法包括添加相對于在修飾反應(yīng)中產(chǎn)生的 NHS的量約2倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約50倍、約100倍、或約200 倍的外源NHS。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括添加相對于雙官能接頭的量的一定摩爾 比的外源NHS。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源NHS對雙官能交聯(lián)試劑的摩爾比為約0. 5至約 1000(例如，約1至約900、約5至約750、約50至約500、約100至約500、約0. 5至約500 或約100至約1000)。例如，本發(fā)明的方法包含相對于雙官能接頭的量約0. 5倍、約1倍、約 2倍、約5、約10倍、約15、約20倍、約25、約50倍、約100倍、約200倍、約300倍、約400 倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900或約1000倍的NHS。
[0017] 已描述了許多用于制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法（參見，例如， 美國臨時(shí)專利申請No. 61/468, 997、美國專利5, 208, 020、美國專利6, 441，163、美國專利 7, 811，572、美國專利申請公布No. 2006/0182750、美國專利申請公布No. 2008/0145374、美 國專利申請公布No. 2011/0003969和美國專利申請公布No. 2012/0253021)。本 申請人:已 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在用于制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法的過程中在任意點(diǎn)上 外源NHS的添加對綴合物穩(wěn)定性具有有益效應(yīng)。因此，本發(fā)明的方法包括在制備細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法的過程中在任意點(diǎn)上添加外源NHS。例如，本發(fā)明的方法包 括將外源NHS添加至修飾步驟（即，其中將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能接頭反應(yīng)的步驟）、綴合步 驟（即，其中將修飾細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)的步驟）、純化步驟或在前述步驟的任何 步驟之間的保持步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將外源NHS添加至修飾步驟 (即，將NHS添加至修飾反應(yīng)）、修飾步驟與純化步驟之間的保持步驟、修飾步驟與綴合步驟 之間的保持步驟、純化步驟、綴合步驟、綴合步驟與純化步驟之間的保持步驟和/或兩個(gè)純 化步驟之間的保持步驟。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑 的方法，所述方法包括在外源NHS存在的情況下將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑反應(yīng)，以 將接頭共價(jià)地連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的混合 物。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的方法，將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑（即，修飾反應(yīng)）接觸產(chǎn)生包 含具有連接于其的細(xì)胞結(jié)合劑以及反應(yīng)物和其它副產(chǎn)物的第一混合物。在本發(fā)明的一些實(shí) 施中，第一混合物包含具有穩(wěn)定和不穩(wěn)定地鍵合于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑以及反應(yīng)物和其 它副產(chǎn)物。當(dāng)接頭與細(xì)胞結(jié)合劑之間的共價(jià)鍵在正常貯存條件下在一段時(shí)期（所述時(shí)期可 從數(shù)月變化至數(shù)年）內(nèi)未被顯著削弱或斷裂時(shí)，接頭被"穩(wěn)定地"鍵合于細(xì)胞結(jié)合劑。相反 地，當(dāng)接頭與細(xì)胞結(jié)合劑之間的共價(jià)鍵在正常貯存條件下在一段時(shí)期（所述時(shí)期可從數(shù)月 變化至數(shù)年）內(nèi)被顯著削弱或斷裂，則接頭被"不穩(wěn)定地"鍵合于細(xì)胞結(jié)合劑。
[0020] 修飾反應(yīng)優(yōu)選在約4至約pH9的pH (例如，約4. 5至約8. 5、約5至約8、約5. 5至 約7. 5、約6至約7、約6至約8、約6至約9或約6. 5至約7. 5的pH)下進(jìn)行。在一些實(shí)施 方案中，修飾反應(yīng)在約6至約8的pH(例如，約6、約6. 5、約7、約7. 5或約8的pH)下進(jìn)行。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，修飾細(xì)胞結(jié)合劑從反應(yīng)和副產(chǎn)物的純化通過將第一 混合物經(jīng)歷純化法來進(jìn)行。在這一點(diǎn)上，第一混合物可使用切向流過濾（TFF)例如基于膜 的切向流過濾法、非吸附色譜、吸附色譜、吸附過濾或選擇性沉淀或任何其它適當(dāng)?shù)募兓?以及其組合來進(jìn)行純化。該第一純化步驟提供了純化的第一混合物，即相較于在根據(jù)本發(fā) 明的純化之前的第一混合物增加的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的濃度和減少的未 鍵結(jié)合的雙官能交聯(lián)試劑的量。優(yōu)選地，第一混合物使用切向流過濾來進(jìn)行純化。
[0022] 在純化第一混合物以獲得具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的純化的第一混合 物后，通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑在具有約4至約9的pH的溶 液中反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑綴合于第一純化的混合物中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合 齊U，從而形成第二混合物，其中產(chǎn)生包含（i)通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié) 合劑、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物。
[0023] 任選地，可省略修飾細(xì)胞結(jié)合劑的純化。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，未將 包含具有連接于其的細(xì)胞結(jié)合劑以及反應(yīng)物和其它副產(chǎn)物的第一混合物經(jīng)歷純化法。在這 樣的情況下，可將細(xì)胞毒素劑與交聯(lián)試劑同時(shí)添加，或可一些更晚的點(diǎn)，例如在將交聯(lián)試劑 添加至細(xì)胞結(jié)合劑后1、2、3或更多個(gè)小時(shí)添加細(xì)胞毒素劑。通過將修飾細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞 毒素劑在具有約4至約9的pH的溶液中反應(yīng)來將修飾細(xì)胞結(jié)合劑綴合于細(xì)胞毒素劑（例 如，類美登素），其中綴合步驟導(dǎo)致穩(wěn)定的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、非穩(wěn)定的細(xì)胞 結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、非綴合細(xì)胞毒素劑（即，"游離"細(xì)胞毒素劑）、反應(yīng)物和副產(chǎn) 物的混合物的形成。
[0024] 綴合反應(yīng)優(yōu)選在約4至約pH9的pH(例如，約4. 5至約8. 5、約5至約8、約5. 5至 約7. 5、約6. 0至約7或約6. 5至約7. 5的pH)下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，綴合反應(yīng)在約 6 至約 6. 5 的 pH(例如，5. 5 至 7 的 ρΗ、5· 7 至 6. 8 的 ρΗ、5· 8 至 6. 7 的 ρΗ、5· 9 至 6. 6 的 pH 或6至6. 5的pH、）、約6或更低的pH(例如，約4至6、約4至約5. 5、約5至6的pH)或約 6. 5或更高的pH(例如，6. 5至約9、約6. 5至約7、約7至約9、約7. 5至約9或6. 5至約8 的pH)下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合反應(yīng)在約4的pH至低于6的pH下或在高于6. 5 至9的pH下進(jìn)行。當(dāng)綴合步驟在約6. 5或更高的pH下進(jìn)行時(shí)，一些含巰基細(xì)胞毒素劑可 易于通過二硫鍵形成二聚化。在一個(gè)實(shí)施方案中，可能需要從反應(yīng)混合物除去痕量金屬和 /或氧以及任選地添加抗氧化劑或使用具有更具反應(yīng)性的離去基團(tuán)的接頭或以超過一個(gè)等 分添加細(xì)胞毒素劑來使得在這樣的情況下能夠進(jìn)行高效反應(yīng)。
[0025] 本發(fā)明的方法可任選地包括將蔗糖添加至用于本發(fā)明的方法的綴合步驟，以增加 細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的穩(wěn)定性和回收。令人想要地，以約〇. 1% (w/v)至約20% (w/v)(例如，約 0.1% (w/v)、l% (w/v)、5% (w/v)、10% (w/v)、15% (w/v)或 20% (w/v)) 的濃度添加鹿糖。優(yōu)選地，以約1% (w/v)至10% (w/v)(例如，（例如，約0. 5% (w/v)、約 1% (w/v)、約 1.5% (w/v)、約 2% (w/v)、約 3% (w/v)、約 4% (w/v)、約 5% (w/v)、約 6% (w/v)、約 7 % (w/v)、約 8 % (w/v)、約 9 % (w/v)、約 10 % (w/v)或約 11 % (w/v))的濃度 添加蔗糖。此外，綴合反應(yīng)還可包括緩沖劑的添加?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)木彌_ 齊[J。適當(dāng)?shù)木彌_劑包括例如檸檬酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖 齊U。在優(yōu)選實(shí)施方案中，緩沖劑選自HEPPSO (N- (2-羥乙基）哌嗪-Ν' - (2-羥基丙磺酸））、 P0PS0 (哌嗪-1，4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸）脫水物）、HEPES (4- (2-羥乙基）哌嗪-1-乙 磺酸）、HEPPS(EPPS) (4-(2-羥乙基）哌嗪-1-丙磺酸）、TES(N-[三（羥甲基）甲基]-2-氨 基乙磺酸）及其組合。
[0026] 在綴合步驟后，將綴合物經(jīng)歷純化步驟。在這一點(diǎn)上，綴合混合物可使用切向流過 濾（TFF)例如基于膜的切向流過濾法、非吸附色譜、吸附色譜、吸附過濾或選擇性沉淀或任 何其它適當(dāng)純化法以及其組合來純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，綴合步驟后的純化使得能 夠分離包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的穩(wěn)定的綴合物。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì) 胞結(jié)合劑的綴合物的方法，所述方法包括在修飾步驟后的第一純化步驟和在第綴合步驟 后的第二純化步驟，其中方法包括外源NHS?？稍诒景l(fā)明的方法過程中的任意點(diǎn)上添加外 源NHS(即，至修飾步驟、至綴合步驟、至純化步驟或至上述步驟的任一個(gè)之間的的保持步 驟）。