胰腺β-細胞增殖的調節(jié)的制作方法
【專利摘要】在一種實施方式中，本文描述的工作提供了一種用于增加需要的對象中胰腺β-細胞的增殖或復制的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26（TD26）的水平或活性的藥劑，由此增加胰腺β-細胞的增殖或復制。這樣的藥劑可以通過例如提高所述對象中活性TD26的水平或通過提高所述對象中TD26的功能活性來發(fā)揮作用。
【專利說明】胰腺β-細胞增殖的調節(jié)
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2011年6月10日提交的美國臨時申請系列號61/495，868和2012年3月21日提交的美國臨時申請系列號61/613，856的權益，所述申請的教導通過參考以其整體并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本申請利用國立衛(wèi)生研究院(Nat1nal Institutes of Health)授予的DK090781政府支持做出。美國政府在本發(fā)明中具有一定權利。
【背景技術】
[0005]細胞是位于胰島中的一種類型的胰腺細胞，其制造和分泌胰島素，胰島素是一種控制血液中的葡萄糖水平的激素。β-細胞能夠通過釋放儲存的胰島素對血糖的增加作出快速響應，并在同時產(chǎn)生附加的胰島素用于將來的需要。β_細胞的功能受損和/或數(shù)量減少與代謝疾病相關，所述代謝疾病包括糖尿病、肥胖癥和其他疾病。
[0006]糖尿病是源自于 多種致病因素并以空腹狀態(tài)下血漿葡萄糖水平升高(高血糖癥)為特征的疾病。存在兩種主要形式的糖尿病:(I)胰島素依賴型或I型糖尿病(也稱為青少年糖尿病)和(2)非胰島素依賴型或II型糖尿病(也稱為NIDDM)。
[0007]I型糖尿病由胰腺細胞的損失引起的胰島素缺乏造成，這通常是胰島的自體免疫破壞的結果。因此，在患有I型糖尿病的患者中，由胰島細胞產(chǎn)生的胰島素的量過低，導致血糖水平升高(高血糖癥)。患有I型糖尿病的患者一般需要終生胰島素治療,但是即使頻繁地每日注射胰島素，也難以充分控制血糖水平。已經(jīng)開發(fā)了能夠減少免疫系統(tǒng)介導的胰島破壞的治療；然而，由于人類β -細胞的再生相對緩慢，因此單獨的這種治療不是改善糖尿病病癥的令人滿意的手段。然而，這些療法可以有利地與能夠刺激β-細胞再生的治療劑相組合。
[0008]在2型糖尿病患者中，肝細胞和肌細胞失去它們對正常血液胰島素水平作出響應的正常能力(胰島素抗性)，引起高血糖水平。此外，II型糖尿病患者表現(xiàn)出β-細胞功能受損和β-細胞凋亡增加，引起總β-細胞團隨時間的減少。最終，施用外源胰島素在2型糖尿病患者中變成必需的。
[0009]治療糖尿病的常規(guī)方法包括在I型糖尿病的情形中施用流體和胰島素，以及在II型糖尿病中施用各種降血糖藥劑。不幸的是，許多已知的降血糖藥劑表現(xiàn)出不希望的副作用和毒性。因此，對于I型和2型糖尿病兩者來說，需要開發(fā)能夠刺激β-細胞增殖的藥劑以用于治療性方法和制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]在一種實施方式中，本文描述的工作提供了一種用于增加需要的對象中胰腺β -細胞的增殖或復制的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，由此增加胰腺細胞的增殖或復制。這樣的藥劑可以通過例如提高所述對象中活性TD26的水平或通過提高所述對象中TD26的功能活性來發(fā)揮作用。
[0011]在一種實施方式中，本文描述了一種用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26(TD26)的水平或活性的藥劑，由此在所述對象中增加胰腺β -細胞增殖并提高內(nèi)源胰島素水平。在一種實施方式中，所述藥劑是TD26蛋白或其功能性部分或者編碼TD26或其功能性部分的核苷酸序列。
[0012]還描述了一種用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素抗性相關的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，由此在所述對象中增加胰腺β_細胞增殖并提高內(nèi)源胰島素水平。在一種實施方式中，所述藥劑是TD26蛋白或其功能性部分或者編碼TD26或其功能性部分的核苷酸序列。
[0013]在特定實施方式中，所施用的藥劑提高所述對象中內(nèi)源TD26的水平。在一種情況下，所述藥劑提高TD26的表達。在另一種情況下，所述藥劑增加TD26的分泌。在另一種情況下，所述藥劑提高TD26的穩(wěn)定性，或者防止或以其他方式減緩TD26的降解。應該認識到，本發(fā)明設想了能夠提高所述對象中TD26的水平或增加TD26半衰期的任何藥劑。 [0014]在某些實施方式中，所述藥劑是TD26蛋白或其功能性部分(例如卷曲螺旋結構域或缺少天然信號序列的TD26蛋白)。在某些實施方式中，TD26蛋白包含SEQ ID NO: 1、SEQID NO:2,SEQ IDN0:3或SEQ IDN0:4。在某些實施方式中，功能性部分例如可以是比完整的TD26氨基酸序列小、缺少天然信號序列并包含SEQ ID NO:1的第22-76位、第48-76位或第77-135位氨基酸的氨基酸序列的多肽。
[0015]在其他實施方式中，所述藥劑是編碼TD26蛋白或TD26的功能性部分的核酸。在某些實施方式中，所述核酸包含SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15的全部或一部分。
[0016]在其他實施方式中，所述藥劑是胰島素受體拮抗劑。例如，所述藥劑可以選自S661、S661的功能性部分、S961、S961的功能性部分、RB537和RB537的功能性部分。在某些情況下，所述藥劑包含SEQ ID NO: 16的全部或功能性部分。
[0017]在某些實施方式中，所述胰島素受體拮抗劑以優(yōu)選地引起很少或不引起血糖水平升高或僅引起血糖水平暫時升高的劑量施用。在所述劑量引起血糖水平升高的情況下，它可以與針對所述血糖水平的其他治療劑聯(lián)合使用。作為非限制性實例，所述胰島素受體拮抗劑在某些情況下可以以低于約10 μ Mol/Kg/周(例如低于約9 μ Mol/Kg/周、約8 μ Mol/Kg/ 周、約 7 μ Mol/Kg/ 周、約 6 μ Mol/Kg/ 周、約 5 μ Mol/Kg/ 周、約 4 μ Mol/Kg/ 周、約3 μ Mol/Kg/ 周、約 2 μ Mol/Kg/ 周、約 I μ Mol/Kg/ 周、約 0.90 μ Mol/Kg/ 周、約 0.80 μ Mol/Kg/ 周、約 0.70 μ Mol/Kg/ 周、約 0.60 μ Mol/Kg/ 周、約 0.50 μ Mol/Kg/ 周、約 0.40 μ Mol/Kg/周、約 0.30 μ Mol/Kg/周、約 0.20 μ Mol/Kg/周、約 0.10 μ Mol/Kg/周)的劑量施用于所述對象。在特定實施方式中，所述胰島素受體拮抗劑以約ΙμΜοΙ/Kg/周的劑量施用于所述對象。
[0018]在某些所描述的實施方式中，所述疾病選自糖尿病(例如I型糖尿病或II型糖尿病)、代謝綜合征、葡萄糖耐受不良和肥胖癥。
[0019]還公開了一種鑒定用于治療與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病的候選治療劑(例如胰島素受體拮抗劑)的方法，所述方法包括將適合的細胞與受試藥劑相接觸；以及測定所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響，其中提高TD26水平或活性的受試藥劑是用于治療與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病的候選治療劑。在某些情況下，通過將所述受試藥劑的影響與已知提高TD26水平或活性的治療劑的影響進行比較，來評估所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響。通過本文描述的工作鑒定到的一種這樣的治療劑是例如S961。在某些情況下，通過測定所述受試藥劑對TD26的基因表達水平的影響來評估所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響。
