一種i型膠原材料、腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可縫合高濃度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原材料、一種由所述I型膠原材料制備的腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法，所述腦膜或脊膜生物膜片可用于制備硬腦膜或脊膜組織修復(fù)材料。
【專利說明】一種I型膠原材料、腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、生物材料學(xué)、組織工程學(xué)以及再生醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種I型膠原材料、腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法和應(yīng)用，即:一種高純度保持膠原纖維特有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料制作高濃度、高密度、高強度的腦膜或脊膜制備方法及應(yīng)用。
[0002]更具體地說，本發(fā)明涉及一種高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原材料、一種由所述I型膠原材料制備的腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法，以及所述腦膜或脊膜生物膜片在制備硬腦膜或脊膜組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]二十世紀(jì)末隨著醫(yī)學(xué)的高速發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)、遺傳基因?qū)W，組織工程學(xué)以及再生醫(yī)學(xué)也隨之不斷進步與發(fā)展。具有優(yōu)良性能的生物材料也同時在被迅速發(fā)現(xiàn)與利用。近年來，組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)在醫(yī)學(xué)臨床中的快速掘起就證明了這一點。使用自然生物材料的I型膠原做為支架或載體的組織工程和再生醫(yī)學(xué)的產(chǎn)品獲得了顯著的發(fā)展與應(yīng)用。
[0004]在此領(lǐng)域內(nèi)的一個重要課題是:如何應(yīng)用上述材料制備成具有不同理化、生物學(xué)特性并能充當(dāng)細(xì)胞外間質(zhì)物 質(zhì)的支架，使機體受損傷的組織細(xì)胞能有很好的修復(fù)再生的環(huán)境，且為損傷組織細(xì)胞提供盡可能接近正常的內(nèi)外環(huán)境從而促使受損組織器官得以修復(fù)再生。這不僅需要考慮自然生物材料本身特性，而且還要考慮在技術(shù)使用與操作方面更具良好性能。這需要應(yīng)用不同醫(yī)療領(lǐng)域的組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的組織器官修復(fù)再生技術(shù)。
[0005]硬腦膜/硬脊膜在外傷以及腫瘤侵及時，可造成不同程度的腦膜或脊膜的損傷與缺損，繼而形成腦脊液滲漏，繼發(fā)感染，甚至因腦膜不正常愈合形成的瘢痕而引發(fā)癲癇。嚴(yán)重的損害缺損，將造成顱腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官實質(zhì)性不可逆的損傷與變性。目前通常的治療方法是在損傷缺損的情況下，選用自體其他部位的顱腦筋膜，體肌筋膜，或其他抗原性較高的生物材料產(chǎn)品進行嚴(yán)密的縫合。由于自身組織難以獲取，或因選取材料的不充分往往治療達不到預(yù)期的效果，而其他代用品又往往有較高的免疫反應(yīng)，而且會形成瘢痕組織，影響治療效果。