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒 素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括（a)將細(xì)胞結(jié) 合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸，以將接頭共價(jià)地連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接 于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物，（b)將第一混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、 非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，從而制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的 純化的第一混合物，（c)通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)來將 細(xì)胞毒素劑綴合于純化的第一混合物中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包 含（i)含有通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴 合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物，和（d)將第二混合物經(jīng)歷 切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì) 胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑 綴合物的純化的第二混合物，其中在步驟（a)期間或之后以及在步驟（c)之前添加外源 NHS (即，在外源NHS存在的情況下進(jìn)行步驟步驟（a)中的接觸，所述方法包括在外源NHS存 在的情況下在步驟（a)之后保持混合物，在步驟（b)中添加外源NHS和/或方法包括在外源 NHS存在的情況下在步驟（b)之后保持第一混合物）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素 劑綴合物的方法，方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)連接 于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物，（b)將第一 混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，從而制備 具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的純化的第一混合物，（c)通過將具有連接于其的接頭 的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑 綴合于純化的第一混合物中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有 通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii) 游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物，和（d)將第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、 選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合 物從第二混合物的其它組分純化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的 第二混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì) 胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié) 合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接于 其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物，（b)將第一混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非 吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，從而制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的純 化的第一混合物，（c)通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)來將細(xì) 胞毒素劑綴合于純化的第一混合物中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含 (i)含有通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合 物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物，（d)在外源N-羥基琥珀酰亞 胺存在的情況下溫育第二混合物；和（e)在步驟（d)之后將第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選 擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物 從第二混合物的其它組分純化出來，從而制備通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié) 合劑的純化的第二混合物。
[0028] 本文中描述的任何純化法可用于本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在 純化步驟中使用切向流過濾（TFF，也稱為交叉流過濾、超濾和滲濾）和/或吸附色譜樹脂。 例如，本發(fā)明的方法可包含在修飾步驟后使用TFF的第一純化步驟和在綴合步驟后使用 TFF的第二純化步驟。或者，本發(fā)明的方法可包括在修飾步驟后使用吸附色譜的第一純化步 驟和在綴合步驟后使用吸附色譜的第二純化步驟。本發(fā)明的方法還可包括在修飾步驟后使 用吸附色譜的第一純化步驟和在綴合步驟后使用TFF的第二純化步驟，或在修飾步驟后使 用TFF的第一純化步驟和在綴合步驟后使用吸附色譜的第二純化步驟。
[0029] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將非吸附色譜用作純化步驟。例如，本發(fā)明的方法可 包括在修飾步驟后使用非吸附色譜的第二純化步驟和在綴合步驟后使用非吸附色譜的第 二純化步驟。
[0030] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì) 胞結(jié)合劑的綴合物的方法，其中在修飾反應(yīng)后和在綴合反應(yīng)前，未將包含具有連接于其的 接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物經(jīng)歷，并且其中所述方法包括外源NHS?？稍谠诒景l(fā)明的 方法過程中的任意點(diǎn)上添加外源NHS(即，至修飾步驟、至綴合步驟、至純化步驟或至上述 步驟的任一個(gè)之間的保持步驟）。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通 過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法， 所述方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于細(xì)胞結(jié)合 齊U，從而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物，（b)通過將具有連接于 其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑綴合于第一混合物中的具有連 接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有通過接頭偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié) 合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二 混合物，和（c)將第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色 譜或其組合，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出來，從 而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物，其中在步驟（a)的過程中或 之后和在步驟（b)之前添加外源N-羥基琥珀酰亞胺（S卩，在外源NHS存在的情況下進(jìn)行步 驟（a)中的接觸和/或所述方法包括在外源NHS存在的情況下在步驟（a)之后保持第一混 合物）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒 素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié) 合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接于其 的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物，（b)通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞 毒素劑在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑綴合于第一混合物中 的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有通過接頭偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑 的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn) 物的第二混合物，和（c)將第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過 濾、吸附色譜或其組合，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純 化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的綴合 物的方法，所述方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接 于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物，（b)通過將 具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑綴合于第一混合物 中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì) 胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii) 反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物，（c)在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下溫育第二混合物； 和（d)將第二混合物在步驟（c)之后經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、 吸附色譜或其組合，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出 來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。本文中描述的任何純 化法可用作綴合反應(yīng)后的純化步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將切向流過濾、吸附色譜或非吸附 色譜用作綴合反應(yīng)后的純化步驟。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì) 胞結(jié)合劑的綴合物的方法，其中將修飾反應(yīng)和綴合反應(yīng)組合入單個(gè)步驟，隨后進(jìn)行純化步 驟（如在美國臨時(shí)專利申請No. 61/468, 997和美國專利申請公布No. 2012/0253021中描述 的），并且其中方法包括外源NHS?？稍诒景l(fā)明的方法過程中的任意點(diǎn)上添加外源NHS (即， 至組合修飾/綴合步驟、至純化步驟或至上述步驟之間的保持步驟）。因此，在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞 結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑在外源 N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下接觸以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒素劑的第一混合物， 隨后將第一混合物與包含接頭的雙官能交聯(lián)試劑在具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以 提供包含（i)含有通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒 素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物；和（b)將第二混合 物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第二混合物的其它組分純化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒 素劑綴合物的純化的第二混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過 接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所 述方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑接觸以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒素劑的 第一混合物，隨后將第一混合物與包含接頭的雙官能交聯(lián)試劑在外源N-羥基琥珀酰亞胺 存在的情況下于具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過述接頭化 學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒 素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物；和（b)將第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉 淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第 二混合物的其它組分純化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混 合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素 劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，方法包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與 細(xì)胞毒素劑接觸以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒素劑的第一混合物，隨后將第一混合物與 包含接頭的雙官能交聯(lián)試劑于具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通 過述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii) 游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物；(b)在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的 情況下溫育第二混合物；和（c)將第二混合物在步驟（b)之后經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉 淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第 二混合物的其它組分純化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混 合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在將第一混合物與雙官能交聯(lián)試劑接觸后立即進(jìn)行步驟（b)的 溫育（即，在組合修飾/綴合步驟后的保持步驟）。