[0020]在其他情況下，本發(fā)明設想了通過施用一種或多種胰島素受體拮抗劑來增加β-細胞復制或增殖的方法。適合的拮抗劑例如可以干擾胰島素與胰島素受體相互作用的能力，或可以中和胰島素的生物學效應。胰島素受體拮抗劑例如可以提高TD26的水平或活性，優(yōu)選地不顯著提高血糖水平或僅暫時提高血糖水平。在某些實施方式中，本文描述了通過施用一種或多種胰島素受體拮抗劑來治療糖尿病的方法。
[0021]應該理解，本發(fā)明的所有情況可以與本文中描述的其他情況相組合，并且僅僅出于簡潔的目的，沒有窮舉性地列出所有可能的組合和排列。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬【技術領域】的普通技術人員通常理解的具有相同含義。盡管在本發(fā)明的實踐中可以使用與本文中所描述的那些方法和材料類似或等同的方法和材料，但在下面出于示例的目的描述了適合的方法和材料。本文中提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻，以其全文明確地通過參考并入本文。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。本文中描述的材料、方法和實施例僅僅是說明性的而不打算是限制性的。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點從下面的詳細描述和權利要求書將變得顯而易見并被其所涵蓋。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1A-1D顯示 了胰島素受體拮抗劑S961誘導β-細胞復制。圖1A示出了使用對照處理10天，圖1B示出了使用S961處理10天(三重免疫熒光染色，使用DAPI作為細胞核的標志物，為藍色，抗胰島素抗體染色作為β -細胞的標志物，為綠色，抗Ki67抗體(復制和細胞增殖的標志物)將增殖細胞的細胞核標記為紅色)。白色箭頭指向復制的細胞。圖1C是條形圖，示出了使用劑量逐漸增加(從0.125 μ Mol/Kg/周至I μ Mol/Kg/周)的S961處理7天后的Ki67+/胰島素+%。圖1D是條形圖，示出了在用劑量逐漸增加(從0.125 μ Mol/Kg/周至I μ Mol/Kg/周)的S961處理7天后β -細胞面積/胰腺面積的顯著增加。這些實驗中的對照是不含S961的介質。為了計算Ki67+/胰島素+百分率和β-細胞面積/胰腺面積，將整個胰腺冷凍切片并免疫染色，并使用標準的圖形分析工具例如Metamorph和Photoshop進行定量。
[0023]圖2A-2F顯示了受胰島素受體拮抗劑S961誘導的基因TD26在肝臟中高表達，并且是分泌蛋白。圖2A示出了在用S961處理7天后肝臟組織的基因表達微陣列分析。接近于對角線的基因在處理和未處理的肝臟中顯示出相似的表達值。在標為“3倍”的紅色細線之間的區(qū)域之外的點，表示在處理條件下顯著上調或下調的基因。用黑色箭頭標出的一個上調基因是EG624219(TD26的小鼠直系同源物)。圖2B示出了在用胰島素受體拮抗劑S961處理7天的小鼠中TD26mRNA的相對表達。在S961處理后，肝臟和脂肪中的TD26表達提高。圖2C示出了 TD26的小鼠直系同源物的預測的外顯子結構。圖2D示出了 TD26蛋白與小鼠和大鼠直系同源物的序列比對(人類(Homo sapiens, SEQ ID NO:1),小鼠(Mus musculus, SEQID NO: 2)和大鼠(Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 3))以及共有序列(SEQ ID NO: 4)。在 N-端包含推定的信號肽。圖2E示出了帶有Myc標簽的EG624219 (TD26的小鼠直系同源物)和TD26在!fepal-6細胞(小鼠肝細胞瘤細胞)中的表達。！fepal-6細胞已轉染有攜帶與Myc標簽融合的TD26的基因的質粒。用myc抗體對細胞進行染色。圖2F是western印跡,其示出了在293T細胞中，帶有myc標簽的小鼠EG624219 (小鼠TD26蛋白)和帶有myc標簽的TD26在48小時后分泌到上清液中，表明TD26的小鼠直系同源物和人類TD26兩者都是分泌蛋白。
[0024]圖3A和3B根據(jù)來自于B1GPS在線數(shù)據(jù)庫(http://b1gps.gnf.0rg)的組織微陣列數(shù)據(jù)顯示了 TD26在人類(圖3A)和小鼠(圖3B)組織中的表達，其示出了高且特異性的基因表達。圖3A示出了在人類肝臟中的高表達，而圖3B示出了在小鼠褐色脂肪組織、肝臟和胰腺中的高表達。
[0025]圖4A-4C示出了通過在第I天注射到尾靜脈中，EG624219(小鼠TD26直系同源物)DNA的體內(nèi)施用增加β -細胞復制。圖4Α (對照(綠色熒光蛋白(GFP)))和4Β (EG624219)示出了第9天的結果；Ki67是復制的標志物。胰島素的綠色染色示出了嵌套在胰腺外分泌部分中的胰島。胰島中的紅色點示出了復制的細胞。圖4C是條形圖，其示出了對照(GFP)與EG624219相比的Ki67+/胰島素+%。與對照注射的動物相比，EG624219注射的動物表現(xiàn)出β -細胞復制增加26倍(即EG624219注射的動物的平均值為5.76%，對照注射的動物的平均值為0.22%)。
[0026]圖5示出了 TD26在各種不同物種中的預測的序列同源性，所述物種包括小鼠(Mus musculus)、狗(Canis familiaris)、雞(Gallus gallus)、娃(Xenopus (Silurana)tropical is)、斑馬魚(Dan1 rer1)、負鼠(Monodelphis domestica)、猴(Macaca mulatta)和人類(Homo sapiens)。從該分析看出，TD26似乎是哺乳動物特有的基因，因為它沒有在雞、蛙或魚中發(fā)現(xiàn)。
[0027]圖6示出了人類TD26 (“查詢”，包括預測的信號序列部分)與人類血管生成素相關蛋白3前體(“sbjet”)的序列同源性。TD26 (SEQ ID NO:5)與血管生成素相關蛋白3前體(SEQ ID NO:6)顯示出22%的同一性和49%的同源性。
[0028]圖7示出了小鼠TD26直系同源物(“查詢”，EG624219 ；SEQ ID N0:7，其包括預測的信號序列部分)與小鼠血管生成素相關蛋白3前體(“sbjet”，SEQ ID N0:8)的序列同源性。
[0029]圖8示出了血管生成素相關蛋白3前體(人類，被稱為“angptl_3Hs”)(SEQ IDNO:9)、血管生成素相關蛋白3前體(小鼠，被稱為“angptl-3Mm”)(SEQ ID NO: 10)、血管生成素相關蛋白4前體(人類，被稱為“angptl-4Hs”)(SEQ ID NO: 11)、血管生成素相關蛋白4前體(小鼠，被稱為 “angptl-4Mm”)(SEQ ID NO: 12)、TD26 直系同源物(小鼠，EG624219) (SEQ10勵:2)和人類了026 (SEQ ID NO:1)的序列同源性。
[0030]圖9顯不了小鼠和人類TD26蛋白兩者都被預測為具有/[目號序列。
[0031]圖10顯示了人類TD26被預測為具有卷曲螺旋結構。
[0032]圖11是示出了在施用各種濃度的S961后血糖水平(mg/dL)隨時間變化的圖，表明在施用S961后，β -細胞復制增加而不顯著影響血糖水平。
[0033]圖12是條形圖，示出了在S661重復給藥后，正常小鼠胰腺中的β-細胞復制。復制的增加被顯示為與介質速率相比的增加倍數(shù)。通過免疫組織化學來分析復制。這些實驗中的對照是不含S661的介質。
[0034]圖13是條形圖，其示出了在S661重復給藥后，正常小鼠中的β-細胞復制。使用S661處理的細胞復制的增加被顯示為復制的百分率。通過流式細胞術來分析復制。這些實驗中的對照是不含S661的介質。(***p〈0.001 ;Student’ s T檢驗)
