專利名稱：靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應(yīng)用，具體說是基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因等負(fù)電性治療用生物分子共載載體 材料及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
將基因和抗腫瘤藥物組合后共同進(jìn)行靶向輸送，可模擬臨床腫瘤治療的聯(lián)合用藥模式，分別通過不同途徑協(xié)同作用，可以使二者達(dá)到微觀水平上的序貫聯(lián)合作用，提高了各自的抗腫瘤療效，同時(shí)降低藥物對人體正常器官、組織的毒副作用。例如多藥耐藥是多種癌癥化療無效或漸失效的主要原因，如果將抗腫瘤藥物和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的小干擾RNA (MDR siRNA)進(jìn)行共載輸送，可以用來逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，增加耐藥細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，提高化療藥物的抗腫瘤療效?；蛘邔⒖鼓[瘤藥物與抑制腫瘤細(xì)胞生長的端粒酶逆轉(zhuǎn)小干擾RNA (TERT siRNA)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的小干擾RNA (Bcl — 2靶向的siRNA)或者抗腫瘤的蛋白藥物等進(jìn)行共載輸送，可以使化療藥與這些基因或大分子蛋白藥物一起協(xié)同殺死腫瘤細(xì)胞，從而提高抗腫瘤療效。另一方面常用的化療藥物由于其全身分布，要達(dá)到病灶部位的藥物有效濃度，會對人體的其它部位產(chǎn)生較大的毒副作用，一些病人往往死于化療藥物對其他臟器的傷害。因而能夠達(dá)到靶向輸送對于提高藥效和降低藥物副作用更重要。導(dǎo)向治療屬于靶向給藥系統(tǒng)，是指讓治療藥物與靶向載體相結(jié)合，在載體的導(dǎo)向下把藥物運(yùn)送到靶器官或靶組織，使藥物有選擇的集中于人體的病變部位，以減少藥物在非靶向組織的無效流失，從而提高藥效，更重要的是避免對正常器官和組織的毒副作用。因而就需要尋找一種能實(shí)現(xiàn)靶向輸送的多功能高效的藥物和基因共載輸送體系。要對抗腫瘤藥物和基因進(jìn)行共載靶向輸送，就需要找到可以進(jìn)行多種功能化的適合的載體，由于新型碳納米材料氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)具有大比表面積、可同時(shí)進(jìn)行多種功能化、極好的水溶液分散性、無生物毒性、可進(jìn)入細(xì)胞并具有酸敏性等特點(diǎn)，可用來負(fù)載大量的各種分子，包括各種金屬、生物分子、熒光分子和多種藥物等，從而使其在藥物及基因的靶向輸送以及生物分子的檢測、分離和純化等方面具有許多潛在的應(yīng)用。要實(shí)現(xiàn)用氧化石墨烯攜帶抗腫瘤藥物和基因共同進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，首先需要氧化石墨烯先載著抗腫瘤藥物和基因到達(dá)腫瘤細(xì)胞。一種常見的實(shí)現(xiàn)基因或藥物靶向輸送的方法是在轉(zhuǎn)運(yùn)載體上連接能夠與腫瘤細(xì)胞表面的某些特定分子相互作用的特異性配體，例如作用于腫瘤細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體、作用于細(xì)胞表面葉酸受體的葉酸或作用于細(xì)胞表面鐵傳遞蛋白受體的鐵傳遞蛋白等都可以增強(qiáng)載體材料的腫瘤細(xì)胞靶向傳輸效果。其中葉酸是一種常用且效果較好的腫瘤細(xì)胞靶向分子，與它特異性相互作用的葉酸受體在大部分惡性腫瘤中具有高度表達(dá)，有時(shí)可比正常組織高出100 300倍。細(xì)胞膜共振提示葉酸納米粒子在腫瘤細(xì)胞中的濃度比游離葉酸高10倍，葉酸對于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤及粒細(xì)胞白血病等多種腫瘤細(xì)胞都有很好的靶向效果。而甘草次酸受體介導(dǎo)的和多糖介導(dǎo)的輸送體系能夠?qū)崿F(xiàn)肝靶向藥物和基因輸送。
為了增加氧化石墨烯的生物相容性并降低毒性，通常采用聚乙二醇、普魯蘭多糖和殼聚糖等生物相容性大分子對其進(jìn)行修飾。其中殼聚糖是自然界唯一的氨基多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有優(yōu)良的生物學(xué)性質(zhì)(良好的生物相容性和可生物降解性、無毒性及被動(dòng)的腫瘤靶向性等)和物理化學(xué)特性(高反應(yīng)活性及PH敏感性等)，是一種理想的藥物靶向和緩控釋高分子載體。因此，用殼聚糖對氧化石墨烯進(jìn)行修飾，能很好的增加其生物相容性。在殼聚糖的側(cè)鏈有多個(gè)氨基，如對其部分氨基偶聯(lián)乳糖酸、甘草次酸、葉酸，或具有腫瘤靶向性的小肽，則可以實(shí)現(xiàn)氧化石墨烯載體體系的靶向輸送。而對殼聚糖側(cè)鏈?zhǔn)Ｓ嗟牟糠职被M(jìn)一步季銨化，則能增強(qiáng)其正電性，從而能夠更高效的攜載基因。此外，文獻(xiàn)(Nano Lett. 2010, 10, 3318 - 3323.)報(bào)道，一定大小的功能化氧化石墨烯能夠在腫瘤組織中高度富集，具有明顯的腫瘤組織滯留性，即增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect, EPR)效應(yīng)。因而米用連接祀向分子的殼聚糖修飾氧化石墨烯，可以使其主動(dòng)靶向到腫瘤部位，再利用特定尺寸氧化石墨烯對腫瘤組織的EPR效應(yīng)，結(jié)合主動(dòng)靶向與被動(dòng)靶向協(xié)同作用，增強(qiáng)多功能化氧化石墨烯載體對腫瘤的靶向作用。同時(shí)，氧化石墨烯和殼聚糖本身都對某些抗腫瘤藥具有酸敏性，因而殼聚糖修飾的氧化石墨烯可以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物和基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的最大釋放。 因此本發(fā)明制備一種基于氧化石墨烯的具有靶向性的抗腫瘤藥物和基因的共載輸送體系，在載體的導(dǎo)向下把抗腫瘤藥物和基因共同輸送到靶組織，使其有選擇的集中于人體的特殊部位，從而提高其抗腫瘤療效，此項(xiàng)研究為腫瘤的聯(lián)合治療提供理論基礎(chǔ)和方法依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應(yīng)用，它是針對解決化療藥物對人體正常組織具有極大副作用及容易產(chǎn)生多藥耐藥等問題，將抗腫瘤藥物和基因分子組合后共同進(jìn)行靶向輸送，使二者達(dá)到微觀水平上的序貫聯(lián)合作用，提高了各自的抗腫瘤療效，同時(shí)降低藥物對人體正常器官、組織的毒副作用。