[0006]中國專利申請CN101569765A“保持膠原特有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料及其產(chǎn)品和應(yīng)用”公開了一種保持膠原特有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料及其提取方法，采用該I型醫(yī)用膠原材料制備的腦膜/脊膜生物膜片，以及該生物膜片的制備工藝及其在制備腦膜/脊膜組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。該專利申請涉及的I型膠原人工硬腦/脊膜發(fā)明特點著重在于對損傷缺損的腦膜或脊膜的缺損部位使用具有一定強度、具有高開放性三維孔隙結(jié)構(gòu)的類海綿狀腦膜或脊膜生物膜片進行覆蓋包裹、目的在于免縫合。這樣不僅機械性的保護腦實質(zhì)部位的組織不受外周其他組織的侵入干擾，同時還建立了受損腦膜或脊膜部位的纖維組織的再生內(nèi)環(huán)境，防止腦脊液和其內(nèi)的生長因子過度丟失，保持受損組織的內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，為修復(fù)腦膜或脊膜和其再生提供最佳環(huán)境。同時可以大大地減少術(shù)后縫合缺損硬膜的時間，縮短手術(shù)整體時間，減少患者費用。
[0007]但是這種具有多孔隙的海綿狀膜在臨床使用過程中由于其力學(xué)性能較弱、縫合的性能欠佳，導(dǎo)致在神經(jīng)外科手術(shù)中受到了一定的限制。在神經(jīng)外科的手術(shù)中有相當(dāng)部分的手術(shù)病例如顱底部位的病變在術(shù)中需要修補時必須需要緊密縫合缺損，為此發(fā)明一種提高材料力學(xué)性能的可縫合的人工腦膜成為了發(fā)展的必然趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種可縫合的1型膠原材料、腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法和應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的1型膠原材料、一種由所述I型膠原材料制備的腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法，以及所述腦膜或脊膜生物膜片在制備硬腦膜或脊膜組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0010]一種1型膠原材料、腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法使用一種保持膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的1型醫(yī)用膠原材料在戊二醇特殊冷凍條件下使其膠原溶液保持在-4~+4度的溫度狀態(tài)，并以每分3，000~18，000轉(zhuǎn)速進行攪拌，使之膠原漿液的溫度保持在上述攝氏溫度的狀態(tài)，其1性膠原原料的三螺旋結(jié)構(gòu)必不遭到破壞。為此生產(chǎn)的腦膜或脊膜生物膜片中的膠原纖維操持其三螺旋結(jié)構(gòu)。
[0011]1型膠原是人體多種膠原的一種，普遍存在于很多的組織器官中；它是由2條a 1肽鏈和1條a 2肽鏈組成；按右手螺旋結(jié)構(gòu)盤旋組成。如圖4所示。
[0012]此種結(jié)構(gòu)保持I型膠原的屬性，如氨基酸按一定順序緊密排列，相鄰肽鏈上的氨基酸殘基可以通過不同方法使之交聯(lián)。但是這種結(jié)構(gòu)在一定溫度的時候變得不穩(wěn)定，三螺旋結(jié)構(gòu)間的螺旋狀開散相成下一級產(chǎn)物-明膠。所以一種高純度的總蛋白含量在98%以上，羥基脯氨酸含量大于10%結(jié)構(gòu)保持自身特有的三螺旋結(jié)構(gòu)的1型膠原材料，其特征在于制造構(gòu)成中保持在低溫條件下以一定的速度進行攪拌才能使其結(jié)構(gòu)不遭到破壞。