[0035]圖14A-14C顯示出在飲食誘導的肥胖癥(D1)小鼠中，S661的體內(nèi)施用增加β-細胞復制。圖14 (A)示出了在S661重復給藥后，在患有飲食誘導的肥胖癥的小鼠的胰腺中，β-細胞的復制增加，圖14 (B)示出了非β_細胞的復制。使用S661處理的β-細胞復制的增加被顯示為復制百分率；對非細胞的復制沒有影響。圖14(C)證實S661處理引起相對于胰腺總面積而言胰島面積增加。進行免疫組織化學來分析復制和胰島面積。(*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;Student，s T 檢驗)
[0036]圖15示出了通過注射到尾靜脈中來體內(nèi)施用編碼小鼠TD26多肽片段的質粒，誘導β_細胞復制。這些實驗中的對照是編碼GFP的質粒?！揪唧w實施方式】
[0037]本文描述的本發(fā)明的實施方式源自于肝細胞癌相關蛋白TD26 (在本文中稱為“TD26”)誘導胰腺β -細胞增殖這一觀察結果，以及胰島素受體拮抗劑S961在低劑量下也誘導胰腺β_細胞增殖這一觀察結果。調節(jié)、特別是提高β_細胞功能和細胞團并由此增加胰島素分泌的能力，提供了用于治療例如糖尿病的方式。因此，本文描述的工作提供了調節(jié)胰腺β -細胞增殖、血清胰島素水平、脂肪酸水平和血糖水平的方法，以及用于治療和/或預防包括糖尿病、肥胖癥和代謝綜合征的疾病的方法。
[0038]當在本文中使用時，術語細胞”或“胰腺細胞”包括原代胰腺細胞，源自于去分化細胞例如誘導 的多能干細胞(iPSC)的胰腺β-樣細胞，或從另一種來源的細胞(例如肝細胞、成纖維細胞或胰腺外分泌細胞)直接重編程的胰腺β-樣細胞。在一種實施方式中，β-細胞不是永生化細胞系(即β-細胞在培養(yǎng)中不無限期地增殖)。在一種實施方式中，β-細胞不是轉化的細胞(即β-細胞不表現(xiàn)出轉化性質，例如在軟瓊脂中生長或不存在接觸抑制，這僅僅是兩個實例)。
[0039]當在本文中使用時，術語“內(nèi)源胰腺β -細胞”或“原代胰腺β -細胞”是指哺乳動物胰腺的胰島素產(chǎn)生細胞或哺乳動物的胰腺β -細胞(β -細胞)表型的細胞。胰腺β -細胞的表型對于本領域普通技術人員來說是公知的，并且包括例如對葡萄糖水平的增加做出響應分泌胰島素，表達諸如C-肽、PDX-1多肽和Glut2的標志物，以及獨特的形態(tài)學特征，例如但不必定在體內(nèi)在胰腺的胰島中有序化，并且通常具有直徑約9-15 μ m的小的紡錘樣細胞。內(nèi)源胰腺細胞可以在胰島中發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的方法中，原代胰腺細胞可以在體外作為胰島的一部分而被接觸。
[0040]當在本文中使用時，術語“胰島素產(chǎn)生細胞”包括本文中描述的術語原代細胞以及本文中描述的術語胰腺β_樣細胞，其以組成性或誘導性方式合成(即，轉錄胰島素基因，翻譯胰島素原mRNA，以及將胰島素原mRNA修飾成胰島素蛋白)、表達(即，顯現(xiàn)由胰島素基因攜帶的表型特征)或分泌(將胰島素釋放到細胞外空間中)胰島素。
[0041]在一種情況下，所述方法包括將細胞與調節(jié)TD26蛋白的水平或活性的化合物或藥劑相接觸，或向對象施用所述化合物或藥劑。術語“調節(jié)蛋白水平或活性”是指上調(激活或提高活性)或下調(抑制)蛋白水平、活性或功能。在一種實施方式中，調節(jié)通過直接提高或抑制蛋白的活性、即通過與蛋白的直接物理相互作用來進行。在一種實施方式中，例如在信號轉導中，通過激活或抑制蛋白活性的上游效應子，來間接調節(jié)蛋白的活性。
[0042]在特定情況下，所需化合物或藥劑提高TD26的水平或活性(例如通過增加表達和/或分泌)。適合的化合物/藥劑包括但不限于化學化合物和化學化合物的混合物，例如小的有機或無機分子，糖類，寡糖，多糖，生物大分子例如肽、蛋白和肽類似物及衍生物，肽模擬物，核酸，核酸類似物和衍生物，從生物材料例如細菌、植物、真菌或動物的細胞或組織制得的提取物，天然存在或合成的組合物，肽，適體，以及抗體或其片段?；衔?藥劑可以是核酸RNA或DNA，并且可以是單鏈或雙鏈的。示例性核酸化合物包括但不限于編碼蛋白質激活劑或抑制劑(例如轉錄激活劑或抑制劑)的核酸、寡核苷酸、核酸類似物(例如肽核酸(PNA)、假互補PNA (pc-PNA)、鎖核酸(LNA)等)、反義分子、核酶、小的抑制性或激活性核酸序列(例如RNA1、shRNA1、siRNA、micro RNAi (mRNAi)、反義寡核苷酸等)。蛋白和/或肽類藥劑可以是調芐基因表達或蛋白活性的任何蛋白。非限制性實例包括突變的蛋白、治療性蛋白和截短的蛋白，例如其中所述蛋白在靶細胞中通常不存在或以較低水平表達。蛋白也可以選自遺傳工程改造的蛋白、肽、合成肽、重組蛋白、嵌合蛋白、抗體(例如干擾胰島素與胰島素受體之間的相互作用并提高TD26的水平或活性，從而導致β -細胞復制增加的抗體)、midibodies、微抗體(minibody )、三功能抗體(triabody)、人源化蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、修飾的蛋白及其片段。提高基因表達或提高基因所編碼的蛋白的水平或活性的化合物或藥劑，也被稱為激活劑或激活性化合物。降低基因表達或降低基因所編碼的蛋白的水平或活性的化合物或藥劑，也被稱為抑制劑或抑制性化合物。 [0043]在某些實施方式中，提高TD26水平或活性的藥劑包括但不限于TD26蛋白或多肽(包括人類TD26及其同源物，以及來自于非人類物種例如小鼠的直系同源多肽和蛋白)及其功能性片段，編碼TD26蛋白和多肽及其功能性片段的核酸分子，以及胰島素受體拮抗劑。
[0044]本發(fā)明的方法設想了使用任何胰島素受體拮抗劑。例如，胰島素受體拮抗劑可以是干擾胰島素與胰島素受體相互作用的能力的藥劑，以及能夠中和胰島素的生物學效應并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平或僅暫時提高血糖水平的藥劑。本領域技術人員將會理解，適合的胰島素受體拮抗劑是與胰島素信號轉導相互作用并能增加β_細胞復制的拮抗劑。在某些實施方式中，這樣的胰島素受體拮抗劑提高TD26的水平或活性，并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平或僅暫時提高血糖水平。應該理解，適合的胰島素受體拮抗劑包括但不限于上面描述的任何適合的化合物/藥劑，其在施用于個體時能夠提高TD26的水平或活性并增加β -細胞復制，并且優(yōu)選地不引起顯著的、非暫時性的血糖水平升高。
[0045]在某些情況下，增加細胞復制的胰島素受體拮抗劑可以是蛋白或肽。在某些實施方式中，蛋白或肽類胰島素受體拮抗劑提高TD26的水平或活性。本領域技術人員將會理解，本發(fā)明的肽類胰島素受體拮抗劑可以以它們的肽形式或作為編碼所述肽并能夠在體內(nèi)翻譯以產(chǎn)生具有所需生物活性的肽的核酸來施用。
[0046]在某些情況下，肽類胰島素受體拮抗劑包含第一功能性部分、第二功能性部分和它們之間的連接物，所述連接物優(yōu)選被工程化改造以具有柔性和/或溶解性。
[0047]第一和第二功能性部分可以包含例如表現(xiàn)出的對胰島素受體的親和性大于或等于胰島素對胰島素受體的親和性的氨基酸序列(例如親和性優(yōu)化的位點)。
[0048]在某些實施方式中，第一功能性部分包含具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的肽。在某些實施方式中，第一功能性部分包含具有與SEQ ID NO: 18的同一性為至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。
[0049]在某些實施方式中，連接物包含柔性連接物。在某些實施方式中，連接物包含可溶的連接物。在某些實施方式中，連接物包含氨基酸連接物。在某些實施方式中，氨基酸連接物具有一個或多個氨基酸殘基。在其他實施方式中，氨基酸連接物具有多達7個氨基酸殘基。在某些實施方式中，連接物包含一個或多個甘氨酸殘基和一個或多個絲氨酸殘基。在某些實施方式中，連接物包含一個或多個GGS重復序列(例如GGS、GGSGGS, GGSGGSGGS等)。在一種實施方式中，柔性連接物包含SEQ ID NO: 19。在某些實施方式中，柔性連接物包含如Schaffer等(Schaffer等，PNAS100 (8):4435-4439 (2003)，其全部內(nèi)容通過參考并入本文)中所描述的基于乙二醇的連接物。在一種實施方式中，連接物包含基于三乙二醇的連接物。