本發(fā)明采用功能化氧化石墨烯做載體，以具有良好生物相容性的天然多糖一殼聚糖為修飾材料，制備抗腫瘤藥物和基因分子的共載體系，利用各種靶向分子的靶向性以及特定尺寸氧化石墨烯在腫瘤組織的增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)，同時(shí)結(jié)合氧化石墨烯對所載藥物的PH響應(yīng)控制釋放性能，達(dá)到在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放藥物，從協(xié)同用藥的層面出發(fā)，合成出一種具有腫瘤靶向或肝靶向的抗腫瘤藥物和基因共載智能輸送體系，為腫瘤的聯(lián)合治療提供理論基礎(chǔ)和方法依據(jù)。本發(fā)明提供的一種基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料是將葉酸、乳糖酸等腫瘤細(xì)胞靶向或肝靶向的分子與可溶性殼聚糖的部分氨基通過酰胺鍵連接，制備二者偶聯(lián)物，然后再將其與氧化石墨烯連接，最后利用一個(gè)帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物對其進(jìn)一步季銨化而制成，利用殼聚糖的季銨化部分通過靜電引力負(fù)載基因分子；再采用非共價(jià)鍵方法，通過31 — JI共軛、氫鍵、疏水效應(yīng)等作用負(fù)載抗腫瘤藥物。其中葉酸等靶向分子、殼聚糖、氧化石墨烯與帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物的質(zhì)量比1 :1-50
O.2-20 0.1-100。
制備方法是在脫水劑存在下，將葉酸、乳糖酸等腫瘤細(xì)胞靶向或肝靶向的分子與可溶性殼聚糖在水溶液中攪拌反應(yīng)，旋蒸，濃縮物過葡聚糖凝膠柱，產(chǎn)物葉酸或乳糖酸等靶向分子和殼聚糖偶聯(lián)物濃縮凍干后在脫水劑的存在下與氧化石墨烯超聲攪拌反應(yīng)，分離，洗滌產(chǎn)物，再與帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物在80°c下超聲攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后固體產(chǎn)品經(jīng)反復(fù)離心洗滌，得到帶正電荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培養(yǎng)基RPMI 1640中與抗腫瘤藥物和基因分子混合，孵育即可。所述的靶向分子是指具有腫瘤靶向或肝靶向的各種分子，優(yōu)選的有葉酸、乳糖酸、半乳糖苷、甘草次酸、腫瘤細(xì)胞靶向的各種抗體和小肽等。所述的含有季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物指2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(2, 3-Epoxypropylttrimethylam monium Chloride)等帶有環(huán)氧基和季銨基的所有化合物。所述的抗腫瘤藥物的負(fù)載量為O. 05 2. O mg/mg ο·
所述的藥物是指具有水溶性的各種藥物，優(yōu)選的有具有共軛體系的藥物，如(鹽酸)阿霉素及其衍生物類藥物、(鹽酸)道諾霉素、(鹽酸)米托蒽醌、甲氨喋呤、(硫酸)長春堿及其衍生物類藥物、(鹽酸)羥基喜樹堿、(鹽酸)阿糖胞苷、5 —氟尿嘧啶等中的一種或兩種
坐寸ο所述的基因分子的負(fù)載量為O. 01 50 Mmol/g。所述的基因分子是指具有RNA干擾作用的各種小干擾RNA、各種抑制腫瘤生長的抑癌基因以及抗腫瘤的蛋白藥物等。優(yōu)選的有抑制腫瘤生長的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA、抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的多藥耐藥siRNA、抑制腫瘤細(xì)胞生長或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的siRNA和具有免疫調(diào)節(jié)作用的各種siRNA等中的一種或兩種等，抑癌基因Pdcd4(programmed celldeath 4)、RECK、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如Rb、p53，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，如WT，周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI )，如pl5、pl6、p21，信號通路的抑制因子，如ras GTP酶活化蛋白(NF-1 )，磷脂酶(PTEN)，DNA修復(fù)因子，如BRCA1、BRCA2，與發(fā)育和干細(xì)胞增殖相關(guān)的信號途徑組分，如APC> Axin 等。所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六邊形晶格排列的單層石墨原子組成，且經(jīng)過功能化而得到的含有含氧基團(tuán)(羧基、羥基、環(huán)氧基和羰基)的二維平面材料，其厚度分布在
O.3nm到2nm之間，大小分布在IOnm2到400Mm2之間。該功能化氧化石墨烯材料可采用機(jī)械剝離法、晶體外延生長法及化學(xué)氧化等方法制備。該氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。本發(fā)明提供的一種基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料的制備方法包括如下的步驟
O靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯(lián)物的制備在脫水劑的存在下，將葉酸等靶向分子和可溶性殼聚糖混溶于水溶液中，室溫?cái)嚢枰惶?，體系旋蒸脫溶，濃縮物過葡聚糖凝膠柱以除去小分子雜質(zhì)，將產(chǎn)物濃縮凍干，獲得二者偶聯(lián)產(chǎn)物。2)將步驟I)制備的偶聯(lián)產(chǎn)物修飾在氧化石墨烯上，在脫水劑的存在下，將靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯(lián)物與氧化石墨烯混合超聲溶于水中(水浴超聲60W，I小時(shí))，室溫?cái)嚢杷奶欤a(chǎn)物通過反復(fù)離心、超聲分散(水浴超聲60W，2分鐘)循環(huán)，進(jìn)行洗滌，除去未反應(yīng)的偶聯(lián)物。
3)將步驟2)制備的功能化氧化石墨烯與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨混溶于水溶液中，加氫氧化鈉調(diào)pH值至7-8，80°C攪拌反應(yīng)24小時(shí)，產(chǎn)物通過反復(fù)離心、超聲分散(水浴超聲60W，2分鐘)循環(huán)，進(jìn)行洗滌，除去未反應(yīng)的2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨。其中，氧化石墨烯的制備過程可參考(ACSNano, 2008, 2，463-470)。所述的靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯(lián)物和脫水劑的質(zhì)量比為I :1-1000 :0. 1-10。所述的氧化石墨烯和步驟I)制備的偶聯(lián)產(chǎn)物和脫水劑的質(zhì)量比為I :5-50 0.5-5。所述的可溶性殼聚糖分子量在1000-10000。所述的脫水劑為l-ethyl-3(3-dimethy amino-propyl) carbodiimide(EDC)及其鹽酸鹽，1，3-dicyclohexylcarbodi-imide (DCC)及其鹽酸鹽，