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將第二混合 物經(jīng)歷步驟（a)與（b)之間的純化步驟，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從第二混合 物的其它組分純化出來，從而在保持步驟之前（即，在步驟（b)之前）制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì) 胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。本文中描述的任何純化法可用于本發(fā)明的方法。在 優(yōu)選實(shí)施方案中，切向流過濾、吸附色譜或非吸附色譜用作純化步驟。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì) 胞結(jié)合劑的綴合物的方法，其中所述方法包括將預(yù)形成的細(xì)胞毒素劑-接頭化合物綴 合于細(xì)胞結(jié)合劑，如美國專利6, 441，163以及美國專利申請公布No. 2011/0003969和 2008/0145374中描述的，并且其中方法包括外源NHS。可在本發(fā)明的方法的過程中的任意 點(diǎn)上添加外源NHS(即，至綴合步驟、至純化步驟或上述步驟之間的保持步驟）。例如，在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合 劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括（a)將細(xì)胞結(jié)合劑與包含化學(xué) 地偶聯(lián)于接頭的細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞毒素劑-接頭化合物接觸，以將細(xì)胞毒素劑-接頭化合 物共價(jià)地連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含含有通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞 結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的混合物和（b)將包含細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑 綴合物的混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合， 以純化綴合物，其中在步驟（a)期間或之后和在步驟（b)之前添加外源N-羥基琥珀酰亞胺 (即，在外源NHS存在的情況下進(jìn)行步驟（a)中的接觸或方法包括在外源NHS存在的情況下 在（a)之后保持混合物）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含通過接頭化 學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法 包括：(a)將細(xì)胞結(jié)合劑與包含化學(xué)地偶聯(lián)于接頭的細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞毒素劑-接頭化合 物接觸，以將細(xì)胞毒素劑-接頭化合物共價(jià)地連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含含有通過 接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的混合物； (b)在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下溫育步驟（a)的混合物；和（c)將混合物在步 驟（b)后經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以將細(xì) 胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從混合物的其它組分純化出來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞 毒素劑綴合物的純化的混合物。方法任選地包括將步驟（a)的混合物經(jīng)歷步驟（a)與（b) 之間的純化，以將細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從混合物的其它組合分純化出來，從而 在保持步驟（步驟（b))之前制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的混合物。步驟 (a)與（b)之間的純化步驟任選地在外源NHS存在的情況下進(jìn)行。本文中描述的任何純化 法可用于本發(fā)明的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，切向流過濾、吸附色譜或非吸附色譜用作純化 步驟。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將細(xì)胞毒素劑與包含接頭雙官能交聯(lián)試劑接觸來制備細(xì) 胞毒素劑-接頭化合物，以將細(xì)胞毒素劑共價(jià)地連接于接頭。在將細(xì)胞毒素劑-接頭化合 物與細(xì)胞結(jié)合劑接觸之前，將細(xì)胞毒素劑-接頭化合物任選地經(jīng)歷純化。
[0034] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在綴合步驟后兩個(gè)分開的純化步 驟?？稍谕庠碞HS存在的情況下進(jìn)行綴合反應(yīng)后的純化步驟。例如，本發(fā)明的方法可包括 綴合步驟，隨后進(jìn)行純化步驟（在外源NHS不存在或存在的情況下），隨后在外源NHS存在 的情況下進(jìn)行保持步驟，隨后進(jìn)行另一個(gè)純化步驟。本文中描述的任何純化法可用作綴合 反應(yīng)后的純化步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，切向流過濾、吸附色譜、非吸附色譜或其組合在綴 合反應(yīng)后用作純化步驟。
[0035] 任何適當(dāng)?shù)腡FF系統(tǒng)可用于純化，包括Pell icon型系統(tǒng) (Millipore, Billerica, ΜΑ) > Sartocon Cassette 系統(tǒng)（Sartorius AG, Edgewood, NY)和 Centrasette 型系統(tǒng)（Pall Corp.，East Hills, NY)。
[0036] 任何適當(dāng)?shù)奈缴V樹脂可用于純化。優(yōu)選吸附色譜樹脂包括羥基磷灰石色 譜法、疏水性電荷誘導(dǎo)色譜法（HCIC)、疏水相互作用色譜法（HIC)、離了交換色譜法、混 合模式離子交換色譜法、固定金屬親和色譜法（IMAC)、染料配體色譜法、親和色譜法、反 相色譜法及其組合。適當(dāng)?shù)牧u基磷灰石樹脂的實(shí)例包括陶瓷羥基磷灰石（CHT I型和II 型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)、HA Ultrogel 輕基憐灰石（Pall Corp.，East Hills, NY)和陶瓷氟憐灰石（CFT I 型和 II 型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當(dāng) 的HCIC樹脂的實(shí)例為MEP Hypercel樹脂（Pall Corp.，East Hills, NY)。適當(dāng)?shù)腍IC樹脂的 實(shí)例包括丁基-Sepharose、己基-Sepaharose、苯基-Sepharose和辛基Sepharose樹脂（全 部來自 GE Healthcare, Piscataway，NJ)以及 Macro-prep 甲基和 Macro-Prep 叔-丁基樹 脂（Biorad Laboratories, Hercules, CA)。適當(dāng)?shù)碾x子交換樹脂的實(shí)例包括SP-Sepharose、 CM-Sepharose 和 Q-Sepharose 樹脂（全部來自 GE Healthcare, Piscataway, NJ)以及 Unosphere S 樹脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當(dāng)?shù)幕旌夏Ｊ诫x子交換 劑的實(shí)例包括 Bakerbond ABx 樹脂（JT Baker，Phillipsburg NJ)。適當(dāng)?shù)?IMAC 樹脂 的實(shí)例包括螯合 Sepharose 樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Profinity IMAC 樹脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當(dāng)?shù)娜玖吓潴w樹脂的實(shí)例包括Blue Sepharose 樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Affi-gel Blue 樹脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。適當(dāng)?shù)挠H和樹脂的實(shí)例包括蛋白A Sepharose樹脂（例 如，MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ)，其中細(xì)胞結(jié)合劑為抗體，和外源凝集素 親和樹脂例如兵豆屬植物外源凝集素 Sepharose樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)， 其中細(xì)胞結(jié)合劑具有適當(dāng)?shù)耐庠茨亟Y(jié)合部位?；蛘?，可使用對于細(xì)胞結(jié)合 劑是特異的抗體。可將這樣的抗體固定于例如Sepharose 4Fast Flow樹脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)。適當(dāng)?shù)姆聪鄻渲膶?shí)例包括C4、C8和C18樹脂（Grace Vydac，Hesperia, CA)〇
[0037] 任何適當(dāng)?shù)姆俏缴V樹脂可用于純化。適當(dāng)?shù)姆俏缴V樹脂的實(shí)例包括但不 限于 SEPHADEX? G-25、G-50、G-100、SEPHACRYL? 樹脂（例如，S-200 和 S-300)、SUPERDEX? 樹脂（例如，SUPERDEX?75 和 SUPERDEX?200)、BIO-GEL?樹脂（例如，P-6、P-10、P-30、 P-60和P-100)以及對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的其它樹脂。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在外源NHS存在的情況下包括一個(gè)或多 個(gè)（例如，一、二或三個(gè)）保持步驟（S卩，將外源NHS添加至保持步驟），以將不穩(wěn)定地結(jié)合的 接頭從細(xì)胞結(jié)合劑釋放。保持步驟包括在用雙官能交聯(lián)試劑修飾細(xì)胞結(jié)合劑后，在將細(xì)胞 毒素劑綴合于具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑后，和/或在純化步驟之后保持混合物。
[0039] 保持步驟包括將溶液維持在適當(dāng)?shù)臏囟龋ɡ纾s2°C至約37°C )進(jìn)行適當(dāng)?shù)臅r(shí) 期（例如，約1小時(shí)至約1周）以從細(xì)胞結(jié)合劑釋放不穩(wěn)定結(jié)合的接頭，同時(shí)大體上不從細(xì) 胞結(jié)合劑釋放穩(wěn)定結(jié)合的接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，保持步驟包括將溶液維持在低溫（例 如，約2°C至約10°C或約4°C )、室溫（例如，約20°C至約30°C或約20°C至約25°C )或升高 的溫度（例如，約30°C至約37°C )。
[0040] 保持步驟的持續(xù)時(shí)間取決于進(jìn)行維持步驟時(shí)的溫度。例如，保持步驟的持續(xù)時(shí)間 可通過在升高的溫度上進(jìn)行保持步驟來顯著減少，最大溫度受限于細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素 劑綴合物的穩(wěn)定性。保持步驟可包括維持溶液約1小時(shí)至約1天（例如，約1小時(shí)、約2小 時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約7小時(shí)、約8小時(shí)、約9小時(shí)、約10小時(shí)、約 12小時(shí)、約14小時(shí)、約16小時(shí)、約18小時(shí)、約20小時(shí)、約22小時(shí)或約24小時(shí)），約5小時(shí) 至約1周，約12小時(shí)至約1周（例如，約12小時(shí)、約16小時(shí)、約20小時(shí)、約24小時(shí)、約2 天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天），進(jìn)行約12小時(shí)至約1周（例如，約12小時(shí)、 約16小時(shí)、約20小時(shí)、約24小時(shí)、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天）或約 1天至約1周。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，保持步驟包括將溶液維持在約2°C至約8°C的溫度，進(jìn)行至少 約12小時(shí)直至1天的時(shí)間。