[0050]在某些實施方式中，第二功能性部分包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的肽。在某些實施方式中，第二功能性部分包含具有與SEQ ID NO:20的同一性為至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。在某些實施方式中，第二功能性部分包含具有氨基酸序列SLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY (SEQ ID N0:23)的肽。在某些實施方式中，第二功能性部分包含具有與SEQ ID NO: 23的同一性為至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。在某些實施方式中，第二功能性部分包含具有氨基酸序列L-Xaa-Xaa-EWA-Xaa-Xaa-QCEV-Xaa-GRGCPS (SEQ ID NO:24)的肽，其中Xaa是任何氨基酸。在某些實施方式中，第二功能性部分包含具有與SEQ ID NO:24的同一性為至少80%的氨基酸序列并保留所需生物活性的肽。 [0051]在某些實施方式中，增加細胞復制的肽類胰島素受體拮抗劑包含肽S961(SEQID NO: 16，具有酸C-端)。在某些實施方式中，肽S961提高TD26的水平或活性，并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平，或僅暫時提高血糖水平。
[0052]在某些情況下，肽S961 (或其功能性部分)或編碼肽S961的核酸包含變體序列。變體序列可以包括一種或多種序列變體，只要這樣的變體不消除增加β -細胞復制的效應即可。在某些實施方式中，序列變體包含保守變體。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的編碼S961肽的核酸包含與編碼S961的核酸的同一'丨生為至少80%的核苷酸序列。
[0053]在某些實施方式中，本發(fā)明的S961肽包含與S961肽的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述S961肽包含與SEQ ID NO: 16的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述肽包含與SEQ ID NO: 18的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述肽包含與SEQ ID NO:23的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述肽包含以從N-端到C-的次序與SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:23的同一性為至少80%并具有酸C-端的氨基酸序列。
[0054]在某些實施方式中，增加細胞復制的肽類胰島素受體拮抗劑包含肽S661(SEQID NO: 16，具有酰胺C-端)。在某些實施方式中，肽S661提高TD26的水平或活性，并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平，或僅暫時提高血糖水平。在某些情況下，肽S661 (或其功能性部分)或編碼肽S661的核酸包含變體序列，只要這樣的變體不消除增加細胞復制的效應即可。在某些實施方式中，序列變體包含保守變體。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的編碼S661肽的核酸包含與編碼S661的核酸的同一'丨生為至少80%的核苷酸序列。
[0055]在某些實施方式中，本發(fā)明的S661肽包含與S661肽的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述S661肽包含與SEQ ID NO: 16的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述肽包含與SEQ ID NO: 18的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述肽包含與SEQ ID NO:23的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述肽包含以從N-端到C-的次序與SEQ ID NO: 18、19和23的同一性為至少80%并具有酰胺C-端的氨基酸序列。
[0056]在某些實施方式中，增加細胞復制的肽類胰島素受體拮抗劑包含肽RB537(SEQ ID NO: 17)。在某些實施方式中，肽RB537提高TD26的水平或活性，并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平，或僅暫時提高血糖水平。在某些情況下，肽RB537 (或其功能性部分)或編碼肽RB537的核酸包含變體序列，只要這樣的變體不消除增加β-細胞復制的效應即可。在某些實施方式中，序列變體包含保守變體。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的編碼RB537肽的核酸包含與編碼RB537的核酸的同一性為至少80%的核苷酸序列。
[0057]在某些實施方式中，本發(fā)明的RB537肽包含與RB537肽的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述RB537肽包含與SEQ ID NO: 17的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述RB537肽包含與SEQ ID NO: 18的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述RB537肽包含與SEQ ID NO: 20的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述RB537肽包含以從N-端到C-的次序與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20的同一性為至少80%的氨基酸序列。
[0058]在某些實施方式中，增加細胞復制的胰島素受體拮抗劑包含抗體。在某些實施方式中，增加β_細胞復制的胰島素受體拮抗劑包含與胰島素受體結合的抗體。在某些實施方式中，胰島素受體拮抗劑抗體提高TD26的水平或活性，并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平，或僅暫時提高血糖水平。當在本文中使用時，“抗體”以最寬泛的含義使用，并包括完全組裝的抗體、四聚體抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、能夠結合抗原的抗體片段(例如Fab’、F’(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙功能抗體(diabody)),以及包含任何上述物質 的重組肽，只要它們表現(xiàn)出所需生物活性即可?！懊庖咔虻鞍住被颉八木垠w抗體”是四聚體糖蛋白，其由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，每條鏈包含可變區(qū)和恒定區(qū)?？乖Y合部分可以通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶切割或化學切割來產(chǎn)生?？贵w片段或抗原結合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、結構域抗體(dAb)、互補決定區(qū)(⑶R)片段、CDR移植抗體、單鏈抗體(scFv)、單鏈抗體片段、嵌合抗體、雙功能抗體、三功能抗體(triabody)、四功能抗體(tetrabody)、微抗體(minibody)、線性抗體、螯合重組抗體、tribody或bibody、胞內(nèi)抗體(intrabody)、納米抗體、小模塊化免疫藥物(SMIP)、抗原結合結構域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝源化抗體、含VHH抗體、或其變體或衍生物，以及含有足以提供對多肽的特異性抗原結合的至少一部分免疫球蛋白例如1、2、3、4、5或6個CDR序列的多肽，只要抗體保留所需生物活性即可。“抗體變體”是指在天然抗體可變區(qū)結構域的可變區(qū)中含有至少一個氨基酸置換、缺失或插入的抗體多肽序列。變體可以與未修飾的抗體基本上同源或基本上一致?！扒逗峡贵w”是指含有源自于兩種不同抗體的序列的抗體(參見例如美國專利號4，816，567)，所述兩種不同抗體通常源自于不同物種。最通常情況下，嵌合抗體包含人類和嚙齒類抗體片段，一般為人類恒定區(qū)和小鼠可變區(qū)。