1,3-diisopropylcarbodi-imide (DIC)及其鹽酸鹽，1，3-dihexylcarbodi_imide (DHC)及其鹽酸鹽，N-hydroxy succinimide (NHS)及其鈉鹽，N-hydroxysulfosuccinimide(sulfo-NHS)及其鈉鹽，l-hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)中的一種或多種。本發(fā)明基于功能化氧化石墨烯的靶向性的抗腫瘤藥物和基因共載載體材料作為一種低毒高效的藥物載體材料，用于制備腫瘤治療的藥物。本發(fā)明基于功能化氧化石墨烯的靶向性的抗腫瘤藥物和基因共載載體材料的顯著優(yōu)點(diǎn)是
I、該載體材料充分利用新型碳納米材料氧化石墨烯具有大比表面積、可多重修飾、高穩(wěn)定性、無免疫原性的特點(diǎn)，制備基于多功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載智能載體材料。該功能化高效氧化石墨烯納米基因載體采用天然多糖可溶性殼聚糖修飾，具有很好的生物相容性和水溶性，高效負(fù)載抗腫瘤藥物和基因分子，實(shí)現(xiàn)高度靶向、可控釋放及聯(lián)合用藥的高效藥物輸送途徑。2、利用抗腫瘤藥物和基因共載智能輸送，利用其協(xié)同作用達(dá)到腫瘤聯(lián)合治療的效
果O3、基于氧化石墨烯對藥物的pH敏感控制釋放性能，實(shí)現(xiàn)藥物胞內(nèi)釋藥，避免化療藥在輸送過程中大量釋放，降低其對正常組織的毒副作用?？傊景l(fā)明針對針對解決化療藥物對人體正常組織具有極大副作用及容易產(chǎn)生多藥耐藥等問題，將抗腫瘤藥物和基因分子組合后共同進(jìn)行靶向輸送，使二者達(dá)到微觀水平上的序貫聯(lián)合作用，提高了各自的抗腫瘤療效，同時(shí)降低藥物對人體正常器官、組織的毒副作用，同時(shí)也為基因的體內(nèi)靶向輸送提供了新方法。


圖I、實(shí)施例I中合成的具有肝靶向性的功能化氧化石墨烯的原子力顯微鏡照片。圖2、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯的熱重分析。圖3、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯的紅外光譜圖。圖4、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素后在不同pH值下的藥物釋放性能。圖5、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載熒光標(biāo)記的DNA后被人肝癌細(xì)胞QGY-7703吸收的共聚焦熒光顯微鏡照片。圖6、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素前后對人肝癌細(xì)胞QGY-7703的毒性作用。圖7、實(shí)施例2中制備的功能化氧化石墨烯載多藥耐藥MDRl siRNA后對耐藥人乳腺癌細(xì)胞的靶基因表達(dá)的影響。圖8、實(shí)施例2中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素及多藥耐藥MDRlsiRNA后對耐藥人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR的毒性作用。
具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，它們只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。除特別標(biāo)明外，所用試劑和測試設(shè)備均為市售。實(shí)施例I :
第一步合成氧化石墨烯材料，制備過程可參考(ACSNano，2008，2，463-470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地，利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。第二步乳糖酰化殼聚糖的制備
乳糖酸 O. 2671 g, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide (EDC)O. 1715g, N-hydroxy succinimide (NHS) 0. 1030 g溶解在5 mL蒸懼水中，超聲溶解后，電磁攪拌I小時(shí)活化。稱取I g純化的殼聚糖，溶在3 mL蒸餾水中，超聲溶解后，與活化的乳糖酸混合在一起，加入三乙胺調(diào)PH值至8-9，電磁攪拌反應(yīng)48小時(shí)。體系旋蒸脫溶，濃縮物過葡聚糖凝膠柱，收集流出的黃色溶液，將產(chǎn)物濃縮凍干，獲得二者偶聯(lián)產(chǎn)物。第三步氧化石墨烯與上述第二步產(chǎn)物連接
稱取3 mg氧化石墨烯，分散在10 mL蒸餾水中，加氫氧化鈉調(diào)pH值至6-7 JpAEDC
95.85mg, NHS 57.5 mg，超聲溶解后，溫水浴攪拌40分鐘活化。在氧化石墨烯溶液中加入80 mg上述第二步產(chǎn)物乳糖?；瘹ぞ厶恰３暼芙夂?，用三乙胺調(diào)pH值至8-9，35 °C油浴反應(yīng)120小時(shí)。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌，反復(fù)數(shù)次(3-5次)。偶聯(lián)產(chǎn)物修飾氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)通過熱重分析和紅外光譜證明，見附圖2和3。第四步第三步產(chǎn)物進(jìn)行季銨化反應(yīng)
將第三步產(chǎn)物超聲分散在50 mL蒸餾水中，加入400 mg 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，加氫氧化鈉調(diào)PH值至7-8，80°C油浴回流，電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌，反復(fù)數(shù)次。產(chǎn)物通過激光粒度儀表征Zeta電位。第五步抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負(fù)載和在不同pH條件下的釋放性能