[0013]本發(fā)明的第一個方面在于提供一種高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原材料，其特征在于，總蛋白含量在98%以上，羥基脯氨酸含量大于10%，1型膠原纖維結(jié)構(gòu)保持自身特有的三螺旋結(jié)構(gòu)。
[0014]以及由上述具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原材料制成的生物膜片。
[0015]本發(fā)明的第二個方面在于提供一種由如上所述1型膠原材料制備的腦膜或脊膜生物膜片及其制備方法。
[0016]其中，上述腦膜或脊膜生物膜片的制作濃度在1.5%~3%，膜片厚度為1~3毫米，是具有20~80微米大小孔隙的致密微三維孔隙結(jié)構(gòu)膜片狀物。
[0017]在有長、寬、厚存在的情況下就形成三維，當(dāng)其內(nèi)的孔隙結(jié)構(gòu)與大小在微米/納米級別的時候可以稱之為“微”孔隙結(jié)構(gòu)。
[0018]其中，如上所述腦膜或脊膜生物膜片的制備方法，包括如下步驟:
步驟一，選用I~4% (重量/體積)的I型膠原溶于0.001~IN的鹽酸或者0.01~
0.5M的冰醋酸內(nèi)；
步驟二，在酸堿度為pHl~5的環(huán)境下進行均質(zhì)攪拌0.5~3小時，攪拌速度為3，OOO ~6，000 轉(zhuǎn) / 分；
步驟三，在攪拌過程中加入0.001~4N的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酸堿度使其逐步提升為pH9~14的堿性環(huán)境；
步驟四，攪拌0.5~I小時，攪拌速度為10，000~18，000轉(zhuǎn)/分。其后在攪拌過程中再加入0.001~IN的鹽酸再次調(diào)節(jié)酸堿度,使其酸堿度再下調(diào)為pH4~8的環(huán)境；
步驟五，然后保持?jǐn)嚢铚囟鹊陀?5攝氏度，快速攪拌I~3個小時，攪拌速度為18，000 ~30，000 轉(zhuǎn) / 分；
步驟六，過濾均質(zhì)液；
步驟七，再加入100%的酒精；
步驟八，其后在攪拌溫度為O攝氏度~+15攝氏度，攪拌速度為3，000~10，000轉(zhuǎn)/分的條件下，繼續(xù)攪拌0.5~I小時，將得到的懸濁液倒入醫(yī)用不銹鋼冷凍盤內(nèi)，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)制成腦膜或脊膜生物膜片。
[0019]其中，如上所述制備方法中，上述所有步驟中經(jīng)慢速或高速低溫進行均質(zhì)攪拌，攪拌溫度為O攝氏度~+15攝氏度，攪拌時間為I~8小時，攪拌速度為3，000~30，000轉(zhuǎn)/分。所述“均質(zhì)”就是“攪拌”的意思，均質(zhì)攪拌是指0.5%濃度膠原的攪拌要求為質(zhì)地均一性的攪拌?，F(xiàn)有技術(shù)的低濃度0.5%海綿狀生物膜的攪拌從開始到完成均在固定同一酸性環(huán)境下不變的高速攪拌，而且膠原在其酸性環(huán)境下的條件不變；但是本發(fā)明的不同之處在于，攪拌時間變化不同、轉(zhuǎn)速變化不同；同時膠原在攪拌溶液中的酸堿度不同。其中關(guān)鍵是攪拌的環(huán)境不同，其酸堿度的變化為酸性-中性-堿性-近中性。
`[0020]其中，如上所述腦膜或脊膜生物膜片的制備方法，還包括特殊冷凍干燥步驟，具體為:
O冷凍溫度的設(shè)置為(I) +4攝氏度/30分鐘/呈持續(xù)狀態(tài)；(2) -75~-50攝氏度/60-120分鐘/呈快速保持狀態(tài)；(3) -70~-50攝氏度/120~300分鐘/呈直線保持狀態(tài)；過程中冷凍干燥機冷柜的溫度保持-90~-80攝氏度；
2)干燥階段的溫度設(shè)置為(I)O攝氏度/保持15~24小時；(2) 二次升溫的溫度設(shè)置為20攝氏度，時間為30~120分鐘；
3)上述所有程序進行過程當(dāng)中其真空度設(shè)置應(yīng)在200~350毫托。
[0021]更具體地，
