專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎二價(jià)活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家禽疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種雞傳染性支氣管炎ニ價(jià)活疫苗，簡(jiǎn)
稱ニ價(jià)苗。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎(IB) 是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的ー種急性高度接觸性呼吸道疾病，以氣管啰音、咳嗽、打噴嚏；幼雞流鼻涕，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量減少和蛋的品質(zhì)下降為特征；患病雞常因呼吸道、腎臟或消化道感染而引起死亡。本病于1931年首先由Schalk等報(bào)道于美國(guó)，1936年由Beach和Hudson確定本病的病原為病毒。至今本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。在我國(guó)，鄺榮祿(1972)在廣東首次發(fā)現(xiàn)本??；到上世紀(jì)70年代后期，鄭福榮等在杭州、吳志達(dá)等在上海、艾國(guó)光等在北京、辛朝安等在廣州分別自種用雞群中分離出IBV。榮駿弓等(1997)在患有腺胃腫大的病雞中分離到腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒D971株，用該毒株回歸SPF雛雞引起典型腎炎及腺胃炎病變，并從人工感染SPF雛雞中回收到雞傳染性支氣管炎病毒。王玉東、范根成等(1998)在山東省某患有腺胃腫大發(fā)病雞群中采集病料，通過(guò)雞胚連續(xù)傳5 6代，經(jīng)電鏡觀察、動(dòng)物回歸和免疫保護(hù)試驗(yàn)、用氣管環(huán)組織培養(yǎng)進(jìn)行理化特性測(cè)定、毒價(jià)測(cè)定、中和試驗(yàn)等，證明目前流行的以腺胃腫大為主要特征的傳染病的病原是冠狀病毒，將該毒株命名為腺胃型雞傳染性支管炎病毒QX株。國(guó)外學(xué)者在歐洲，首先分別于2001年俄羅斯東部及2002年俄羅斯西部分離到IBV類QX株(Bochkov et al，2006)，該毒株能引起雞患腺胃炎、腎炎，與QX株相似。從2003年起許多歐洲國(guó)家相繼分離到IBV類QX株包括德國(guó)、荷蘭、比利時(shí)、法國(guó)、意大利(Worthingtonet al, 2008 ；Monne et al, 2008)、波蘭(Domanska-Blicharz et al, 2006)、英國(guó)(Gough etal，2008)和西班牙(Dolz et al，2009)。各種相關(guān)研究報(bào)道表明整個(gè)歐洲地區(qū)都有類QX株病毒的存在。顯然，IB類QX株對(duì)于禽養(yǎng)殖來(lái)說(shuō)是很大的威脅，而目前尚無(wú)專門針對(duì)IB類QX株的疫苗。國(guó)外學(xué)者將類QX毒株在雞胚上連續(xù)傳代80余代致弱的IB L1148毒株制成IB類QX株的活疫苗，并進(jìn)行相關(guān)的效力和安全性試驗(yàn)。表明對(duì)于SPF雞亦或是攜有母源抗體的雞，經(jīng)IB LI 148株制成的活苗免后對(duì)類QX株D388的攻毒都能提供有效保護(hù)。免疫接種是防治雞傳染性支氣管炎的最有效手段。目前，國(guó)內(nèi)外用于預(yù)防腺胃型傳染性支氣管炎疫苗的研究較多，但均尚未商品化。同時(shí)由于IBV血清型眾多，市場(chǎng)上ー直未有交叉保護(hù)カ好的弱毒株，腺胃型IB得不到有效控制。因此，篩選獲得新的具有較好保護(hù)カ的IB弱毒，并用于制備活體疫苗就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞傳染性支氣管炎ニ價(jià)活苗，即由新的腺胃型雞傳染性支氣管炎弱毒YB160株和呼吸型雞傳染性支氣管炎弱毒H120株作為制備抗原的疫苗株,本發(fā)明的ニ價(jià)苗對(duì)目前中國(guó)流行腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒和呼吸型雞傳染性支氣管炎病毒的攻擊能提供良好的免疫保護(hù)效カ。本發(fā)明的ニ價(jià)苗，由抗原和疫苗輔劑組成，其中抗原為保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6752的雞傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性支氣管炎弱毒H120株。上述的ニ價(jià)苗的一種制備方法，是將雞傳染性支氣管炎病毒YB160株和H120株分別接種雞胚后，收獲胚液獲得病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液；然后將雞傳染性支氣管炎病毒YB160株和雞傳染性支氣管炎病毒H120株擴(kuò)大培養(yǎng)液混合后,加入疫苗輔劑制成的。本發(fā)明制備的ニ價(jià)苗可預(yù)防腺胃型和呼吸型雞傳染性支氣管炎。而且，組成本發(fā)明篩選的腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒為多次傳代獲得的弱毒株，減少了現(xiàn)有傳染性支氣管炎病毒作為抗原所帯來(lái)的副作用。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)ー步描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。