將6 mL濃度為0. 33 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度0. 45 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲30分鐘，室溫避光攪拌12小時(shí)。然后樣品在14000轉(zhuǎn)/分鐘下離心，用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計(jì)算藥物在多功能單層氧化石墨上的負(fù)載量為0. 477mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH = 5和7. 4的溶液中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。檢測結(jié)果見附圖4。
第六步用熒光素FAM標(biāo)記的DNA負(fù)載在上述功能化氧化石墨烯上，進(jìn)行體外靶向性檢測
將 4 μ L 的 20 μ mol/L 熒光素 FAM 標(biāo)記的 DNA (5，-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’ -FAM，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)與25 μ L的I mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育2小時(shí)。用該負(fù)載熒光素標(biāo)記的DNA的功能化氧化石墨烯與人肝癌細(xì)胞QGY-7703共同孵育30分鐘后進(jìn)行熒光顯微鏡檢測。作為對照，未連接乳糖酸的功能化氧化石墨烯進(jìn)行同樣操作。體外靶向檢測結(jié)果見附圖5。第七步不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對腫瘤細(xì)胞的毒性作用。采用WST-I試劑進(jìn)行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對人肝癌細(xì)胞QGY-7703的毒性作用表征。取對數(shù)生長期細(xì)胞以4X IO3個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將不同濃度的負(fù)載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與Hela細(xì)胞孵育48小時(shí)后， 加入10 μ L WST-I試劑進(jìn)行孵育2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀(Promega，GloMaxe-Multi )進(jìn)行吸光檢測。毒性檢測結(jié)果見附圖6。測試結(jié)果如圖I 6所示。其中，圖I、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯的原子力顯微鏡照片。(A :為功能化的氧化石墨烯；B :功能化后的氧化石墨烯)
圖2、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯的熱重分析圖。(A :氧化石墨烯；B :乳糖?；瘹ぞ厶?；C :乳糖酰化殼聚糖修飾的氧化石墨烯)。圖3、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯的紅外光譜圖。(a :氧化石墨烯；b 功能化的氧化石墨烯；c :殼聚糖；d :乳糖?；瘹ぞ厶?。圖4、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素后分別在pH為5. O和7. 4下的藥物釋放性能。圖5、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載熒光標(biāo)記的DNA后被人肝癌細(xì)胞QGY-7703吸收的共聚焦熒光顯微鏡照片(A :有乳糖酸酸連接的功能化氧化石墨烯負(fù)載熒光標(biāo)記的DNA后；B :無乳糖酸連接的功能化氧化石墨烯負(fù)載熒光標(biāo)記的DNA后；C :游離熒光標(biāo)記的DNA)。左側(cè)為熒光顯微鏡照片，右側(cè)為光鏡下照片。圖6、實(shí)施例I中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素前后對人肝癌細(xì)胞QGY-7703的毒性作用。(A :不同功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素前對人肝癌細(xì)胞QGY-7703的毒性作用；B :不同功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素后和游離鹽酸阿霉素對人肝癌細(xì)胞QGY-7703的毒性作用。)
實(shí)施例2
第一步合成氧化石墨烯材料，制備過程可參考(ACSNano，2008，2，463-470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地，利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。第二步葉酸與殼聚糖偶聯(lián)物的制備
葉酸 109. 4 mg, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide(EDC)95. 85 mg,N-hydroxy succinimide (NHS)57. 5 mg溶解在10 mL DMSO中，超聲溶解后，電磁攬拌I小時(shí)活化。稱取500 mg純化的殼聚糖，超聲溶解后，加入三乙胺200 uL, 30^40 °C電磁攪拌反應(yīng)72小時(shí)。體系旋蒸脫溶，加入80 mL丙酮沉淀，沉淀物用丙酮洗兩次。沉淀溶于水中，離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分鐘)，將上清液凍干，獲得二者偶聯(lián)產(chǎn)物。第三步氧化石墨烯與上述第二步產(chǎn)物連接稱取5 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸懼水中，加入EDC 95.85 mg, NHS 57.5 mg,超聲溶解后，溫水浴攪拌I小時(shí)活化。在氧化石墨烯溶液中加入120 mg上述第二步產(chǎn)物葉酸與殼聚糖偶聯(lián)物。超聲溶解后，用三乙胺調(diào)PH值至8-9，35 1油浴反應(yīng)4天。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌，反復(fù)數(shù)次。偶聯(lián)產(chǎn)物修飾氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)通過熱重分析和紅外光譜證明。第四步第三步產(chǎn)物進(jìn)行季銨化反應(yīng)
將第三步產(chǎn)物超聲分散在20 mL蒸餾水中，加入I g 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，80°C油浴反應(yīng)，電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌,反復(fù)數(shù)次。產(chǎn)物通過激光粒度儀表征Zeta電位為+34. 98 eV。 第五步抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負(fù)載和在不同pH條件下的釋放性能