O冷凍溫度的設(shè)置為(I) +4攝氏度/30分鐘/呈持續(xù)狀態(tài)；(2) -60~-40攝氏度/120~300分鐘/呈曲線狀態(tài)；(3)-60~-40攝氏度/60~180分鐘/呈持續(xù)狀態(tài)；過程中冷凍干燥機冷柜的溫度應(yīng)保持-80攝氏度，而冷凍室溫度為-45攝氏度；
2)干燥階段的溫度設(shè)置為(I)O攝氏度/保持15~24小時；(2) 二次升溫的溫度設(shè)置為20攝氏度，時間為30~120分鐘；
3)上述所有程序進行過程當(dāng)中其真空度設(shè)置為200~350毫托。
[0022]其中，如上所述腦膜或脊膜生物膜片的制備方法，還包括真空高溫脫水(DHT)步驟，以加強膠原分子肽鏈間的鉸鏈，具體為:將得到的腦膜或脊膜生物膜片放入真空烤箱內(nèi)，其負(fù)壓設(shè)置應(yīng)為負(fù)I個大氣壓，溫度為100~120攝氏度處理48~96小時。
[0023]其中，如上所述腦膜或脊膜生物膜片的制備方法，還包括環(huán)氧乙烷消毒滅菌步驟，制成孔隙在20~80微米的具有微三維孔隙結(jié)構(gòu)腦膜或脊膜生物膜片。[0024]其中，如上所述的環(huán)氧乙烷消毒滅菌條件如下:
A、50%純環(huán)氧乙烷加以50%的二氧化碳在消毒器內(nèi)進行滅菌；
B、滅菌溫度為50攝氏度±5攝氏度；
C、滅菌濕度為30%~70%RH；
D、預(yù)真空為-30~-1OOKpa；
E、換氣真空度為-30~-50Kpa；
F、換氣次數(shù)為6~10次；
G、滅菌時間為3~5小時。
[0025]上述方法中，鹽酸為N為當(dāng)量。2)冰醋酸為M為摩爾。
[0026]海面狀膠原生物膜片的內(nèi)孔隙形成原理為其均質(zhì)漿液中的液體在冷凍過程中形成的冰晶所決定。因為膠原蛋白分子具有很強的粘稠性。高密度、高質(zhì)量膠原生物膜的化學(xué)制作思路以及操作困難之處在于如何將粘稠的物質(zhì)形成可流動性的均質(zhì)漿液。為此如何能將長膠原纖維從均質(zhì) 漿液中析出形成高濃度的纖維本體是本發(fā)明的關(guān)鍵。添加酒精是本發(fā)明獨特的技術(shù)。
[0027]在冷凍干燥程序中，低溫的設(shè)置方法以及冷度溫度是形成漿液中液體成冰晶的關(guān)鍵。膠原纖維的其上附著形成了其孔隙。膠原溶液可以根據(jù)其酸堿度的高低控制其高密度的膠原漿液的粘稠度。這個調(diào)解限度可根據(jù)膠原等電點的酸堿度為調(diào)解中心增添酸或堿溶液使之漿液狀態(tài)發(fā)生變化。同時在適當(dāng)均質(zhì)攪拌的膠原纖維在其漿液升高PH值后可以將其內(nèi)的短纖維聚合成較長的纖維。
[0028]本發(fā)明的第三個方面在于提供如上所述腦膜或脊膜生物膜片在制備硬腦膜或脊膜組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0029]其中，如上所述腦膜或脊膜生物膜片在制備用于修復(fù)受損的硬腦膜/硬脊膜神經(jīng)組織的材料、用于治療或預(yù)防因外傷和腫瘤造成硬腦膜或脊膜損傷或缺損的材料、用于治療或預(yù)防因硬膜缺損引起的腦脊液漏、感染、癲癇的材料中的用途。
[0030]其中，上述腦膜或脊膜生物膜片能在6~12個月內(nèi)降解吸收。
[0031]其中，上述腦膜或脊膜生物膜片是覆蓋在損傷或缺損的任何部位的硬膜外表面。
[0032]其中，上述腦膜或脊膜生物膜片可應(yīng)用于顱腦損傷的任何部位而且可以縫合。
[0033]其中，上述腦膜或脊膜生物膜片在防止或減少腦脊液滲漏的材料中的用途。
[0034]其中，上述腦膜或脊膜生物膜片在防止或減少組織粘連的材料中的用途。
[0035]其中，為使具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原膜片具有良好的抗降解性能以及抗α -平滑肌收縮蛋白的性能，就必須對疏松的膠原分子進行鉸鏈與加強，使之膠原蛋白分子肽鏈間的結(jié)構(gòu)加以改變。