[0042] 用于保持步驟的pH值優(yōu)選為約4至約9 (例如，約4. 5至約8. 5或約5至約8)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于保持步驟的pH值從約5變化至約7. 5 (例如，約5. 5至約7. 5、約6 至約7. 5、約6. 5至約7. 5、約7至約7. 5、約5至約7、約5至約6. 5、約5至約5. 5、約5. 5 至約7、約6至約6. 5或約6至約7)。例如，用于保持步驟的pH值可以為約4、約4. 5、約5、 約5. 5、約6、約6. 5、約7、約7. 5、約8、約8. 5或約9。
[0043] 可在將細(xì)胞結(jié)合劑綴合于細(xì)胞毒素劑之前或之后進(jìn)行保持步驟。在一個(gè)實(shí)施方案 中，在用雙官能交聯(lián)試劑修飾細(xì)胞結(jié)合劑之后直接進(jìn)行保持步驟。例如，本發(fā)明的方法包括 在用雙官能交聯(lián)試劑修飾細(xì)胞結(jié)合劑之后并且在綴合之前進(jìn)行保持步驟。在修飾細(xì)胞結(jié)合 劑后，可在保持步驟之前和/或保持步驟之后，但在綴合步驟之前進(jìn)行純化。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，在將細(xì)胞毒素劑綴合于具有連接于其的細(xì)胞結(jié)合劑之后并且在純化步驟之前直接 進(jìn)行保持步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在綴合和純化步驟之前進(jìn)行保持步驟，隨后進(jìn)行另外 的純化步驟。
[0044] 在具體實(shí)施方案中，保持步驟可包括在約2°C至約室溫在于約5-7. 5或約6. 5-7. 5 的pH下溫育混合物約1小時(shí)至約1周。
[0045] 本發(fā)明提供了用于制備包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的穩(wěn)定綴合 物的組合物的方法，其中所述組合物大體上不含不穩(wěn)定的綴合物。在這方面，本發(fā)明提供了 用于制備具有顯著高的純度和穩(wěn)定性的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法。由綴合物 的高純度和穩(wěn)定性，這樣的組合物可用于治療疾病。包含化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑例如類 美登素的細(xì)胞結(jié)合劑例如抗體的組合物描述于例如美國專利7, 374, 762和美國專利申請 公布No. 2007/0031402中。在本發(fā)明的一個(gè)方面，具有顯著地高的純度的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì) 胞毒素劑綴合物下列特征的一個(gè)或多個(gè)特征：（a)大于約90% (例如，大于或等于約91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)，優(yōu)選大于約95%的綴合物種類是 單體的，（b)綴合物制劑中未綴合接頭水平低于約10% (例如，少于或等于約9%、8%、7%、 6<%、5<%、4<%、3 <%、2(%、1(%或0(%)(相對于總的接頭）、（(3)少于10 (%的綴合物種類被交 聯(lián)（例如，少于或等于約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)，（(1)綴合物制 劑中的游離細(xì)胞毒素劑水平少于約2% (例如，少于或等于約1. 9%、1. 8%、1. 7%、1. 6%、 1. 5 %U. 4 %U. 3 %U. 2 %U. 1 %>1. Ο %>0. 9 %,0. 8 %,0. 7 %,0. 6 %,0. 5 %,0. 4 %, 0. 3%、0. 2%、0. 1%或0% )(相對于總的細(xì)胞毒素劑），和/或（e)貯存后（例如，在約1 周、約2周、約3周、約1月、約2月、約3月、約4月、約5月、約6月、約1年、約2年或約5 年后）游離細(xì)胞毒素劑水無顯著升高。游離細(xì)胞毒素劑水平的"顯著升高"意指在一定的 貯存時(shí)間后，游離細(xì)胞毒素劑的水平的升高少于約〇. 1 %、約〇. 2%、約0. 3%、約0. 4%、約 0. 5%、約 0. 6%、約 0. 7%、約 0. 8%、約 0. 9%、約 1. 0%、約 1. 1 %、約 1. 2%、約 1. 3%、約 1. 4%、約 1. 5%、約 1. 6%、約 1. 7%、約 1. 8%、約 1. 9%、約 2. 0%、約 2. 2%、約 2. 5%、約 2. 7%、約 3. 0%、約 3. 2%、約 3. 5%、約 3. 7%或約 4. 0%。
[0046] 如本文中所用，術(shù)語"未綴合的接頭"是指與雙官能交聯(lián)試劑共價(jià)連接的細(xì)胞結(jié)合 齊U，其中細(xì)胞結(jié)合劑未通過雙官能交聯(lián)試劑的接頭共價(jià)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑（即，"未綴合 的接頭"可由CBA-L表示，其中CBA表示細(xì)胞結(jié)合劑并且L表示雙官能交聯(lián)試劑。相反地， 細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物可由CBA-L-D表示，其中D表示細(xì)胞毒素劑）。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物中的細(xì)胞毒素劑對細(xì)胞結(jié)合 劑的平均摩爾比為約1至約10、約2至約7、約3至約5、約2. 5至約4. 5 (例如，約2. 5、約 2. 6、約 2. 7、約 2. 8、約 2. 9、約 3. 0、約 3. 1、約 3. 3、約 3. 4、約 3. 5、約 3. 6、約 3. 7、約 3. 8、約 3. 9、約 4. 0、約 4. 1、約 4. 2、約 4. 3、約 4. 4、約 4. 5)、約 3. 0 至約 4. 0、約 3. 2 至約 4. 2、約 4. 5 對 5. 5 (例如，約 4. 5、約 4. 6、約 4. 7、約 4. 8、約 4. 9、約 5. 0、約 5. 1、約 5. 2、約 5. 3、約 5. 4、 約 5. 5)。
[0048] 細(xì)胞結(jié)合劑可以是結(jié)合細(xì)胞，通常且優(yōu)選地動物細(xì)胞（例如，人細(xì)胞）的任何適當(dāng) 的試劑。細(xì)胞結(jié)合劑優(yōu)選為肽或多肽。適當(dāng)?shù)募?xì)胞結(jié)合劑包括例如抗體（例如，單克隆抗 體及其片段）、干擾素（例如，-〇、-0、-^)、淋巴因子（例如，白細(xì)胞介素2(11^-2)，白細(xì) 胞介素3 (IL-3)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、激素（例如，胰島素、TRH(促 甲狀腺激素釋放激素）、MSH(黑素細(xì)胞刺激素）、類固醇激素，例如雄激素類和雌激素類）、 生長因子和集落刺激因子，例如表皮生長因子（EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)、成纖維細(xì) 胞生長因子（FGF)、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、集落刺激因子（CSF)，例如G-CSF，M-CSF和 GM_CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))、營養(yǎng)物轉(zhuǎn)運(yùn)分子（例如，轉(zhuǎn)鐵蛋 白）、維生素（例如，葉酸）以及特異性結(jié)合細(xì)胞表面上的靶分子的任何其它試劑或分子。 [0049] 當(dāng)細(xì)胞結(jié)合劑是抗體時(shí)，其結(jié)合抗原，所述抗原是多肽和可以是跨膜分子（例如 受體）或配體例如生長因子。示例性抗原包括分子例如腎素；生長激素，包括人生長激素 和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋 白酶；胰島素 Α-鏈；胰島素 Β-鏈；胰島素原；濾泡刺激激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血 糖素；凝血因子例如因子vmc、因子IX、組織因子（TF)和von Willebrands因子；抗-凝血 因子例如蛋白C ;心鈉素；肺表面活性劑；血纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人悄或組織類 型血纖溶酶原激活物（t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ; 腦啡肽酶；RANTES(在激活上受調(diào)節(jié)的，通常Τ-細(xì)胞表達(dá)和分泌的）；人巨噬細(xì)胞炎性蛋 白（MIP-1-α);血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素 Α-鏈； 松弛素 B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶； IgE ;細(xì)胞毒素 Τ淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA)，例如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長 因子（VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白A或D ;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子例如骨來 源的神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神 經(jīng)生長因子例如NGF-β ;血小板衍生生長因子（PDGF);成纖維細(xì)胞生長因子例如aFGF和 bFGF;表皮生長因子（EGF);轉(zhuǎn)化生長因子（TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βΙ、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4 或 TGF-β 5 ;胰島素-樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II); des (l-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素-樣生長因子結(jié)合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA、PSCA、 MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA 受體、EphB 受體、葉酸受體、F0LR1、間皮素、cripto、 α νβ 6、整聯(lián)蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ; CD 蛋白例如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD 11、CD 14、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、 CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80. CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152 或美國專利申請公布 No. 2008/0171040 或 美國專利申請公布No. 2008/0305044(將所述美國專利申請公布通過引用整體并入本文） 中公開的結(jié)合一種或多種腫瘤相關(guān)抗原或細(xì)胞表面受體的抗體；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因 子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP);干擾素，例如干擾素-α、-β和-γ ;集落刺激因子 (CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF和G-CSF ;白細(xì)胞介素（IL)，例如，IL-1至IL-10 ;超氧化物歧 化酶；Τ-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原例如，HIV包膜的部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白例如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4 和VCAM ;腫瘤相關(guān)抗原例如HER2、HER3或HER4受體；內(nèi)皮因子、c-Met、lGFlR、PSGR、NGEP、 PSMA、PSCA、LGR5、B7H4以及上文列出的多肽的任一種的片段。
[0050] 此外，結(jié)合骨髓細(xì)胞的GM-CSF可用作針對來自急性髓性白血病的患病細(xì)胞的細(xì) 胞結(jié)合劑。結(jié)合活化的T細(xì)胞的IL-2可用于移植排斥的預(yù)防，用于移植物抗宿主病的治療 和預(yù)防，和用于急性T細(xì)胞白血病的治療。結(jié)合黑色素細(xì)胞的MSH可用于治療黑色素瘤，正 如針對黑色素瘤的抗體可用于治療黑色素瘤一樣。葉酸可用于靶向卵巢和其它腫瘤上表達(dá) 的葉酸受體。表皮生長因子可用于靶向鱗癌例如肺以及頭頸癌。生長抑素可用于靶向神經(jīng) 母細(xì)胞瘤和其它腫瘤類型。.