[0059]在某些實施方式中，可能適合用于本發(fā)明的胰島素受體拮抗劑的實例可以包括文獻中報道的表現(xiàn)出所需生物活性的抗胰島素受體抗體(參見例如Roth等，J B1l Chem.19830ct25; 258 (20): 12094-7 ；Morgan 等，Proc Natl Acad Sci U SA.1986Jan;83 (2):328-32 ；Taylor 等，B1chem J.1987Febl5;242 (I):123-9 ；Nagy等，Endocrinology.1990Jan;126 (I):45-52 ；和 Fujita 等,Acta Diabetol.2002Dec;39
(4):221-7).在某些實施方式中，抗胰島素受體抗體可以提高TD26的水平或活性，并優(yōu)選地不顯著提高血糖水平，或僅暫時提高血糖水平。
[0060]在某些實施方式中，本發(fā)明設想了編碼本發(fā)明的抗體和肽的多核苷酸。本發(fā)明還設想了包含這樣的多核苷酸的載體、包含這樣的多核苷酸或載體的宿主細胞以及生產(chǎn)本發(fā)明的抗體和多肽的方法，所述方法包括將這樣的宿主細胞在培養(yǎng)基中在適合的條件下生長，并任選地從所述宿主細胞或培養(yǎng)基分離編碼的抗體或多肽，任選地隨后進一步純化所述抗體或多肽。抗體的分離和純化方法完全在本領域普通技術人員的水平范圍之內(nèi)。
[0061]在某些實施方式中，能夠增加細胞復制的胰島素受體拮抗劑包含化學化合物，例如低分子量有機分子。在某些實施方式中，所述化學化合物提高TD26的水平或活性。
[0062]術語“增加”、“提高”、“增強”或“激活”在本文中都用于一般性地表示顯著量的增加。在本發(fā)明的這種和其他情況的某些實施方式中，與對照相比，TD26蛋白的水平或活性被提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少I倍、至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更多。在本發(fā)明的這種和其他情況的某些實施方式中，蛋白活性的激活劑具有低于或等于500ηΜ、低于或等于250ηΜ、低于或等于100ηΜ、低于或等于50nM、低于或等于10nM、低于或等于InM、低于或等于0.1nM、低于或等于0.01nM或者低于或等于0.0OlnM的EC50。蛋白活性可以通過本領域技術人員公知的手段來測定，并且可以根據(jù)情況通過不同方法或測定法來測定。
[0063]在其他情況下，所述化合物或藥劑降低TD26的水平或活性(例如通過降低表達和/或分泌)。降低TD26的表達和/或分泌對于治療以胰島素水平過高為特征的疾病來說可能是理想的，所述疾病可能因TD26水平或活性增加而加重，例如胰島素瘤。
[0064]術語“減小”、“降低”、“減少”或“抑制”在本文中都用于一般性地表示顯著量的降低。在本發(fā)明的這種和其他情況的某些實施方式中，與對照相比，基因所編碼的蛋白的水平或活性被抑制或降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100% (例如活性完全喪失)。在本發(fā)明的這種和其他情況的某些實施方式中，抑制劑具有低于或等于500nM、低于或等于250nM、低于或等于100ηΜ、低于或等于50nM、低于或等于10nM、低于或等于InM、低于或等于0.1nM、低于或等于0.01nM或者低于或等于0.0OlnM的IC50。降低TD26水平或活性的化合物包括例如抗TD26抗體、靶向TD26的反義分子和靶向TD26的siRNA分子。
[0065]適合用于本發(fā)明的TD26蛋白和多肽包括例如人類TD26蛋白和多肽。人類TD26蛋白序列已被保存在GENBANK?，登記號為NP_061157.3。人類TD26蛋白的氨基酸序列為:
[0066]MPVPALCLLffALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA (SEQ ID NO:1 ;帶下劃線的為預測的信號序列)。
[0067]因此，在某些實施方式中，本文描述的方法包括將細胞或培養(yǎng)基與SEQ ID NO:1的多肽或其片段例如功能性部分(或編碼所述多肽或片段的核酸)相接觸，或者將它們施用到對象。當在本文中使用時，TD26的功能性部分或片段是在例如施用到哺乳動物后或在受試動物中增加細胞復制的功能性部分或片段。適合的片段包括例如缺少天然信號序列的SEQ ID NO:1的多肽和包含卷曲螺旋結構域(CXD)的SEQ ID NO:1的多肽部分。
[0068]在某些實施方式中，可用于在體內(nèi)提高TD26的水平或活性和/或增加β-細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分，缺少一個或多個結構域(例如參考SEQ ID NO:1)。
[0069]在某些實施方式中，TD26的功能性部分缺少LPL結構域。在某些實施方式中，TD26的功能性部分缺少一個或多個CCD (例如缺少第一和/或第二 CCD)。在某些情況下，多肽可能缺少整個結構域，而在其他情況下，多肽可能缺少完整(完全)結構域(即可能含有一部分結構域)。在某些情況下，多肽可能缺少功能性結構域(例如功能性LPL結構域或功能性CCD )。
[0070]或者，可用于在體內(nèi)提高TD26的水平或活性和/或增加β -細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分，包含TD26蛋白的一個或多個結構域(例如完整結構域或功能性結構域)。在某些實施方式中，TD26的功能性部分包含LPL結構域。在某些實施方式中，TD26的功能性部分包含一個或多個CXD (例如第一 CXD和/或第二 (XD)。在某些實施方式中，TD26的功能性部分包含TD26的第一和第二C⑶之間的一些或所有氨基酸序列(“間插序列”或 “IVS，，)。
[0071]在某些實施方式中，TD26的功能性部分不包含TD26的天然信號序列或完整的氨基酸序列或核苷酸序列，或者所述功能性部分不包括缺少信號肽的TD26的完整氨基酸序列或編碼缺少信 號肽的TD26的完整氨基酸序列的核酸。應該理解，在許多分泌蛋白中，信號序列被切割掉，并且不是最終蛋白的多肽序列的一部分。
[0072]在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第22至76位氨基酸的肽。在某些實施方式中，TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第22至76位氨基酸的肽，其包含一個或多個保守氨基酸置換，只要所述肽保留增加細胞復制的能力即可。
[0073]在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含LPL結構域，但是缺少CCDUIVS和CCD2。在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加β -細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含預測的LPL結構域，但是缺少預測的CXDl、預測的IVS和預測的(XD2。