[0036]其中，應(yīng)用上述方法在制備過程中，不同濃度的混合懸濁液，不同的冷凍溫度以及不同的加強方法相匹配，就可以達到20~80微米基本無孔隙的具有較高強度以及不同的降解吸收率的產(chǎn)品。優(yōu)選孔隙大小為20~80微米，更優(yōu)選20~60微米，最佳優(yōu)選值為25微米。
[0037]其中，上述I型膠原蛋白的濃度優(yōu)選為1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%。優(yōu)選濃度為1%~4%，更優(yōu)選濃度為1.5~3%，最佳優(yōu)選值為1.75~2%。本發(fā)明所述所有百分值單位均為質(zhì)量/容積。[0038]總之，本發(fā)明提供一種使用98%高蛋白純度、羥基輔氨酸含量大于10%的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原為材料制作高濃度、高密度、微/無開放孔隙的可縫合膠原膜片的制備方法?？捎糜谠谀X膜或脊膜損傷與缺損后作為腦膜或脊膜組織的修復(fù)材料，用于縫合修補、修復(fù)受損的硬腦膜/硬脊膜組織以及保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。
[0039]本發(fā)明的有益效果包括:本發(fā)明提供一種使用具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料制備高密度可縫合降解時間延長的腦脊膜的使用及制備方法。可以促進損傷缺損的硬腦膜/硬脊膜的細(xì)胞在提供的膠原支架上移行、分化、再生，形成自身相同的組織，同時干擾非序的成纖維細(xì)胞的增生形成瘢痕。本發(fā)明提高了人工腦膜材料的力學(xué)性能，可以在神經(jīng)外科手術(shù)中(如顱底部位的病變在術(shù)中需要修補時)緊密縫合缺損，克服了現(xiàn)有技術(shù)因力學(xué)性能弱和縫合性能差而使神經(jīng)外科手術(shù)受限的缺陷，有效修復(fù)損傷缺損的組織，減少病人的痛苦。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1A為腦膜或脊膜生物膜片的整體立體(透視效果)示意圖。
[0041]圖1B為腦膜或脊膜生物膜片的主視圖。
[0042]圖2A為具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料腦膜或脊膜生物膜片安放位置、縫合以及和顱腦組織的關(guān)系示意圖。
[0043]圖2B為沿圖2A中的A-B剖面的剖面圖。
[0044]圖3A為生物膜在臨床上的使用方法之一的示意圖。
[0045]圖3B為生物膜在臨床上的使用方法之二的示意圖。
[0046]圖4為I型膠原材料具有的三螺旋結(jié)構(gòu)的示意圖。
【具體實施方式】
[0047]以下結(jié)合附圖和具體實例對本發(fā)明作進一步說明。
[0048]圖1A為腦膜或脊膜生物膜片的整體立體(透視效果)示意圖；圖1B為腦膜或脊膜生物膜片的主視圖。其中，附圖標(biāo)記含義為:1——孔隙(孔徑為20~80微米)。其中，腦膜或脊膜生物膜片為20~80微米孔隙/1.5~3毫米厚98%純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料腦膜或脊膜生物膜，也就是，孔隙大小為20~80微米的微三維結(jié)構(gòu)孔隙的高密度膜片。
[0049]圖2A為具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料腦膜或脊膜生物膜片安放位置、縫合以及和顱腦組織的關(guān)系示意圖；圖28為沿圖2A中的A-B剖面的剖面圖。其中，附圖標(biāo)記含義為:2——顱骨骨板；3——膠原生物膜；4——正常腦膜；5——腦實體；6——縫線。
[0050]圖3A為生物膜在臨床上的使用方法之一的示意圖，其中，生物膜大小略大于缺損部位的腦膜；圖3B為生物膜在臨床上的使用方法之二的示意圖，其中生物膜大小符合缺損部位的腦膜。其中，附圖標(biāo)記含義為:2——顱骨骨板；3——膠原生物膜；4——正常腦膜；5——腦實體；6——縫線。