一、本發(fā)明雞傳染性支氣管炎弱毒YB160株的篩選使用l(Tll日齡SPF雞胚對(duì)傳染性支氣管炎強(qiáng)毒進(jìn)行連續(xù)傳代致弱，每代通過(guò)尿囊腔接種4枚SPF雞胚，連傳至160代，進(jìn)行致弱評(píng)價(jià)。取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160傳代接種的病毒株感染I日齡的SPF雞。結(jié)果從第80代病毒株開(kāi)始無(wú)死亡雞，第90代毒株接種雞開(kāi)始無(wú)眼觀病變，第130代接種雞開(kāi)始無(wú)組織學(xué)病變。說(shuō)明IBV第130代已經(jīng)完全致弱，對(duì)雞只具有良好的安全性。同時(shí)用本發(fā)明毒株130、140、150 160代毒分別免疫3日齡SPF雞,于免疫后14日，用同源強(qiáng)毒攻擊。免疫組分毒率0/10 1/10，保護(hù)率9/10 10/10，對(duì)照組分毒率10/10。結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明毒株具有良好的免疫保護(hù)性。為了便于同以前毒株區(qū)分，將傳代160代弱化的雞胚毒定為原始種子El代，并將該致弱毒株命名為YB160株。選取IBV YB 160株作為ニ價(jià)苗研制的候選毒株。并于2012年10月31日保藏于地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6752。ニ、IBV YB160株的安全性檢測(cè)毒力返強(qiáng)試驗(yàn)利用IBV強(qiáng)毒株在雞胚上連續(xù)傳160代，培育出免疫原性良好的弱毒株IBV-YB160株。該弱毒株El代在SPF雞體上人工感染和同居感染分別連續(xù)傳5代，試驗(yàn)雞均一切正常，接種后5天剖檢氣管、腺胃、腎臟等均未見(jiàn)肉眼病理變化；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒分離氣管棉拭子和腺胃第4代起分不到病毒，腎臟從第3代起分不到病毒，肝臟從第2代起分不到病毒。試驗(yàn)雞氣管、腺胃、腎臟等組織勻漿中分毒不同器官病毒分離率不同，氣管、腺胃病毒分離率較高，說(shuō)明該毒株主要在氣管、腺胃兩個(gè)器官増殖。隨著代次的増加病毒向外排泄也逐漸減少，分毒率逐漸降低。水平感染試驗(yàn)也出現(xiàn)人工感染同樣的規(guī)律，只是同居感染同代次分毒率相對(duì)人工感染低。以上試驗(yàn)結(jié)果證明該毒株無(wú)論人工感染還是水平傳播感染在雞體連續(xù)傳代，均未見(jiàn)毒カ返強(qiáng)現(xiàn)象，遺傳性穩(wěn)定，符合雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗毒株無(wú)毒カ返強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)，可以作為弱毒疫苗株進(jìn)行商品化開(kāi)發(fā)。IBV YB160 株毒種安全性試驗(yàn)取 YB160 株 E2、E4、E7、E10、E13 代毒種以 IO5 ciEID5tl滴鼻I滴(約0. 03ml)，分別接種1、3日齡SPF雞，連續(xù)觀察10日。結(jié)果接種雞只均健活，均無(wú)任何異常反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表1、2。表IIBV YB160株毒種的安全性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎二價(jià)活疫苗，由抗原和疫苗凍干保護(hù)劑組成，其中抗原為保藏編號(hào)為CGMCC No. 6752的雞傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性支氣管炎弱毒H120株。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗凍干保護(hù)劑為蔗糖和明膠，其在疫苗中的終濃度分別為5%和1%。
3.權(quán)利要求1所述的疫苗的制備方法，是將雞傳染性支氣管炎病毒YB160株和H120株分別接種雞胚后，收獲胚液獲得病毒擴(kuò)大培養(yǎng)液；然后將雞傳染性支氣管炎病毒YB160株和雞傳染性支氣管炎病毒H120株擴(kuò)大培養(yǎng)液混合后，加入疫苗凍干保護(hù)劑制成的。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的疫苗輔劑為蔗糖和明膠，其在疫苗中的終濃度分別為5%和1%。
5.權(quán)利要求1所述的疫苗用于預(yù)防雞傳染性支氣管炎病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞傳染性支氣管炎二價(jià)活疫苗，由抗原和疫苗輔劑組成，其中抗原為保藏編號(hào)為CGMCC No.6752的雞傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性支氣管炎弱毒H120株。本發(fā)明制備的二價(jià)苗可預(yù)防腺胃型和呼吸型雞傳染性支氣管炎。而且，組成本發(fā)明篩選的腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒為多次傳代獲得的弱毒株，減少了現(xiàn)有傳染性支氣管炎病毒作為抗原所帶來(lái)的副作用。
文檔編號(hào)A61K39/295GK103007274SQ20121059447
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者宋新宇, 范根成, 劉蕾, 李芳 , 鄒桂榮, 劉新文, 程增青 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司