將12 mL濃度為O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度O. 84 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲I小時(shí)，室溫避光攬祥12小時(shí)。然后樣品在14000轉(zhuǎn)/分鐘下尚心，用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計(jì)算藥物在多功能單層氧化石墨上的負(fù)載量為O. 79 mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH = 5和7. 4的溶液中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。第六步用熒光素FAM標(biāo)記的DNA負(fù)載在上述功能化氧化石墨烯上，進(jìn)行體外靶向性檢測
將 10 μ L 的 20 μ mo I/L 熒光素 FAM 標(biāo)記的 DNA (5，-TGC-ATT-TTT-AAT-GGT-ATT-TA-3’ -FAM，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)與25 μ L的O. 5 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育I小時(shí)。用該負(fù)載熒光素標(biāo)記的DNA的功能化氧化石墨烯與人耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR共同孵育30分鐘后進(jìn)行熒光顯微鏡檢測。作為對照，未連接葉酸的功能化氧化石墨烯進(jìn)行同樣操作。第七步功能化氧化石墨烯負(fù)載多藥耐藥小干擾RNA (MDR1 siRNA)后對人耐藥乳腺癌細(xì)胞的靶基因表達(dá)的影響。將濃度為O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯200 μ L與50 nmol MDRl siRNA( SantaCruz生物技術(shù)有限公司)在RPMI 1640基本培養(yǎng)基中室溫混合2 h，與人耐藥乳腺癌細(xì)胞共同孵育轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換RPMI 1640完全培養(yǎng)基。24小時(shí)后消化離心，收集并提取細(xì)胞總RNA，通過RT-PCT實(shí)驗(yàn)檢測多藥耐藥MDRl mRNA的表達(dá)。48小時(shí)后消化離心，收集并提取細(xì)胞總蛋白，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測P — gp糖蛋白的表達(dá)。作為對照,未連接葉酸的功能化氧化石墨烯和轉(zhuǎn)染劑Liposome進(jìn)行同樣操作。(功能化氧化石墨烯負(fù)載多藥耐藥MDRlsiRNA后對人耐藥乳腺癌細(xì)胞的靶基因表達(dá)的影響檢測結(jié)果見附圖7)
第八步不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥及對抗腫瘤藥物和MDRl siRNA共載后對腫瘤細(xì)胞的毒性作用。采用WST-I試劑進(jìn)行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥及對抗腫瘤藥物和MDRlsiRNA共載后對人耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR的毒性作用表征。取對數(shù)生長期細(xì)胞以4X IO3個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將不同濃度的負(fù)載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與MCF-7/MDR細(xì)胞孵育48小時(shí)后，加入10 μ L WST-I試劑進(jìn)行孵育2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀(Promega, GloMaxe-Multi)進(jìn)行吸光檢測。(毒性檢測結(jié)果見附圖8)其中，圖7、實(shí)施例2中制備的功能化氧化石墨烯載多藥耐藥MDRl siRNA后對耐藥人乳腺癌細(xì)胞的靶基因表達(dá)的影響。(a :有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，終濃度為O. 006 mg/ml ；b :有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,終濃度為O. 018 mg/ml ；c :有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，終濃度為O. 036 mg/ml ；d :有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，終濃度為O. 06 mg/ml ；e liposome轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；f :功能化氧化石墨烯負(fù)載對照siRNA處理的細(xì)胞；g :游離MDRl siRNA ；h :未處理的對照細(xì)胞。siRNA的終濃度均為100 nM。)上轉(zhuǎn)染24小時(shí)后耐藥人乳腺癌細(xì)胞的MDRl mRNA的表達(dá)。下轉(zhuǎn)染48小時(shí)后耐藥人乳腺癌細(xì)胞P — gp糖蛋白的表達(dá)。圖8、實(shí)施例2中合成的功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素及多藥耐藥MDRlsiRNA后不同濃度下對耐藥人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR的毒性作用。(Dox :游離的鹽酸阿霉素；G0-FAC0+-DOX :有葉酸連接的功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素后對耐藥人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR的毒性作用；GO-FACO+-Dox-SiRNA :有葉酸連接的功能化氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素和MDRl siRNA后對耐藥人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR的毒性作用。) 結(jié)果表明，功能化的氧化石墨烯負(fù)載MDRl siRNA后降低了耐藥人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR相應(yīng)的MDRl mRNA和P — gp糖蛋白的表達(dá)水平。功能化的氧化石墨烯負(fù)載鹽酸阿霉素及其共載鹽酸阿霉素和多藥耐藥MDRl siRNA后都比單純使用鹽酸阿霉素對耐藥人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/MDR具有更高的毒性作用，說明鹽酸阿霉素的pH敏感釋放也對逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥具有一定作用。而在較低濃度下，共載鹽酸阿霉素和多藥耐藥MDRl siRNA的功能化氧化石墨烯比單純負(fù)載鹽酸阿霉素的功能化氧化石墨烯具有更好的殺死腫瘤細(xì)胞的作用，其IC5tl值比單純載藥的要低；在較高濃度下，二者均能殺死90%以上的腫瘤細(xì)胞，因而共載抗腫瘤藥物和MDRl siRNA在一定程度上起到了逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用，能夠更好的殺死耐藥腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例3