[0051]圖4為I型膠原材料具有的三螺旋結(jié)構(gòu)的示意圖。其中，附圖標(biāo)記含義為-J—第一條α 1-肽 鏈右手螺旋結(jié)構(gòu)；8——第二條α 1-肽鏈右手螺旋結(jié)構(gòu)；9——α 2_肽鏈右手螺旋結(jié)構(gòu)。[0052]制備實施例
制備腦膜或脊膜生物膜片實例:
實施例1:制備1.0%腦膜/脊膜生物膜片
應(yīng)用7.2克高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料在鹽酸的環(huán)境下使用10，000和18，000轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘和1.5小時制成1.%濃度的膠原復(fù)合懸濁液。其后使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)其酸堿度，使之達到粘稠度符合要求的狀態(tài)。取500毫升倒入50X50厘米的冷凍托盤中，于-60攝氏度的低溫條件下，冷凍3~4小時，干燥15小時，制成孔隙60微米，3毫米厚的腦膜/脊膜生物膜片。
[0053]實施例2:制備2%腦膜/脊膜生物膜片
應(yīng)用14.4克高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料在鹽酸的環(huán)境下使用3，000、10，000和18，000轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘、30分鐘和1.0小時制成2%濃度的膠原復(fù)合懸濁液。其后使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)其酸堿度，使之達到粘稠度符合要求的狀態(tài)。其后加入100%酒精繼續(xù)攪拌30分鐘。取500毫升倒入50X50厘米的冷凍托盤中，于_70攝氏度的低溫條件下，冷凍3~4小時，干燥20小時，制成孔隙20微米，2.5毫米厚的腦膜/脊膜生物膜片。
[0054]實施例3:制備2.5%腦膜/脊膜生物膜片
應(yīng)用18克高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料在鹽酸的環(huán)境下采用3，000、10，00、18，000以及28，000轉(zhuǎn)速攪拌15分鐘、30分鐘、30分鐘和I小時制成2.5%濃度的膠原復(fù)合懸濁液。其后使用 氫氧化鈉調(diào)節(jié)其酸堿度和100%酒精，使之達到粘稠度符合要求的狀態(tài)。繼續(xù)攪拌15分鐘。取500毫升倒入50X50厘米的冷凍托盤中，于-75攝氏度的低溫條件下，冷凍3~6小時，干燥25小時，制成孔隙小于20微米，2毫米厚的腦膜/脊膜生物膜片。
[0055]效果實施例
試驗方法和結(jié)果:腦膜或脊膜生物膜片擴大的覆蓋在受損傷或缺損的硬腦膜/硬脊膜部位，其組織周圍的血液中的血小板被大量吸附，同時凝血酶元將滲透于膠原膜的三維孔隙中被激活凝血活性，凝血纖維使膠原膜和正常腦膜緊密接觸。由于其膜片三維孔隙很小或無孔隙所以生物膜片的粘附時間可能較長，高濃度的原料以及低溫冷凍的生物膜具有高強度抗拉性能，所以可以和腦膜進行縫合防止腦脊液的滲出，使顱內(nèi)的內(nèi)環(huán)境相應(yīng)穩(wěn)定。硬膜本身的成纖維細(xì)胞借助膠原膜的三維結(jié)構(gòu)以及外形移行，分化，再生從而促進損傷組織內(nèi)新生的硬膜的再生。
[0056]實施例4:有關(guān)腦膜或脊膜生物膜的動物實驗
腦膜或脊膜生物膜片的動物實驗:6只雄性獵狗進行右側(cè)前外側(cè)顱骨切除術(shù)。用直徑3厘米的環(huán)鉆行行右前外側(cè)頂骨切開術(shù)。不損傷任何顱骨下組織。小心止血后將其下的硬腦膜提起，小心的剪切直徑3厘米的硬腦膜。保護其下的蛛網(wǎng)膜和軟腦膜不受任何損傷。
[0057]將直徑3.5厘米的膠原膜片小心的植入硬腦膜缺損的部位，覆蓋硬腦膜的缺損部位和腦實質(zhì)的表面而進行縫合。其后小心止血后將切除的顱骨瓣放回顱骨缺損的部位。