[0051] 乳腺和睪丸的癌癥可分別被作為細(xì)胞結(jié)合劑的雌激素（或雌激素類似物）或雄激 素（或雄激素類似物）成功靶向。
[0052] 如本文中所用，術(shù)語"抗體"是指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段例如 Fab、Fab'、F(ab'）2、dsFv、sFv、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、納米抗體、蛋 白水解激活抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈抗體等（Parham, J. Immunol. 131:2895-2902(1983); Spring 等人，J.Immunol.113:470-478 (1974) ；Nisonoff 等人,Arch. Biochem. Biophys.89:230-244(1960) ;Kim 等人，Mol. Cancer Ther·，7:2486-2497(2008); Carter, Nature Revs. ,6:343-357(2006))或免疫球蛋白嵌合體，其可結(jié)合細(xì)胞表面上的抗 原（例如，其包含互補(bǔ)決定區(qū)（CDR))。任何適當(dāng)?shù)目贵w可用作細(xì)胞結(jié)合劑。本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解適當(dāng)?shù)目贵w的選擇將取決于待被靶向的細(xì)胞群體。在這一點(diǎn)上，在特定細(xì)胞群體 (通常地且優(yōu)選地患病細(xì)胞群體）中選擇性表達(dá)的細(xì)胞表面分子（即，抗原）的類型和數(shù)目 將決定用于本發(fā)明的組合物的適當(dāng)?shù)目贵w的選擇。細(xì)胞表面表達(dá)特征譜對于多種細(xì)胞類型 包括腫瘤細(xì)胞類型是已知的，或如果未知時(shí)，可使用常規(guī)分子生物學(xué)和組織化學(xué)技術(shù)來測 定?？贵w可以是雙特異性抗體（Morrison，SL, Nature biotechnology, 25 (11) :1233 - 4 (20 07))。
[0053] 抗體可以是多克隆的或單克隆的，但最優(yōu)選是單克隆抗體。如本文中所用，"多克 隆"抗體是指通常包含在被免疫的動物的血清中的抗體分子的異質(zhì)群體。"單克隆"抗體是 指對于特定抗原是特異性的抗體分子的同質(zhì)群體。單克隆抗體通常由單個(gè)克隆的B淋巴細(xì) 胞（"B細(xì)胞"）產(chǎn)生。單克隆抗體可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)來獲得，包括標(biāo)準(zhǔn) 雜交瘤技術(shù)（參見，例如，Kdhler 和 Milstein, Eur. J. Immunol. , 5:511-519 (1976) ；Harlow 和 Lane (編輯），Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988);和 C. A. Janeway 等 人（編輯），Immunobiology,第 5 版，Garland Publishing，New York，NY(2001))。簡而言 之，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤法通常包括利用抗原（即，"免疫原"）注射任何適當(dāng)?shù)膭游铮?通常且優(yōu)選地小鼠。隨后殺死動物，將從其脾分離的B細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞融合。產(chǎn)生雜交 細(xì)胞（即，"雜交瘤")，其可無限增殖并在體外連續(xù)分泌高滴度的具有期望的特異性的抗體。 本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法可用于鑒定產(chǎn)生具有期望的特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞。這樣 的方法包括例如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、Western印跡分析和放射免疫測定。篩選雜 交瘤的群體以分離單個(gè)克隆，所述克隆的每一個(gè)分泌針對抗原的單一抗體種類。因?yàn)槊恳?個(gè)雜交瘤是來源于與單個(gè)B細(xì)胞融合的克隆，因此其產(chǎn)生的所有抗體分子在結(jié)構(gòu)上包括它 們的抗原結(jié)合部位和同種型是相同的。單克隆抗體還可使用其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)包括EBV-雜 交瘤技術(shù)（參見，例如，Haskard 和 Archer, J. Immunol. Methods, 74 (2) : 361-67 (1984)，和 Roder等人，Methods Enzymol.，121:140-67 (1986))、噬菌體載體表達(dá)系統(tǒng)（參見，例如， Huse等人，Science, 246:1275-81 (1989))或包含抗體片段例如Fab和scFv (單鏈可變區(qū)） 的噬菌體展示文庫（參見，例如，美國專利5, 885, 793和5, 969, 108以及國際專利申請公布 No. W0 92/01047 和 W0 99/06587)來產(chǎn)生。
[0054] 單克隆抗體可從任何適當(dāng)?shù)膭游锓蛛x或可在其中產(chǎn)生，但優(yōu)選在哺乳動物，更優(yōu) 選小鼠或人，最優(yōu)選人中產(chǎn)生。用于在小鼠中產(chǎn)生抗體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 是公知的并且在本文中進(jìn)行了描述。關(guān)于人抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解多克隆抗體可 從利用適當(dāng)?shù)目乖臃N或免疫的人受試者的血清分離?；蛘?，人抗體可通過采用用于在 非人動物例如小鼠中產(chǎn)生人抗體的已知技術(shù)來產(chǎn)生（參見，例如，美國專利5, 545, 806 ; 5, 569, 825 ;和 5, 714, 352 以及美國專利申請公布 No. 2002/0197266 A1)。
[0055] 雖然是人的治療應(yīng)用的理想選擇，但人抗體，特別地人單克隆抗體，通常比小鼠單 克隆抗體更難產(chǎn)生。然而，小鼠單克隆抗體，當(dāng)給人施用時(shí)，誘導(dǎo)快速宿主抗體反應(yīng)，這可減 小抗體-細(xì)胞毒素劑綴合物的治療或診斷潛能。為了克服這些并發(fā)癥，單克隆抗體優(yōu)選地 不被人免疫系統(tǒng)識別為"外來的"。
[0056] 為此目的，噬菌體展示可用于產(chǎn)生抗體。在這一點(diǎn)上，編碼抗體的抗原結(jié)合可 變（V)結(jié)構(gòu)域的噬菌體文庫可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生（參見，例如， Sambrook 等人（編輯），Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001))。選擇編碼具有期望的特異性的可變區(qū)的噬 菌體的對期望的抗原的特異性結(jié)合，重建包含選擇的可變結(jié)構(gòu)域的完全人抗體。將編碼重 建抗體的核酸序列引入適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，例如用于雜交瘤產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞，以便具有單克 隆抗體的特征的人抗體由細(xì)胞分泌（參見，例如，Janeway等人，同上，Huse等人，同上， 和美國專利6, 265, 150)?；蛘撸蓮膶τ谔囟ㄈ酥劓満洼p鏈免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的小 鼠產(chǎn)生單克隆抗體。這樣的方法在本領(lǐng)域是已知的并且描述于例如美國專利5, 545, 806和 5, 569, 825以及Janeway等人（同上）中。
[0057] 最優(yōu)選地，抗體是人源化抗體。如本文中所用，"人源化"抗體是其中將形成抗 體的抗原結(jié)合環(huán)的小鼠單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)移植至人抗體分子的構(gòu)架上的抗 體。歸因于小鼠與人抗體的構(gòu)架的相似性，通常在本領(lǐng)域接受：該方法產(chǎn)生在抗原性上 與人抗體相同但結(jié)合與CDR所源自的小鼠單克隆抗體結(jié)合的抗原相同的抗原的單克隆抗 體。用于產(chǎn)生人源化抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的并且詳細(xì)地描述于例如Janeway等人 (同上）、美國專利5, 225, 539、5, 585, 089和5, 693, 761、歐洲專利0239400 B1以及英國 專利2188638中。人源化抗體還可使用美國專利5, 639, 641和Pedersen等人，J. Mol. Biol. ,235:959-973(1994)中描述的抗體表面再建技術(shù)來產(chǎn)生。雖然本發(fā)明組合物的綴合 物中使用的抗體最優(yōu)選為人源化單克隆抗體，但如上所述的人單克隆抗體和小鼠單克隆抗 體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0058] 具有至少一個(gè)抗原結(jié)合部位，從而識別并結(jié)合至少一個(gè)存在于靶細(xì)胞表面上的抗 原或受體的抗體片段也在本發(fā)明的苦海無邊內(nèi)。在這方面，完整抗體分子的蛋白質(zhì)水解切 割可產(chǎn)生保留識別并結(jié)合抗原的能力的許多抗體片段。例如，利用蛋白酶木瓜蛋白酶對抗 體分子的有限消化通常產(chǎn)生三個(gè)片段，所述片段中的兩個(gè)片段相同并且被稱為Fab片段， 因?yàn)樗鼈儽Ａ粲H代抗體分子的抗原結(jié)合活性。利用酶胃蛋白酶對抗體分子的切割通常產(chǎn) 生兩個(gè)抗體片段，所述片段中的一個(gè)保留抗體分子的兩個(gè)抗原結(jié)合臂，從而被稱為F(ab'） 2 片段。利用二硫蘇糖醇或巰基乙胺對F(ab'）2片段的還原產(chǎn)生稱為Fab'片段的片段。單 鏈可變區(qū)片段（sFv)抗體片段（其由包含通過合成肽連接于抗體輕鏈的V結(jié)構(gòu)域的抗體重 鏈的可變（V)結(jié)構(gòu)域的截?cái)嗟腇ab片段組成）可使用常規(guī)重組DNA技術(shù)學(xué)技術(shù)（參見，例 如，Janeway等人，同上）來產(chǎn)生。類似地，二硫化物穩(wěn)定的可變區(qū)片段（dsFv)可通過重組 DNA 技術(shù)來制備（參見，例如，Reiter 等人，Protein Engineering, 7:697-704(1994))。然 而，本發(fā)明的背景中的抗體片段不限于抗體片段的這些示例性類型?？墒褂米R別并結(jié)合期 望的細(xì)胞表面受體或抗原的任何適當(dāng)?shù)目贵w片段?？贵w片段進(jìn)一步描述于例如Parham, J. Immunol. ,131:2895-2902(1983) ;Spring 等人，J.Immunol. ,113:470-478(1974);和 Nisonoff 等人，Arch. Biochem. Biophys.，89:230-244 (1960)中。抗體-抗原結(jié)合可使用本 領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉頊y定，所述方法是例如放射免疫測定（RIA)、ELISA、Western 印跡、免疫沉淀和競爭性抑制測定（參見，例如，Janeway等人，同上，和美國專利申請公布 No. 2002/0197266A1)。
[0059] 此外，抗體可以是嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于"嵌合"，其意指抗體包含至 少兩個(gè)獲自或來源于至少兩個(gè)不同物種的免疫球蛋白或其片段（例如，兩種不同免疫球蛋 白，例如與鼠免疫球蛋白可變區(qū)組合的人免疫球蛋白恒定區(qū)）。抗體還可以是結(jié)構(gòu)域抗體 (dAb)或其抗原結(jié)合片段，例如，胳騎抗體（參見，例如，Desmyter等人，似1：11^31:；1〇1(31:· Biol.，3:752，（1996))或藍(lán)魚抗體，例如，新的抗原受體（IgNAR)(參見，例如，Greenberg等 人，Nature, 374:168 (1995)和 Stanfield 等人，Science, 305:1770-1773 (2004))。
[0060] 任何適當(dāng)?shù)目贵w可用于本發(fā)明的背景。例如，單克隆抗體J5是對于 常見急性淋巴細(xì)胞白血病抗原（CALLA)是特異性的鼠 IgG2a抗體（Ritz等 人，Nature, 283:583-585(1980))，并且可用于靶向表達(dá)CALLA的細(xì)胞（例如，急性淋巴母 細(xì)胞白血病細(xì)胞）。單克隆抗體MY9是特異性結(jié)合CD33抗原的鼠 IgGl抗體（Griffin等 人，Leukemia Res.，8:521 (1984))，并且可用于靶向表達(dá)CD33的細(xì)胞（例如，急性髓性白血 ?。ˋML)細(xì)胞）。
[0061] 類似地，單克隆抗體抗-B4(也稱為M)是結(jié)合B細(xì)胞上的⑶19抗原的鼠 IgGl抗 體（Nadler等人，J. Immunol.，131:244-250 (1983))，并且可用于靶向B細(xì)胞或表達(dá)CD19的 患病細(xì)胞（例如，非何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞和慢性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞）。N901是結(jié)合在 神經(jīng)內(nèi)分泌來源包括小細(xì)胞肺腫瘤的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的CD56(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子）抗原的鼠單 克隆抗體，其可在綴合物中用于將將藥物靶向神經(jīng)內(nèi)分泌來源的細(xì)胞。優(yōu)選在J5、MY9和B4 抗體用作綴合物的部分之前將其進(jìn)行表面再建或人源化?？贵w的表面再建或人源化描述于 例如 Roguska 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-73 (1994)中。
[0062] 此外，單克隆抗體C242結(jié)合CanAg抗原（參見，例如，美國專利5, 552, 293)，并 且可用于將綴合物靶向表達(dá)CanAg的腫瘤例如結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌。 此〇242是單克隆抗體0242的人源化形式（參見，例如，美國專利5,552,293)。將!11^242 所產(chǎn)生自的雜交瘤以ECACC標(biāo)識號90012601保藏。HuC242可使用CDR-移植法（參見，例 如，美國專利5, 585, 089、5, 693, 761和5, 693, 762)或表面再建技術(shù)（參見，例如，美國專利 5,639,641)來制備。HuC242可用于將綴合物靶向表達(dá)CanAg抗原的腫瘤細(xì)胞，例如結(jié)直腸 癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞。