第一步合成氧化石墨烯材料，制備過程可參考(ACSNano，2008，2，463-470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地，利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。第二步葉酸與殼聚糖偶聯(lián)物的制備
葉酸 109. 4 mg, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide(EDC)95. 85 mg,N-hydroxy succinimide (NHS)57. 5 mg溶解在10 mL DMSO中，超聲溶解后，電磁攬拌I小時(shí)活化。稱取400 mg純化的殼聚糖，超聲溶解后，加入三乙胺200 uL, 30^40 °C電磁攪拌反應(yīng)72小時(shí)。體系旋蒸脫溶，加入80 mL丙酮沉淀，沉淀物用丙酮洗兩次。沉淀溶于水中，離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分鐘)，將上清液凍干，獲得二者偶聯(lián)產(chǎn)物。第三步氧化石墨烯與上述第二步產(chǎn)物連接
稱取6 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸懼水中，加入EDC 95.85 mg, NHS 57.5 mg,超聲溶解后，溫水浴攪拌I小時(shí)活化。在氧化石墨烯溶液中加入240 mg上述第二步產(chǎn)物葉酸與殼聚糖偶聯(lián)物。超聲溶解后，用三乙胺調(diào)PH值至8-9，35 1油浴反應(yīng)4天。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌，反復(fù)數(shù)次。偶聯(lián)產(chǎn)物修飾氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)通過熱重分析和紅外光譜證明。第四步第三步產(chǎn)物進(jìn)行季銨化反應(yīng)
將第三步產(chǎn)物超聲分散在20 mL蒸餾水中，加入I g 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，80°C油浴反應(yīng)，電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌,反復(fù)數(shù)次。產(chǎn)物通過激光粒度儀表征Zeta電位為+31. 25 eV。第五步抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負(fù)載和在不同pH條件下的釋放性能
將12 mL濃度為O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度O. 84 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲I小時(shí)，室溫避光攬祥12小時(shí)。然后樣品在14000轉(zhuǎn)/分鐘下尚心，用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計(jì)算藥物在多功能單層氧化石墨上的負(fù)載量為O. 79 mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH = 5和7. 4的溶液中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。第六步用熒光素Cy3標(biāo)記的RNA寡核苷酸(廣州市銳博生物科技有限公司)負(fù)載在上述功能化氧化石墨烯上，進(jìn)行體外靶向性檢測·
將3 μ L的20 μ mol/LCy3標(biāo)記的DNA與500 μ L的O. 06 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育I小時(shí)，用該負(fù)載Cy3標(biāo)記的DNA功能化氧化石墨烯與人宮頸癌細(xì)胞共同孵育O. 5小時(shí)后進(jìn)行共聚焦熒光顯微鏡檢測，作為對照未連接葉酸的功能化氧化石墨烯進(jìn)行同樣操作。同時(shí)用連接葉酸的功能化氧化石墨烯分別對葉酸受體表達(dá)較高的Hela細(xì)胞和葉酸受體表達(dá)較低的A549細(xì)胞進(jìn)行對照。第七步功能化氧化石墨烯負(fù)載Bcl-2祀向的siRNA (Bcl-2 targeted siRNA)后對人宮頸癌細(xì)胞的靶基因表達(dá)的影響。將濃度為O. 5 mg/ml的功能化氧化石墨烯200 μ L與50 nmol Bcl_2 targetedsiRNA (Santa Cruz生物技術(shù)有限公司)在RPMI 1640培養(yǎng)基中室溫混合2 h，與人宮頸癌細(xì)胞共同孵育轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換RPMI 1640完全培養(yǎng)基。48小時(shí)后消化離心，收集并提取細(xì)胞總蛋白，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測Bcl_2蛋白的表達(dá)。作為對照,未連接葉酸的功能化氧化石墨烯和轉(zhuǎn)染劑Liposome進(jìn)行同樣操作。第八步不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對腫瘤細(xì)胞的毒性作用。采用WST-I試劑進(jìn)行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對人宮頸癌細(xì)胞Hela的毒性作用表征。取對數(shù)生長期細(xì)胞以4X IO3個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將不同濃度的負(fù)載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與Hela細(xì)胞孵育48小時(shí)后，力口入10 μ L WST-I試劑進(jìn)行孵育2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀(Promega，GloMaxe-Multi )進(jìn)行吸光檢測。實(shí)施例4