[0074]在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第48至76位氨基酸的肽。在某些實施方式中，TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第48至76位氨基酸的肽，其包含一個或多個保守氨基酸置換，只要所述肽保留增加細胞復制的能力即可。
[0075]在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分缺少完整的LPL結構域以及(XD1、IVS和(XD2。在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加β -細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含缺少完整的LPL結構域、(XD1、IVS和(XD2的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加β _細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分缺少完整的預測的LPL結構域以及預測的CCD1、預測的IVS和預測的CCD2。
[0076]在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第77至135位氨基酸的肽。在某些實施方式中，TD26多肽或蛋白的功能性部分包含SEQ ID NO:1的多肽的第77至135位氨基酸的肽，其包含一個或多個保守氨基酸置換，只要所述肽保留增加β -細胞復制的能力即可。
[0077]在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含CCD1，但是缺少CCD2、IVS和LPL結構域。在一種實施方式中，可用于在體內(nèi)增加β -細胞復制的TD26多肽或蛋白的功能性部分包含預測的CCD1，但是缺少預測的CCD2、預測的IVS和預測的LPL結構域。
[0078]本領域技術人員將會理解，上面針對SEQ ID NO:1所描述的TD26的功能性部分的描述僅僅是示例性的。例如，這樣的描述同樣適用于SEQ ID Ν02-4。
[0079]在某些實施方式中，SEQ ID NO:1的功能性多肽包含其中信號序列被能夠指導多肽分泌的序列例如人生長激素信號肽代替的蛋白序列。在其他實施方式中，適用于本發(fā)明的多肽和蛋白包括SEQ ID NO:2, SEQ ID Ν0:3和SEQ ID NO:4的多肽及其功能性片段。其他適合的多肽和蛋白可以通過與人類TD26的氨基酸序列進行比較來鑒定，以鑒定與人類TD26具有顯著的序列同一性或同源性的多肽和蛋白。同一性或同源性可以存在于整個蛋白或多肽上，或者可以僅僅或主要存在于蛋白或多肽的特定結構域(例如CCD結構域或其他功能性結構域)上。用于進行這樣的序列比較的計算機化算法在本領域中是已知的，并且示例性的方法已被用在本文描述的工作中。例如，氨基酸序列(和核酸序列)同源性的計算機算法分析可以包括利用任意數(shù)量的可用的軟件包，例如BLAST、DOMAIN、BEAUTY (BLAST增強的比對實用程序)、GENPEPT和TREMBL軟件包。
[0080]有用的核酸分子及其編碼的多肽是指相應基因的核酸的所有形式(例如基因、mRNA前體、mRNA)或蛋白，它們的多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物(適用于核酸或蛋白)，其:(I)氨基酸序列與本文描述的多肽優(yōu)選地在至少約20、25、30、35、40、45、50、75個或更多個氨基酸的區(qū)域內(nèi)，具有高于約80%的氨基酸序列同一性或高于約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或更高的氨基酸序列同一性；(2)特異性結合于抗體例如多克隆抗體，所述抗體針對包含參比氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段及其保守修飾的變體而產(chǎn)生；(3)在嚴緊雜交條件下與編碼參比氨基酸序列及其保守修飾的變體的核酸特異性雜交；(4)核酸序列與本文描述的參比核苷酸序列優(yōu)選地在至少約20、25、30、35、40、45、50、75、100、200個或更多個核苷酸的區(qū)域內(nèi)，具有高于約80%，優(yōu)選地高于約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列同一性。在某些實施方式中，參比核苷酸序列缺少編碼信號序列的部分。
[0081]在某些情況下，TD26核酸(即編碼TD26多肽或其功能性部分的核酸)或TD26蛋白序列包含變體序列。變體序列可以包括一種或多種天然存在的序列變體。天然存在的序列變體的非限制性實例包括下面表1中鑒定的一個或多個單核苷酸多態(tài)性或氨基酸變體。因此，本發(fā)明的TD26序列可以包含天然存在的(以及非天然存在的)變體，只要這樣的變體不消除TD26序列的β-細胞增殖效應即可。在某些實施方式中，序列變體包含保守變體。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的編碼TD26蛋白的核酸包含與TD26核酸的同一性為至少80%的核苷酸序列。在某些情況下，所述核酸包含與SEQ ID NO: 14的同一性為至少80%的核苷酸序列。在某些情況下，所述核酸包含與SEQ ID NO: 15的同一性為至少80%的核苷酸序列。在某些情況下，所述核酸包含一個或多個天然存在的單核苷酸多態(tài)性。[0082]在某些實施方式中，本發(fā)明的TD26蛋白包含與TD26蛋白的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些實施方式中，本發(fā)明的TD26蛋白包含與TD26蛋白的分泌部分(即不包含信號序列的部分)的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述蛋白包含與SEQ ID NO:1的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述蛋白包含與SEQ IDNO:2的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述蛋白包含與SEQ ID NO:3的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述蛋白包含與SEQ ID N0:4的同一性為至少80%的氨基酸序列。在某些情況下，所述蛋白序列包含一個或多個天然存在的氨基酸變體。
[0083]表1:TD26單核苷酸多態(tài)性
【權利要求】
1.一種用于增加需要的對象中的胰腺β-細胞增殖的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，由此增加胰腺β-細胞的增殖。
2.一種用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，由此在所述對象中增加胰腺β-細胞的增殖并提高內(nèi)源胰島素的水平。
3.一種用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素抗性相關的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，由此在所述對象中增加胰腺β-細胞的增殖并提高內(nèi)源胰島素的水平。
4.一種用于增加對象中的胰腺細胞的增殖或者治療或預防對象中的糖尿病的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的藥劑，由此提高所述對象中的內(nèi)源胰島素的水平，所述藥劑是肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)或其功能性部分或者編碼TD26或其功能性部分的核酸。
5.權利要求1、2或3任一項的方法，其中所述藥劑提高所述對象中內(nèi)源TD26的水平或活性。
6.權利要求1、2或3任一項的方法，其中所述藥劑提高TD26的表達。
7.權利要求1、2或3任一項的方法，其中所述藥劑增加TD26的分泌。