[0063] 為了靶向卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞，可將抗-MUC1抗體用作綴合物中的細(xì)胞 結(jié)合劑?？?MUC1抗體包括例如抗-HMFG-2 (參見，例如，Taylor-Papadimitriou等 人，Int.J. Cancer, 28:17-21 (1981))、hCTMOl (參見，例如，van Hof 等人，Cancer Res.，56:5179-5185(1996))和DS6。前列腺癌細(xì)胞還可通過使用抗-前列腺-特異性膜 抗原（PSMA)作為細(xì)胞結(jié)合劑例如J591，利用綴合物來靶向（參見，例如，Liu等人，Cancer Res.，57:3629-3634 (1997))。此外，表達(dá)Her2抗原的癌細(xì)胞例如乳腺癌和卵巢癌可使用抗 體曲妥珠單抗來靶向。結(jié)合胰島素樣生長因子受體的抗-IGF-IR抗體還可用于綴合物。結(jié) 合 CD27L、EGFRvIII、Cripto、CD138、CD38、EphA2、整聯(lián)蛋白、CD37、葉酸受體和 Her3 的抗體 還可用于綴合物。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體選自huN901、huMy9_6、huB4、huC242、曲妥珠單抗、比伐 單抗、西羅珠單抗、利妥昔單抗、huDS6、國際專利申請公布No. W0 2010/124797中描述的 抗-間皮素抗體（例如MF-T)、美國專利申請公布No. 2010/0093980中描述的抗-cripto 抗體（例如huB3F6)、美國專利申請公布No. 2007/0183971中描述的抗-CD138抗體（例如 huB-B4)、美國專利No. 7, 736, 644和7, 628, 986以及美國專利申請公布No. 2010/0111979 ; 2009/0240038 ;2009/0175887 ;2009/0156790 和 2009/0155282 中描述的抗-EGFRvIII 抗 體、國際專利申請公布No. W0/2011/039721和W0/2011/039724中描述的人源化EphA2抗體 (例如2H11R35R74)、國際專利申請公布No. W0 2008/047242中描述的抗-CD38抗體（例如 hu38SB19)、美國臨時(shí)申請No. 61/307, 797、61/346, 595和61/413, 172以及美國專利申請公 布No. 2012/0009181中描述的抗-葉酸受體抗體（例如，huMovl9);美國專利5, 958, 872 和6, 596, 743中描述的抗-IGF1R抗體；美國專利申請公布No. 2011/0256153中描述的 抗4037抗體（例如，1111〇)37-3);美國專利申請公布此.2006/0127407中描述的抗-整聯(lián)蛋 白α νβ6抗體（例如，CNT095);和國際專利申請公布No.WO 2012/019024中描述的抗-Her3 抗體。特別優(yōu)選的抗體是本文中描述的人源化單克隆抗體。
[0065] 雖然細(xì)胞結(jié)合劑優(yōu)選為抗體，但細(xì)胞結(jié)合劑還可以是非抗體分子。適 當(dāng)?shù)姆强贵w分子包括例如，錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPins ;Zahnd等人，J. Biol. Chem·，281，46,35167-35175,（2006) ;Binz 等人，Nature Biotechnology, 23:1257-126 8 (2005))或錨蛋白樣重復(fù)蛋白或例如美國專利申請公布No. 2007/0238667 ;美國專利 7, 101，675 ;以及國際專利申請公布No. TO/2007/147213和TO/2007/062466)中描述的 合成肽、干擾素（例如，-α、-β或-γ干擾素）、淋巴因子（例如，白細(xì)胞介素2(IL-2)、 IL-3、IL-4或IL-6)、激素（例如，胰島素）、生長因子（例如，EGF、TGF- a、FGF和 VEGF)、集落刺激因子（例如，G-CSF、M-CSF 和 GM-CSF(參見，例如，Burgess, Immunology Today, 5:155-158 (1984))、生長抑素和轉(zhuǎn)鐵蛋白（參見，例如，0' Keefe等人，181〇1· Chem.，260:932-937(1985))。例如，GM-CSF，其結(jié)合髓系細(xì)胞，可用作細(xì)胞結(jié)合劑來靶向急 性髓性白細(xì)胞。此外，IL-2,其結(jié)合活化的T-細(xì)胞，可用于預(yù)防移植排斥，用于治療或預(yù)防 移植物抗宿主病，和用于治療急性T細(xì)胞白血病。表皮生長因子（EGF)可用于靶向鱗癌例 如肺癌和頭頸癌。生長抑素可用于靶向神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和其它腫瘤細(xì)胞類型。
[0066] 綴合物可包含任何適當(dāng)?shù)募?xì)胞毒素劑。如本文中所用，"細(xì)胞毒素劑"是指導(dǎo)致細(xì) 胞死亡、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或減小細(xì)胞活力的任何化合物。適當(dāng)?shù)募?xì)胞毒素劑包括例如類美登 素和類美登素類似物、紫杉烷、CC-1065和CC-1065類似物以及多拉司他汀及多拉司他汀 類似物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞毒素劑為類美登素，包括美登醇和美登醇類似 物。類美登素是抑制微管形成并且對哺乳動物細(xì)胞具有高度毒性的化合物。適當(dāng)?shù)拿赖谴?類似物的實(shí)例包括具有修飾芳香環(huán)的美登醇類似物和在其它位置具有修飾的美登醇類似 物。這樣的類美登素描述于例如美國專利4, 256, 746 ;4, 294, 757 ;4, 307, 016 ;4, 313, 946 ; 4, 315, 929 ；4, 322, 348 ；4, 331, 598 ；4, 361, 650 ；4, 362, 663 ；4, 364, 866 ；4, 424, 219 ； 4, 371, 533 ;4, 450, 254 ;5, 475, 092 ;5, 585, 499 ;5, 846, 545 和 6, 333, 410 中。
[0067] 具有修飾芳環(huán)的美登醇類似物的實(shí)例包括：（1)C-19-脫氯（美國專利4, 256, 746) (通過安絲菌素 P2的LAH還原制備的）、（2) C-20-羥基（或C-20-去甲基）+/-C-19-脫 氯（美國專利4, 361，650和4, 307, 016)(通過使用鏈霉菌屬（Streptomyces)或放線菌 屬（Actinomyces)的去甲基作用或使用LAH的脫氯作用制備的）和（3)C-20-去甲氧基、 C-20-酰氧基（-0C0R)、+/-脫氯（美國專利4, 294, 757)(通過使用酰氯的?；饔弥苽?的）。
[0068] 具有除芳環(huán)外的位置的修飾的美登醇類似物的實(shí)例包括：（l)C-9-SH(美國專 利4, 424, 219)(通過美登醇與H2S或P2S5的反應(yīng)制備的）、（2)C-14-烷氧甲基（脫甲氧 基/01 201〇(美國專利4,331，598)、（3)(：-14-羥甲基或酰氧甲基（0120!1或01 2^)(美國 專利4,450,254)(從諾卡爾菌屬（此(^"1幻制備的）、（4)(：-15-羥基/酰氧基（美國 專利4, 364, 866)(通過鏈霉菌屬對美登醇的轉(zhuǎn)化制備的）、（5)C-15-甲氧基（美國專利 4, 313, 946和4, 315, 929)(從滑桃樹分離的）、（6)C-18-N-去甲基（美國專利4, 362, 663 和4, 322, 348)(通過鏈霉菌屬對美登醇的去甲基作用制備的）和（7) 4, 5-脫氧（美國專利 4, 371，533)(通過美登醇的三氯化鈦/LAH還原制備的）。
[0069] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，綴合物利用含硫醇基類美登素 DM1 (也稱為N2'-去乙 ?；?N2 -(3-巰基-1-氧戊基）-美坦辛作為細(xì)胞毒素劑。DM1的結(jié)構(gòu)由式（I)表不：
[0070]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的方法，所述方法包括在外源 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)存在的情況下將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共 價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的混合物。
2. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從 而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物， (b) 將所述第一混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，從而制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的純化的第一混合物， (c) 通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑綴合 于所述純化的第一混合物中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有 通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii) 游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物，和 (d) 將第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其 組合以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出來，從 而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物， 其中在步驟（a)期間或之后以及在步驟（c)之前添加外源N-羥基琥珀酰亞胺。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下進(jìn)行步驟 (a)中的接觸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在步 驟（a)之后保持所述第一混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液進(jìn)行所述保 持。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在步驟（b)中添加外源N-羥基琥珀酰亞胺。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在步 驟（b)之后保持所述純化的第一混合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中進(jìn)行所述保 持。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用切向流 過濾。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用吸附色 譜。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜以及 在步驟（d)中使用切向流過濾。
14. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用非吸附 色譜。
15. 根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過濾以 及在步驟（d)中使用吸附色譜。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶 液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
19. 根據(jù)權(quán)利要求2至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶 液中進(jìn)行步驟（c)中的綴合。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
22. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)連接于細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備 包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物， (b) 通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng)來將細(xì)胞毒素劑綴合 于所述第一混合物中的具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有通過接 頭偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素 劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物，和 (c) 將所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物， 其中在步驟（a)的過程中或之后和在步驟（b)之前添加所述外源N-羥基琥珀酰亞胺。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下進(jìn)行步 驟（a)中的接觸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在 步驟（a)后保持所述第一混合物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中進(jìn)行所述 保持。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
27. 根據(jù)權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過濾。
28. 根據(jù)權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色譜。
30. 根據(jù)權(quán)利要求22至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
33. 根據(jù)權(quán)利要求22至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（b)中的綴合。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
36. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與包含化學(xué)地偶聯(lián)于接頭的細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞毒素劑-接頭化合物 接觸，以將細(xì)胞毒素劑-接頭化合物共價(jià)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含含有通 過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的 混合物，和 (b) 將包含所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉 淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以純化所述綴合物，其中在步驟（a)的過程 中或之后和在步驟（b)之前添加外源N-羥基琥珀酰亞胺。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下進(jìn)行步 驟（a)中的接觸。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其還包括在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在 步驟（a)后保持所述混合物。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中進(jìn)行所述 保持。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
41. 根據(jù)權(quán)利要求36至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過將細(xì)胞毒素劑與包含接頭的 雙官能交聯(lián)試劑接觸以將所述細(xì)胞毒素劑共價(jià)地連接于所述接頭來制備細(xì)胞毒素劑-接 頭化合物，并從而制備包含所述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物的混合物。
42. 根據(jù)權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中在與所述細(xì)胞結(jié)合劑接觸之前純 化所述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物。