第一步合成氧化石墨烯材料，制備過程可參考(ACSNano，2008，2，463-470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地，利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。第二步甘草次酸與殼聚糖偶聯(lián)物的制備
甘草次酸 0. 14g, l-ethyl-3 (3-dimethy amino-propyl) carbodiimide (DCC)O. 12 g,I g純化的殼聚糖，溶解在10 mL乙醇中超聲溶解后，電磁攪拌反應(yīng)48小時(shí)。體系旋蒸脫溶，濃縮物過葡聚糖凝膠柱，產(chǎn)物濃縮凍干，獲得二者偶聯(lián)產(chǎn)物。第三步氧化石墨烯與上述第二步產(chǎn)物連接
稱取5 mg氧化石墨烯，分散在10 mL蒸餾水中，加氫氧化鈉調(diào)pH值至6-7 JpAEDC
95.85mg, NHS 57.5 mg，超聲溶解后，溫水浴攪拌40分鐘活化。在氧化石墨烯溶液中加入60 mg上述第二步產(chǎn)物。超聲溶解后，用三乙胺調(diào)pH值至8-9，35 1油浴反應(yīng)120小時(shí)。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌，反復(fù)數(shù)次。偶聯(lián)產(chǎn)物修飾氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)通過熱重分析和紅外光譜證明。第四步第三步產(chǎn)物進(jìn)行季銨化反應(yīng)
將第三步產(chǎn)物超聲分散在50 mL蒸餾水中，加入400 mg 2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨，加氫氧化鈉調(diào)PH值至7-8，80°C油浴回流，電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)。待反應(yīng)完全后，對反應(yīng)體系進(jìn)行離心，得到的沉淀物用蒸餾水進(jìn)行洗滌，反復(fù)數(shù)次。產(chǎn)物通過激光粒度儀表征Zeta電位。第五步抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負(fù)載和在不同pH條件下的釋放性能 將6 mL濃度為O. 33 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度O. 45 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲30分鐘，室溫避光攪拌12小時(shí)。然后樣品在14000轉(zhuǎn)/分鐘下離心，用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計(jì)算藥物在多功能單層氧化石墨上的負(fù)載量為O. 477mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH = 5和7. 4的溶液中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。第六步用綠色熒光蛋白基因(EGFP)負(fù)載在上述功能化氧化石墨烯上，進(jìn)行體外靶向性檢測
將I μ L的O. 5 μ g/mL EGFP基因與5 μ L的O. I mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育2小時(shí)。用該負(fù)載EGFP的功能化氧化石墨烯與人肝癌細(xì)胞HepG2和人宮頸癌Hela細(xì)胞分別孵育48小時(shí)后進(jìn)行熒光顯微鏡檢測，觀察轉(zhuǎn)染效率。第七步不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對腫瘤細(xì)胞的毒性作用。采用WST-I試劑進(jìn)行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對人肝癌細(xì)胞IfepG2的毒性作用表征。取對數(shù)生長期細(xì)胞以4X IO3個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將不同濃度的負(fù)載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與HepG2細(xì)胞孵育48小時(shí)后，加入10μ L WST-I試劑進(jìn)行孵育2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀(Promega，GloMax -Multi)進(jìn)行吸光檢測。毒性檢測結(jié)果見附圖6。
權(quán)利要求
1.一種基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料，其特征在于它是將靶向分子與可溶性殼聚糖的部分氨基通過酰胺鍵連接，制備二者偶聯(lián)物，然后再將其與氧化石墨烯連接，最后利用一個(gè)帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物對其進(jìn)一步季銨化而制成，利用殼聚糖的季銨化部分通過靜電引力負(fù)載基因分子；再采用非共價(jià)鍵方法，通過n共軛、氫鍵、疏水效應(yīng)作用負(fù)載抗腫瘤藥物，其中，靶向分子、殼聚糖、氧化石墨烯與帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物的質(zhì)量比1 =1-50 0. 2-20 0. 1-100 ;制備方法是在脫水劑存在下，將靶向分子與可溶性殼聚糖在水溶液中攪拌反應(yīng)，旋蒸，濃縮物過葡聚糖凝膠柱，產(chǎn)物靶向分子和殼聚糖偶聯(lián)物濃縮凍干后在脫水劑的存在下與氧化石墨烯超聲攪拌反應(yīng)，分離，洗滌產(chǎn)物，再與帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物在80°C下超聲攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后固體產(chǎn)品經(jīng)反復(fù)離心洗滌，得到帶正電荷的功能化氧化石墨烯，分散在水或培養(yǎng)基RPMI 1640中與抗腫瘤藥物和基因分子混合，孵育即可；所述的抗腫瘤藥物的負(fù)載量為0. 05^2. 0 mg/mg ;所述的基因分子的負(fù)載量為0. 