8.權利要求1、2、3或4任一項的方法，其中所述藥劑是TD26蛋白或其功能性部分。
9.權利要求8的方法，其中所述功能性部分不包含TD26的完整氨基酸序列或天然信號肽序列。
10.權利要求8或9任一項的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的一個或多個功能性結構域或完整結構域的肽。
11.權利要求8、9或10任一項的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性LPL結構域或完整的LPL結構域的肽。
12.權利要求8、9、10或11任一項的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性CCD結構域或完整的CCD結構域的肽。
13.權利要求8、9、10、11或12任一項的方法，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性IVS或完整的IVS的肽。
14.權利要求8或9任一項的方法，其中所述功能性部分包含選自下列的肽:SEQIDNO:1的第22至76位氨基酸的肽，SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽，和SEQ ID NO:1的第77至135位氨基酸的肽。
15.權利要求1、2、3或4任一項的方法，其中所述藥劑是編碼TD26蛋白或TD26的功能性部分的核酸。
16.權利要求15的方法，其中所述核酸編碼TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分不包含TD26的完整氨基酸序列或天然信號肽。
17.權利要求15或16任一項的方法，其中所述核酸編碼TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的一個或多個功能性結構域或完整結構域。
18.權利要求15、16或17任一項的方法，其中所述核酸編碼TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的功能性LPL結構域或完整的LPL結構域。
19.權利要求15、16、17或18任一項的方法，其中所述核酸編碼TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的功能性CCD結構域或完整的CCD結構域。
20.權利要求15、16、17、18或19任一項的方法，其中所述核酸編碼TD26蛋白的功能性部分，所述功能性部分缺少TD26的功能性IVS或完整的IVS。
21.權利要求15或16任一項的方法，其中所述功能性部分包含編碼選自下列的肽的核酸:SEQ ID NO:1的第22至76位氨基酸的肽，SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽，和SEQ ID NO:1的第77至135位氨基酸的肽。
22.權利要求8或15任一項的方法,其中所述TD26蛋白缺少信號序列。
23.權利要求8、15或22任一項的方法，其中所述功能性部分包含TD26蛋白的卷曲螺旋結構域。
24.權利要求8、15、22或23任一項的方法，其中所述TD26蛋白包含SEQID NO: 1、SEQID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 的全部或一部分。
25.權利要求8或15任一項的方法，其中所述TD26蛋白包含一個或多個天然存在的氨基酸變體。
26.權利要求8或15任一項的方法，其中所述TD26蛋白包含與SEQID NO: 1、SEQ IDNO:1的第22-198位氨基酸、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的同一性為至少80%的氨基酸序列。
27.權利要求15的方法，其中所述核酸包含SEQID NO: 14或SEQID NO: 15的全部或一部分。
28.權利要求15的方法,其中所述核酸包含一個或多個單核苷酸多態(tài)性。
29.權利要求15的方法，其中所述核酸包含與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 15的同一性為至少80%的核苷酸序列。
30.權利要求1、2或3任一項的方法，其中所述藥劑是胰島素受體拮抗劑。
31.權利要求1、2、3或30任一項的方法，其中所述藥劑選自S661、S661的功能性部分、S961、S961的功能性部分、RB537和RB537的功能性部分。
32.權利要求31的方法，其中所述藥劑以足以引起β_細胞增殖的劑量施用于所述對象，并且選自S961、S961的功能性部分、S661和S661的功能性部分。
33.權利要求1、2、3或30任一項的方法，其中所述藥劑以足以引起β-細胞增殖的劑量施用于所述對象，并且選自SEQ ID NO: 16,SEQID NO: 16的功能性部分、SEQ ID NO: 17和SEQID NO: 17的功能性部分。
34.權利要求1、2、3或18任一項的方法，其中所述藥劑是選自下列的肽:具有與SEQIDNO: 16的同一性為至少80%的氨基酸序列的肽，和具有與SEQ ID NO: 17的同一性為至少80%的氨基酸序列的肽。
35.權利要求2或3任一項的方法，其中所述疾病選自糖尿病、代謝綜合征、葡萄糖耐受不良和肥胖癥。
36.權利要求2或3任一項的方法，其中所述疾病是I型糖尿病或II型糖尿病。
37.權利要求4的方法，其中所述糖尿病是I型糖尿病或2型糖尿病。
38.權利要求1的方法，其中增加細胞的增殖引起所述對象中細胞團增加。
39.一種用于增加需要的對象中的胰腺β_細胞增殖的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的胰島素受體拮抗劑。
40.胰島素受體拮抗劑在增加需要的對象中的胰腺細胞的增殖中的應用。
41.胰島素受體拮抗劑在制造用于增加需要的對象中的胰腺β_細胞增殖的藥物中的應用。
42.權利要求39、40或41任一項的應用，用于治療糖尿病。
43.一種鑒定能夠增加胰腺β_細胞增殖的候選藥劑的方法，所述方法包括評估所述候選藥劑拮抗胰島素受體的能力。
44.一種鑒定用于增加胰腺β_細胞增殖的候選治療劑的方法，所述方法包括: 將適合的細胞與受試藥劑相接觸；以及 測定所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響， 其中提高TD26水平或活性的受試藥劑是用于增加胰腺β -細胞增殖的候選治療劑。
45.一種鑒定用于治療與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病的候選治療劑的方法，所述方法包括: 將適合的細胞與受試藥劑相接觸；以及 測定所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響， 其中提高TD26水平或活性的受試藥劑是用于治療與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病的候選治療劑。
46.一種鑒定用于治療或預防與內(nèi)源胰島素抗性相關的疾病的候選治療劑的方法，所述方法包括: 將適合的細胞與受試藥劑相接觸；以及 測定所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響， 其中提高TD26水平或活性的受試藥劑是用于治療或預防與內(nèi)源胰島素抗性相關的疾病的候選治療劑。
47.權利要求44、45或46任一項的方法，其中測定所述受試藥劑對TD26的水平或活性的影響通過測定所述受試藥劑對TD26的基因表達水平的影響來評估。
48.一種提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，其用于增加需要的對象中的胰腺細胞的增殖。
49.一種提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，其用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病。
50.一種提高肝細胞癌相關蛋白TD26 (TD26)的水平或活性的藥劑，其用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素抗性相關的疾病。