[0058]術(shù)后動物全部健康成活，無任何神經(jīng)，精神異常癥狀，無腦脊液滲漏，無感染。周后處死動物，用直徑6厘米的環(huán)鉆以第一次手術(shù)骨瓣復(fù)位后的原顱骨的中心為新中心，擴大范圍切除顱骨，暴露其下的硬腦膜和腦實質(zhì)組織。
[0059]肉眼觀察:6只實驗動物的右前外側(cè)頂骨愈合亮好，無任何感染。掀開骨瓣后，顱骨和硬腦膜間無明顯粘連，新生的硬腦膜組織光滑，硬腦膜，蛛網(wǎng)膜和腦實質(zhì)間無明顯粘連和瘢痕。腦實質(zhì)表面正常，無任何退化性改變。
[0060]組織學(xué)檢查:將顱骨/硬腦膜/腦實質(zhì)整體切除。經(jīng)脫鈣，臘塊包埋后，制成5~6微米厚的切片經(jīng)HE染色后觀察組織學(xué)形態(tài)。
[0061]顯微鏡下常規(guī)切片檢查均未發(fā)現(xiàn)異常組織細(xì)胞出現(xiàn)。整體顯示為序的成纖維細(xì)胞和纖維結(jié)碲組織。和正常硬腦膜相比除在新生硬腦膜基底有活動性新生細(xì)胞分化外，在結(jié)構(gòu)，形態(tài)和正常硬腦膜無異。無粘連，無瘢痕形成。偏光顯微鏡下顯示新生的纖維組織
呈現(xiàn)出I型膠原特有的結(jié)構(gòu)-階段性光譜結(jié)構(gòu)，而且植入的膠原膜均已降解吸收，無任何殘留的膠原材料。
[0062]本發(fā)明提供一種使用具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原材料制備高密度可縫合降解時間延長的腦脊膜的使用及制備方法，可以促進損傷缺損的硬腦膜/硬脊膜的細(xì)胞在提供的膠原支架上移行、分化、再生，形成自身相同的組織，同時干擾非序的成纖維細(xì)胞的增生形成瘢痕，有效修復(fù)損傷缺損`的組織，減少病人的痛苦，為社會謀取更大的福利。
【權(quán)利要求】
1.一種高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原材料，其特征在于，總蛋白含量在98%以上，羥基脯氨酸含量大于10%，I型膠原纖維結(jié)構(gòu)保持自身特有的三螺旋結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述具有三螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原材料制成的生物膜片。
3.一種腦膜或脊膜生物膜片，其特征在于，由如權(quán)利要求1所述的I型膠原制成。
4.如權(quán)利要求3所述的腦膜或脊膜生物膜片，其特征在于，膜片厚度為I~3毫米，是具有20~80微米大小孔隙的致密微三維孔隙結(jié)構(gòu)膜片狀物。
5.如權(quán)利要求3或4所述腦膜或脊膜生物膜片的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟: 步驟一，選用I~4% (重量/體積)如權(quán)利要求1所述的I型膠原溶于0.001~IN的鹽酸或者0.01~0.5M的冰醋酸內(nèi)； 步驟二，在酸堿度為pHl~5的環(huán)境下進行均質(zhì)攪拌0.5~3小時，攪拌速度為3，000 ~6，000 轉(zhuǎn) / 分； 步驟三，在攪拌過程中加入0.001~4N的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酸堿度使其逐步提升為pH9~14的堿性環(huán)境； 步驟四，攪拌0.5~I小時，攪拌速度為10，000~18，000轉(zhuǎn)/分，其后在攪拌過程中再加入0.001~IN的鹽酸再次調(diào)節(jié)酸堿度,使其酸堿度再下調(diào)為pH4~8的環(huán)境； 步驟五，然后保持?jǐn)嚢铚囟鹊陀?5攝氏度，快速攪拌I~3個小時，攪拌速度為18，000 ~20，000 轉(zhuǎn) / 分； 步驟六，過濾均質(zhì)液； 步驟七，再加入100%的酒精； 步驟八，其后在攪拌溫度為O攝氏度~+15攝氏度，攪拌速度為3，000~10，000轉(zhuǎn)/分的條件下，繼續(xù)攪拌0.5~I小時，將得到的懸濁液倒入醫(yī)用不銹鋼冷凍盤內(nèi)，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)制成腦膜或脊膜生物膜片。