01 50 Mfliol/g ;所述的靶向分子是指具有腫瘤靶向或肝靶向的各種分子葉酸、乳糖酸、半乳糖苷、甘草次酸或腫瘤細(xì)胞靶向的各種抗體和小肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體材料，其特征在于所述的含有季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物指2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(2，3-Epoxypropylttrimethylam monium Chloride)等帶有環(huán)氧基或季銨基的所有化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體材料，其特征在于所述的藥物是指具有水溶性的各種藥物(鹽酸)阿霉素及其衍生物類藥物、(鹽酸)道諾霉素、(鹽酸)米托蒽醌、甲氨喋呤、(硫酸)長春堿及其衍生物類藥物、(鹽酸)羥基喜樹堿、(鹽酸)阿糖胞苷、5 —氟尿嘧啶等中的一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體材料，其特征在于所述的基因分子是指抑制腫瘤生長的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶siRNA、抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的多藥耐藥siRNA、抑制腫瘤細(xì)胞生長或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的siRNA和具有免疫調(diào)節(jié)作用的各種siRNA等中的一種或兩種，或抑癌基因Pdcd4 (programmed cell death 4)、RECK、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rb、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53、負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子WT ;或周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI) :pl5、pl6、p21、信號通路的抑制因子ras GTP酶活化蛋白(NF-I)、磷脂酶(PTEN)、DNA修復(fù)因子BRCAl、DNA修復(fù)因子BRCA2 ；或與發(fā)育和干細(xì)胞增殖相關(guān)的信號途徑組分APC、Axin。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體材料，其特征在于所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六邊形晶格排列的單層石墨原子組成，且經(jīng)過功能化而得到的含有含氧基團(tuán)的二維平面材料，其厚度分布在0. 3nm到2nm之間，大小分布在IOnm2到400Mm2之間；該功能化氧化石墨烯材料可采用機(jī)械剝離法、晶體外延生長法及化學(xué)氧化等方法制備；該氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。
6.一種權(quán)利要求I所述的基于氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料的制備方法，其特征在于包括如下的步驟 1)靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯(lián)物的制備在脫水劑的存在下，將靶向分子和可溶性殼聚糖混溶于水溶液中，室溫?cái)嚢枰惶欤w系旋蒸脫溶，濃縮物過葡聚糖凝膠柱以除去小分子雜質(zhì)，將產(chǎn)物濃縮凍干，獲得二者偶聯(lián)產(chǎn)物； 2)將步驟I)制備的偶聯(lián)產(chǎn)物修飾在氧化石墨烯上，在脫水劑的存在下，將靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯(lián)物與氧化石墨烯混合超聲溶于水中，水浴超聲60W，1小時(shí)，室溫?cái)嚢杷奶?，產(chǎn)物通過反復(fù)離心、超聲分散，水浴超聲60W，2分鐘，循環(huán)，進(jìn)行洗滌，除去未反應(yīng)的偶聯(lián)物； 3)將步驟2)制備的功能化氧化石墨烯與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨混溶于水溶液中，加氫氧化鈉調(diào)PH值至7-8，80°C攪拌反應(yīng)24小時(shí)，產(chǎn)物通過反復(fù)離心、超聲分散，水浴超聲60W，2分鐘，循環(huán)，進(jìn)行洗滌，除去未反應(yīng)的2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨； 所述的靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯(lián)物和脫水劑的質(zhì)量比為I :1-1000 :0. 1-10。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的氧化石墨烯和步驟I)制備的偶聯(lián)產(chǎn)物和脫水劑的質(zhì)量比為I :5-50 :0. 5-5。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的可溶性殼聚糖分子量在1000-10000。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于所述的脫水劑為l-ethyl-3(3_dimethyamino-propyl) carbodiimide (EDC)及其鹽酸鹽，I, 3-dieyeIohexyIcarbodi-imide(DCC)及其鹽酸鹽，1，3-diisopropylcarbodi-imide (DIC)及其鹽酸鹽，I, 3-dihexylcarbodi-imide (DHC)及其鹽酸鹽,N-hydroxy succinimide (NHS)及其鈉鹽，N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)及其鈉鹽，1-hydroxybenzotriazole hydrate(HOBt)中的一種或多種。
10.權(quán)利要求I所述的載體材料用于制備治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應(yīng)用。將葉酸、乳糖酸等腫瘤細(xì)胞靶向或肝靶向的分子與可溶性殼聚糖的部分氨基通過酰胺鍵連接制備偶聯(lián)物，再與氧化石墨烯連接，用帶季銨基團(tuán)的環(huán)氧化合物對其季銨化。用殼聚糖的季銨化部分通過靜電引力負(fù)載基因分子；再用非共價(jià)鍵方法通過π－π共軛、氫鍵、疏水效應(yīng)作用負(fù)載抗腫瘤藥物。利用靶向分子的靶向性以及特定尺寸氧化石墨烯在腫瘤組織的增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)，同時(shí)結(jié)合氧化石墨烯對所載藥物的pH響應(yīng)控制釋放性能，達(dá)到在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放藥物，從協(xié)同用藥出發(fā)合成具有腫瘤靶向或肝靶向的抗腫瘤藥物和基因共載智能輸送體系，為腫瘤的聯(lián)合治療提供理論基礎(chǔ)和方法依據(jù)。
文檔編號A61K48/00GK102949727SQ20121053183
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者楊曉英, 曹秀芬, 王銀松, 段宏泉, 陳永勝 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)