51.一種藥劑，其是TD26蛋白或其功能性部分或者編碼TD26蛋白或TD26的功能性部分的核酸，所述藥劑用于增加β -細胞增殖或者治療或預防糖尿病，特別是I型糖尿病或2型糖尿病。
52.權利要求48、49、50或51任一項的藥劑，其中所述藥劑包含TD26蛋白或其功能性部分。
53.權利要求48、49、50或51任一項的藥劑，其中所述藥劑是編碼TD26蛋白或其功能性部分的核酸。
54.權利要求52或53任一項的藥劑，其中所述TD26蛋白缺少信號序列。
55.權利要求52、53或54任一項的藥劑，其中所述功能性部分包含TD26蛋白的卷曲螺旋結構域。
56.權利要求52、53、54或55任一項的藥劑，其中所述TD26蛋白包含SEQID NO: 1、SEQID NO:1 的第 22-198 位氨基酸、SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 的全部或一部分。
57.權利要求52或53任一項的藥劑，其中所述TD26蛋白包含一個或多個天然存在的氨基酸變體。
58.權利要求52或53任一項的藥劑，其中所述TD26蛋白包含與SEQID NO: 1、SEQ IDNO:1的第22-198位氨基酸、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的同一性為至少80%的氨基酸序列。
59.權利要求53的藥劑，其中所述核酸包含SEQID NO: 14或SEQID NO: 15的全部或一部分。
60.權利要求53的藥劑,其中所述核酸包含一個或多個單核苷酸多態(tài)性。
61.權利要 求53的藥劑，其中所述核酸包含與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 15的同一性為至少80%的核苷酸序列。
62.權利要求48、49或50任一項的藥劑，其中所述藥劑是胰島素受體拮抗劑。
63.權利要求48、49、50或62任一項的藥劑，其中所述藥劑選自S661、S661的功能性部分、S961、S961的功能性部分、RB537和RB537的功能性部分。
64.權利要求63的藥劑，其中所述藥劑以引起β-細胞增殖的劑量施用于所述對象，并且選自S961、S961的功能性部分、S661和S661的功能性部分。
65.權利要求48、49、50、62或63任一項的藥劑，其中所述藥劑以引起β-細胞的增殖的劑量施用于所述對象，并且選自SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 16的功能性部分、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 17的功能性部分。
66.權利要求48、49、50、62或63任一項的藥劑，其中所述藥劑是選自下列的肽:具有與SEQ ID NO: 16的同一性為至少80%的氨基酸序列的肽，和具有與SEQ ID NO: 17的同一性為至少80%的氨基酸序列的肽。
67.TD26蛋白或其功能性部分或者編碼TD26蛋白或其功能性部分的核酸在制造用于增加胰腺β_細胞的增殖、或用于治療或預防與內(nèi)源胰島素水平降低相關的疾病、或用于治療或預防對象中與內(nèi)源胰島素抗性相關的疾病、或用于治療I型糖尿病或2型糖尿病的藥物中的應用。
68.S961或其功能性部分在制造用于優(yōu)選地通過提高TD26的水平或活性來增加胰腺β-細胞的增殖并且優(yōu)選地不顯著提高血糖水平或僅暫時提高血糖水平的藥物中的應用。
69.S661或其功能性部分在制造用于優(yōu)選地通過提高TD26的水平或活性來增加胰腺β-細胞的增殖并且優(yōu)選地不顯著提高血糖水平或僅暫時提高血糖水平的藥物中的應用。
70.RB537或其功能性部分用于優(yōu)選地通過提高TD26的水平或活性來增加胰腺β -細胞的增殖并且優(yōu)選地不顯著提高血糖水平或僅暫時提高血糖水平的應用。
71.—種診斷受試個體中的TD26相關疾病的方法，所述方法包括: 測定從所述受試個體獲得的樣品中的TD26水平，其中與正常個體中的TD26水平相比，所述受試個體中提高或降低的TD26水平指示TD26相關的疾病。
72.—種診斷個體中的TD26相關疾病的方法，所述方法包括:檢測來自于所述個體的樣品中的TD26水平，其中與所述個體中以前的TD26水平相比，提高或降低的TD26水平指示TD26相關的疾病。
73.權利要求71或72任一項的方法，其中所述TD26水平降低，并且其中所述TD26相關疾病的特征在于以下一種或多種:β -細胞增殖減少、內(nèi)源胰島素水平降低和對內(nèi)源胰島素的敏感性降低。
74.權利要求71至73任一項的方法，其中所述TD26水平降低，并且其中所述TD-26相關疾病是I型糖尿病或2型糖尿病。
75.一種組合物，其包含由S961的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分構成的藥劑，所述功能性部分增加細胞的增殖。
76.一種組合物，其包含由S661的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分構成的藥劑，所述功能性部分增加細胞的增殖。
77.一種組合物，其包含由RB537的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分構成的藥劑，所述功能性部分增加細胞的增殖。
78.一種組合物，其包含由TD26的核酸序列或氨基酸序列的功能性部分構成的藥劑，所述功能性部分不包含缺少信號肽的TD26的完整氨基酸序列，并且增加β -細胞的增殖。
79.—種組合物，其包含TD26肽的功能性部分或編碼所述功能性部分的核酸，其中所述功能性部分能夠增加細胞的增殖。
80.權利要求79 的組合物，其中所述功能性部分不包括TD26的天然信號肽序列或完整的氨基酸序列或核苷酸序列，或者所述功能性部分不包括缺少信號肽的TD26的完整氨基酸序列或編碼缺少信號肽的TD26的完整氨基酸序列的核酸。
81.權利要求79或80任一項的組合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的一個或多個功能性結構域或完整結構域的肽或者編碼所述肽的核酸。
82.權利要求79、80或81任一項的組合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性LPL結構域或完整的LPL結構域的肽或者編碼所述肽的核酸。
83.權利要求79、80、81或82任一項的組合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性CCD結構域或完整的CCD結構域的肽或者編碼所述肽的核酸。
84.權利要求79、80、81、82或83任一項的組合物，其中所述功能性部分包含缺少TD26的功能性IVS或完整的IVS的肽或者編碼所述肽的核酸。
85.權利要求79的組合物，其中所述功能性部分包含選自下列的肽:SEQID NO:1的第22至76位氨基酸的肽、SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽、和SEQ ID NO:1的第77至135位氨基酸的肽，或者所述功能性部分包含編碼任一種所述肽的核酸。
86.—種組合物，其包含TD26多肽的一個或多個功能性結構域，其中TD26多肽的一個或多個功能性結構域增加細胞的增殖。
87.—種組合物，其包含編碼TD26多肽的一個或多個功能性結構域的一種或多種核酸，其中TD26的一個或多個功能性結構域增加β -細胞的增殖。
88.—種組合物，其包含增加細胞增殖的肽或編碼任一種所述肽的核酸，所述肽選自SEQ ID NO:1的第22至76位氨基酸的肽、SEQ ID NO:1的第48至76位氨基酸的肽、SEQID NO:1的第77至135位氨基酸的肽及其組合。
【文檔編號】A61K48/00GK104039357SQ201280036842
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年6月10日 優(yōu)先權日:2011年6月10日
【發(fā)明者】道格拉斯·A·梅爾頓, 伊鵬 申請人:哈佛學院校長同事會