43. 根據(jù)權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中在與細(xì)胞結(jié)合劑接觸之前不純化 所述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物。
44. 根據(jù)權(quán)利要求36至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
47. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從 而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物， (b) 將所述第一混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，從而制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的純化的第一混合物， (c) 通過將所述具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑在外源N-羥基琥珀 酰亞胺存在的情況下反應(yīng)，來將細(xì)胞毒素劑綴合于所述純化的第一混合物中的具有連接于 其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有通過接頭偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑 的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合 物，和 (d) 將所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用切向流過濾。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用吸附色譜。
50. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中在步驟（b)和（d)中使用非吸附色譜。
51. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜以及在步驟（d)中 使用切向流過濾。
52. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過濾以及在步驟（d) 中使用吸附色譜。
53. 根據(jù)權(quán)利要求47至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
55. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
56. 根據(jù)權(quán)利要求47至55中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（c)中的綴合。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
58. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
59. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從 而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物， (b) 通過將具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑在外源N-羥基琥珀酰亞 胺存在的情況下反應(yīng)，來將細(xì)胞毒素劑綴合于所述第一混合物中的所述具有連接于其的接 頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i)含有通過所述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì) 胞結(jié)合劑的所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn) 物的第二混合物，和 (c) 將所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過濾。
61. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
62. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色譜。
63. 根據(jù)權(quán)利要求59至62中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
66. 根據(jù)權(quán)利要求59至65中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（c)中的綴合。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
68. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
69. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從 而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物， (b) 將所述第一混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，從而制備具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的純化的第一混合物， (c) 通過將所述具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng),來將細(xì)胞毒素 劑綴合于所述純化的第一混合物中的所述具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包 含（i)含有通過所述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞 毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物， (d) 在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下溫育所述第二混合物；和 (e) 在步驟（d)之后將所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸 附過濾、吸附色譜或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物 的其它組分純化出來，從而制備通過所述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑 的純化的第二混合物。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH溶液中進(jìn)行步驟 (d)中的溫育。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
72. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
73. 根據(jù)權(quán)利要求69至72中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
75. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
76. 根據(jù)權(quán)利要求69至75中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（c)中的綴合。
77. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
78. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
79. 根據(jù)權(quán)利要求69至78中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在步驟（c)與（d)之間將所 述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合，以 將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出業(yè)，從而在步 驟（d)之前制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下進(jìn)行純 化。
81. 根據(jù)權(quán)利要求79或80所述的方法，其中將所述第二混合物在步驟（c)與（d)之間 經(jīng)歷切向流過濾。
82. 根據(jù)權(quán)利要求69至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（e)中使用切向流過濾。
83. 根據(jù)權(quán)利要求69至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（e)中使用吸附色譜。
84. 根據(jù)權(quán)利要求69至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（e)中使用非吸附色譜。
85. 根據(jù)權(quán)利要求69至84中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過濾。
86. 根據(jù)權(quán)利要求69至84中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜。
87. 根據(jù)權(quán)利要求69至84中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用非吸附色譜。
88. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的綴合物的方 法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)試劑接觸以將接頭共價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從 而制備包含具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的第一混合物， (b) 通過將所述具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑反應(yīng),來將細(xì)胞毒素 劑綴合于所述第一混合物中的所述具有連接于其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含（i) 含有通過所述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素 劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物， (c) 在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下溫育所述第二混合物；和 (d) 將所述第二混合物在步驟（c)之后經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸 附過濾、吸附色譜或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物 的其它組分純化出來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合 物。
89. 根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶液中進(jìn)行步驟 (c)中的溫育。
90. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
91. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
92. 根據(jù)權(quán)利要求88至91中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶 液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
93. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
94. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
95. 根據(jù)權(quán)利要求88至94中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶 液中進(jìn)行步驟（b)中的綴合。
96. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
97. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
98. 根據(jù)權(quán)利要求88至97中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在步驟（b)與（c)之間將所 述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合步 驟，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出來，從 而在步驟（c)之前制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
99. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在步驟 (b)與（c)之間進(jìn)行所述第二混合物的純化。
100. 根據(jù)權(quán)利要求98或99所述的方法，其中將所述第二混合物在步驟（b)與（c)之 間經(jīng)歷切向流過濾。
101. 根據(jù)權(quán)利要求88至100中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（d)中使用切向流過 濾。
102. 根據(jù)權(quán)利要求88至100中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（d)中使用吸附色譜。
103. 根據(jù)權(quán)利要求88至100中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（d)中使用非吸附色 譜。
104. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑接觸以形成包含所述細(xì)胞結(jié)合劑和所述細(xì)胞毒素劑的 第一混合物，隨后將所述第一混合物與包含接頭的雙官能交聯(lián)試劑在具有約4至約9的pH 的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過所述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié) 合劑的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混 合物； (b) 在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下溫育所述第二混合物；和 (c) 將所述第二混合物在步驟（b)后經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附 過濾、吸附色譜或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的 其它組分純化出來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
105. 根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，其中在將所述第一混合物與所述雙官能交聯(lián)試劑 接觸后立即進(jìn)行步驟（b)的溫育。
106. 根據(jù)權(quán)利要求104或105所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的溶液中進(jìn) 行步驟（b)中的溫育。
107. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
108. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
109. 根據(jù)權(quán)利要求104至108中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
110. 根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中所述pH為約6. 0至8. 0。
111. 根據(jù)權(quán)利要求104至110中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在步驟（a)與（b)之間將 所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜或其組合， 以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出來，從而在 步驟（b)之前制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
112. 根據(jù)權(quán)利要求111所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在步 驟（a)與（b)之間進(jìn)行所述第二混合物的純化。
113. 根據(jù)權(quán)利要求111或112所述的方法，其中將所述第二混合物在步驟（a)與（b) 之間經(jīng)歷切向流過濾。
114. 根據(jù)權(quán)利要求104至113中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過 濾。
115. 根據(jù)權(quán)利要求104至113中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
116. 根據(jù)權(quán)利要求104至113中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色 譜。
117. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a)將細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下接觸，以形成 包含所述細(xì)胞結(jié)合劑和所述細(xì)胞毒素劑的第一混合物，隨后將所述第一混合物與包含接頭 的雙官能交聯(lián)試劑于具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過接頭化 學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游離細(xì) 胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物；和 (b)將所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
118. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒素劑接觸以形成包含所述細(xì)胞結(jié)合劑和所述細(xì)胞毒素劑的 第一混合物，隨后將所述第一混合物與包含接頭的雙官能交聯(lián)試劑在外源N-羥基琥珀酰 亞胺存在的情況下于具有約4至約9的pH的溶液中接觸，以提供包含（i)含有通過所述接 頭化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物、（ii)游 離細(xì)胞毒素劑和（iii)反應(yīng)副產(chǎn)物的第二混合物；和 (b) 將所述第二混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述第二混合物的其它組分純化出 來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的第二混合物。
119. 根據(jù)權(quán)利要求117或118所述的方法，其中在具有約4. 0至約9. 0的pH的溶液中 的進(jìn)行步驟（a)的接觸。
120. 根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中所述pH為約6. 0至8. 0。
121. 根據(jù)權(quán)利要求117至120中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用切向流過 濾。
122. 根據(jù)權(quán)利要求117至120中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用吸附色譜。
123. 根據(jù)權(quán)利要求117至120中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（b)中使用非吸附色 譜。
124. -種用于制備包含通過接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合 劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的方法，所述方法包括： (a) 將細(xì)胞結(jié)合劑與包含化學(xué)地偶聯(lián)于接頭的細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞毒素劑-接頭化合物 接觸，以將所述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物共價(jià)地連接于所述細(xì)胞結(jié)合劑，從而制備包含含 有通過所述接頭化學(xué)地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素劑的細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合 物的混合物； (b) 在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下溫育步驟（a)的所述混合物；和 (c) 將所述混合物在步驟（b)后經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、 吸附色譜或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述混合物的其它組分純 化出來，從而制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的混合物。
125. 根據(jù)權(quán)利要求124所述的方法，其中通過將細(xì)胞毒素劑與包含接頭的雙官能交聯(lián) 試劑接觸以將所述細(xì)胞毒素劑共價(jià)地連接于接頭，來制備所述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物。
126. 根據(jù)權(quán)利要求124或125所述的方法，其中在與所述細(xì)胞結(jié)合劑接觸之前純化所 述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物。
127. 根據(jù)權(quán)利要求124或125所述的方法，其中在與所述細(xì)胞結(jié)合劑接觸之前不純化 所述細(xì)胞毒素劑-接頭化合物。
128. 根據(jù)權(quán)利要求124至127中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（b)中的溫育。
129. 根據(jù)權(quán)利要求128所述的方法，其中所述pH為約5. 0至約8. 0。
130. 根據(jù)權(quán)利要求128所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
131. 根據(jù)權(quán)利要求124至130中任一項(xiàng)所述的方法，其中在具有約4. 0至9. 0的pH的 溶液中進(jìn)行步驟（a)中的接觸。
132. 根據(jù)權(quán)利要求131所述的方法，其中所述pH為約6. 0至約8. 0。
133. 根據(jù)權(quán)利要求131所述的方法，其中所述pH為約6. 5至約7. 5。
134. 根據(jù)權(quán)利要求124至133中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在步驟（a)與（b)之間 將步驟（a)的所述混合物經(jīng)歷切向流過濾、選擇性沉淀、非吸附色譜、吸附過濾、吸附色譜 或其組合，以將所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物從所述混合物的其它組分純化出來， 從而在步驟（b)之前制備所述細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒素劑綴合物的純化的混合物。
135. 根據(jù)權(quán)利要求134所述的方法，其中在外源N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下在步 驟（a)與（b)之間進(jìn)行所述混合物的純化。
136. 根據(jù)權(quán)利要求134或135所述的方法，其中在步驟（a)與（b)之間將步驟（a)的 混合物經(jīng)歷切向流過濾。
137. 根據(jù)權(quán)利要求124至136中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用切向流過 濾。
138. 根據(jù)權(quán)利要求124至136中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用吸附色譜。
139. 根據(jù)權(quán)利要求124至136中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（c)中使用非吸附色 譜。
140. 根據(jù)權(quán)利要求2至139中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非吸附色譜選自 SEPHADEX?樹脂、SEPHACRYL?樹脂、SUPERDEX?樹脂和⑷〇...(;丨丨丨/樹脂。
141. 根據(jù)權(quán)利要求1至140中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述吸附色譜選自羥基磷灰石 色譜法、疏水性電荷誘導(dǎo)色譜法（HCIC)、疏水相互作用色譜法（HIC)、離子交換色譜法、混 合模式離子交換色譜法、固定金屬親和色譜法（IMAC)、染料配體色譜法、親和色譜法、反相 色譜法及其組合。
142. 根據(jù)權(quán)利要求1至141中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞結(jié)合劑選自抗體、干擾 素、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素3(IL-3)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、 胰島素、EGF、TGF- a、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF 和轉(zhuǎn)鐵蛋白。
143. 根據(jù)權(quán)利要求142所述的方法，其中所述細(xì)胞結(jié)合劑為抗體。
144. 根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
145. 根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述抗體為人源化單克隆抗體。
146. 根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述抗體選自huN901、huMy9-6、huB4、 huC242、曲妥珠單抗、比伐單抗、西羅珠單抗、CNT095、huDS6、利妥昔單抗、抗-⑶27L抗體、 抗-EGFRvIII抗體、抗-Cripto抗體、抗-CD138抗體、抗-CD38抗體、抗-EphA2抗體、整聯(lián) 蛋白靶向抗體、抗-CD37抗體、抗-葉酸受體抗體、抗-Her3抗體和抗-IGFIR抗體。
147. 根據(jù)權(quán)利要求1至146中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞毒素劑選自類美登素、 紫杉烷類、CC1065以及前述毒素劑的類似物。
148. 根據(jù)權(quán)利要求147所述的方法，其中所述細(xì)胞毒素劑為類美登素。
149. 根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述類美登素包含硫醇基。
150. 根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述類美登素為DM1。
151. 根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述類美登素為DM4。
152. 根據(jù)權(quán)利要求1至151中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞結(jié)合劑通過化學(xué)鍵被 化學(xué)地偶聯(lián)于所述細(xì)胞毒素劑，所述化學(xué)鍵選自二硫鍵、酸不穩(wěn)定鍵、光不穩(wěn)定鍵、肽酶不 穩(wěn)定鍵、硫醚鍵和酯酶不穩(wěn)定鍵。
153. 根據(jù)權(quán)利要求1至152中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙官能交聯(lián)試劑包含可與 所述細(xì)胞結(jié)合劑的賴氨酸殘基形成酰胺鍵的反應(yīng)性部分。
154. 根據(jù)權(quán)利要求153所述的方法，其中所述反應(yīng)性部分為羧酸部分或反應(yīng)性酯部 分。
155. 根據(jù)權(quán)利要求153所述的方法，其中所述雙官能交聯(lián)試劑包含N-琥珀酰亞胺酯部 分或N-磺基琥珀酰亞氨酯部分。
156. 根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述雙官能交聯(lián)試劑還包含基于馬來酰亞胺 的部分。
157. 根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述雙官能交聯(lián)試劑選自4-(馬來酰亞胺甲 基）環(huán)己基羧酸N-琥珀酰亞胺酯（SMCC)、N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基）-環(huán) 己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯）（LC-SMCC)、κ -馬來酰亞胺基十一酸N-琥珀酰亞胺酯 (KMUA)、γ -馬來酰亞胺基丁酸N-琥珀酰亞胺酯（GMBS)、N- ( β -馬來酰亞胺基丙酰氧基） 琥珀酰亞胺酯（BMPS)、ε -馬來酰亞胺基己酸Ν-羥基琥珀酰亞胺酯（EMCS)、間-馬來酰亞 胺苯甲酰基-Ν-羥基琥珀酰亞胺酯（MBS)、Ν-( α -馬來酰亞胺乙酰氧基）_琥珀酰亞胺酯 (AMAS)、6-( β -馬來酰亞胺丙酰氨基）己酸琥珀酰亞胺酯（SMPH)、4-(對-馬來酰亞胺苯 基）-丁酸Ν-琥珀酰亞胺酯（SMPB)、磺基-Mai、PEG 4-Mal、CX1-1、4_ (2-吡啶基二硫代）丁 酸N-琥珀酰亞胺酯（STOB)、4_ (2-吡啶基二硫代）戊酸N-琥珀酰亞胺酯（SPP)和4- (2-批 啶基二硫代）2-磺基丁酸N-琥珀酰亞胺酯（磺基-STOB)。
158. 根據(jù)權(quán)利要求157所述的方法，其中所述雙官能交聯(lián)試劑為4-(馬來酰亞胺甲 基）環(huán)己基羧酸N-琥珀酰亞胺酯（SMCC)、4-(2-吡啶基二硫代）戊酸N-琥珀酰亞胺酯 (SPP)或4-(2-吡啶基二硫代）丁酸N-琥珀酰亞胺酯（STOB)。
159. 根據(jù)權(quán)利要求1至158中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源N-羥基琥珀酰亞胺對 所述雙官能交聯(lián)劑的摩爾比為約〇. 5至約1000。
【文檔編號】A61K39/395GK104093425SQ201280068773
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月13日
【發(fā)明者】劉芳, G·W·安普萊特, D·H·梅舒拉姆 申請人:伊繆諾金公司