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，上述所有步驟中經(jīng)慢速或高速低溫進行均質(zhì)攪拌，攪拌溫度為O攝氏度~+15攝氏度,攪拌時間為I~8小時,攪拌速度為3，000 ~20，000 轉(zhuǎn) / 分。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟八經(jīng)特殊冷凍干燥程序冷凍干燥，具體為: O冷凍溫度的設(shè)置為(I) +4攝氏度/30分鐘/呈持續(xù)狀態(tài)；(2) -75~-50攝氏度/60~120分鐘/呈快速保持狀態(tài)；(3) -70~-50攝氏度/120~300分鐘/呈直線保持狀態(tài)；過程中冷凍干燥機冷柜的溫度保持-90~-80攝氏度； 2)干燥階段的溫度設(shè)置為(I)O攝氏度/保持15~24小時；(2) 二次升溫的溫度設(shè)置為20攝氏度，時間為30~120分鐘； 3)上述所有程序進行過程當(dāng)中其真空度設(shè)置應(yīng)在200~350毫托。
8.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，還包括真空高溫脫水(DHT)步驟，以加強膠原分子肽鏈間的鉸鏈，具體為:將得到的腦膜或脊膜生物膜片放入真空烤箱內(nèi)，其負(fù)壓設(shè)置應(yīng)為負(fù)I個大氣壓，溫度為100~120攝氏度處理48~96小時。
9.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，還包括環(huán)氧乙烷消毒滅菌步驟，制成孔隙在20~80微米的致密微三維孔隙結(jié)構(gòu)膜片狀物。
10.如權(quán)利要求5或7所述的制備方法，其特征在于，所述的冷凍干燥技術(shù)中 O冷凍溫度的設(shè)置為(I) +4攝氏度/30分鐘/呈持續(xù)狀態(tài)；(2) -60~-40攝氏度/120~300分鐘/呈曲線狀態(tài)；(3)-60~-40攝氏度/60~180分鐘/呈持續(xù)狀態(tài)；過程中冷凍干燥機冷柜的溫度應(yīng)保持-80攝氏度，而冷凍室溫度為-45攝氏度； 2)干燥階段的溫度設(shè)置為(I)O攝氏度/保持15~24小時；(2) 二次升溫的溫度設(shè)置為20攝氏度，時間為30~120分鐘； 3)上述所有程序進行過程當(dāng)中其真空度設(shè)置為200~350毫托。
11.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，使用環(huán)氧乙烷消毒滅菌步驟為: A、50%純環(huán)氧乙烷加以50%的二氧化碳在消毒器內(nèi)進行滅菌； B、滅菌溫度為50攝氏度±5攝氏度； C、滅菌濕度為30%~70%RH； D、預(yù)真空為-30~-1OOKpa； E、換氣真空度為-30~-50Kpa； F、換氣次數(shù)為6~10次； G、滅菌時間為3~5小 時。
12.如權(quán)利要求3或4所述的腦膜或脊膜生物膜片在制備硬腦膜或脊膜組織修復(fù)材料中的用途。
13.如權(quán)利要求3或4所述的腦膜或脊膜生物膜片在制備用于修復(fù)受損的硬腦膜/硬脊膜神經(jīng)組織的材料、用于治療或預(yù)防因外傷和腫瘤造成硬腦膜或脊膜損傷或缺損的材料、用于治療或預(yù)防因硬膜缺損引起的腦脊液漏、感染、癲癇的材料中的用途。
【文檔編號】A61L27/50GK103800941SQ201210445760
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】許和平, 馬克·斯拜克, 許劍懿, 李登云 申請人:北京銀河巴馬生物技術(shù)股份有限公司