專利名稱：一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建及向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系構(gòu)建及向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是繼心血管疾病和癌癥之后的第三大高發(fā)慢性疾病，它嚴(yán)重危害著人類的生命健康。目前，對(duì)糖尿病的治療雖然有很多方法，如口服降糖藥物，注射外源性胰島素，并結(jié)合飲食限制以及體育鍛煉的方法，但都不能從根本上解決問題。器官移植是一種比較好的解決方法，但該方法的應(yīng)用受到供體不足和免疫排斥問題的限制。而干細(xì)胞增殖力強(qiáng)、數(shù)量充足、移植排斥反應(yīng)相對(duì)較低。因此，人們寄希望于干細(xì)胞替代療法能夠解決供體不足和免疫排斥的問題。·
干細(xì)胞的使用雖然能夠解決供體細(xì)胞數(shù)量問題，但是在應(yīng)用前還需要先將其誘導(dǎo)分化為功能性的胰島素分泌細(xì)胞。胰腺干細(xì)胞(Pancreatic stem cells)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細(xì)胞，具有自我更新，多向分化潛能，在自然分化過程中首先分化為胰腺組織內(nèi)的各種細(xì)胞。由于該細(xì)胞來源于胰腺組織，因此，在向胰島素分泌細(xì)胞分化方面具有更大的潛力。越來越多的證據(jù)表明胰腺導(dǎo)管、胰島和腺泡組織內(nèi)都存在著具有多向分化潛能的干細(xì)胞。目前有觀點(diǎn)認(rèn)為，由胰島組織獲得的間充質(zhì)樣干細(xì)胞可能來源于去分化后的 β 細(xì)胞(Russ, H. A. , Bar, Y. , Ravassard, P. , Efrat, S. 2008In vitroproliferation of cells derived from adult human beta—cells revealedbycell-lineage tracing. Diabetes, 57 :1575 1583)。并且這些細(xì)胞在體外多次傳代后其胰島素啟動(dòng)子仍處于活化狀態(tài)，因此具有巨大的糖尿病治療潛力。體外分離、培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并將其定向誘導(dǎo)分化為功能性胰島細(xì)胞，是解決胰島供體短缺的有效途徑。已有多個(gè)研究小組在胰腺干細(xì)胞的研究上開展了一定的基礎(chǔ)工作。西北農(nóng)林科技大學(xué)效梅(單克隆人胰腺干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系的建立[J].分子細(xì)胞生物學(xué)，2008，41 (6) :450-456.)、趙婷(人胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)胰島樣細(xì)胞團(tuán)及其治療大鼠糖尿病的效果[J]·中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11 (7) :1259-1262·)、第三軍醫(yī)大學(xué)姚忠祥(人胰腺干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、鑒定和分化特性[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25 (I) =23-25.)吉林大學(xué)等先后在胰腺干細(xì)胞的分離純化，培養(yǎng)基的篩選，以及細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)鑒定方面做了大量的工作；分離到的胰腺干細(xì)胞在體內(nèi)定向誘導(dǎo)后形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，并檢測到胰島素和C-肽的分泌，但分化效率都很低，移植后對(duì)糖尿病的治療效果不顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系體外構(gòu)建的方法，將該干細(xì)胞系體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞團(tuán)的方法，以及用上述方法得到的胰腺干細(xì)胞系和胰島樣細(xì)胞團(tuán)。將所述胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植至糖尿病模型動(dòng)物后能夠改善其血糖水平。本發(fā)明提 供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系體外構(gòu)建的方法，該方法包括如下步驟消化人胰腺組織，挑出胰島細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)一步消化形成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)后形成間充質(zhì)樣胰腺干細(xì)胞。所述的胰腺干細(xì)胞系，其細(xì)胞為成纖維樣，多呈三角形和短梭狀，單核細(xì)胞，有兩個(gè)或兩個(gè)以上的核仁，細(xì)胞間存在接觸抑制。所述的胰腺干細(xì)胞系，經(jīng)誘導(dǎo)可分化形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)。本發(fā)明的第一方面提供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟I)將人胰腺細(xì)胞加入培養(yǎng)液A中培養(yǎng)2-3天；2)挑出上述培養(yǎng)物中的胰島細(xì)胞團(tuán)，用蛋白酶消化成單細(xì)胞，接種于培養(yǎng)液A中
培養(yǎng)；3)待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，傳代，加入培養(yǎng)液B培養(yǎng)，得到胰島細(xì)胞來源的人胰腺干細(xì)胞系(hPSC)；其中所述培養(yǎng)液A為含有10-25% FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mL EGF和18-22ng/mL bFGF 的 RPMI1640 ;所述培養(yǎng)液 B 為含有 10-25 % FBS、18_22ng/mLbFGF 的Low-DMEMo在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液A還含有O. 8-1. 2mM丙酮酸鈉、I. 8-2. 2mM谷氨酰氨、O. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素；所述培養(yǎng)液B還含有O. 05-0. 15mM β -巰基乙醇、I. 8-2. 2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述方法包括以下步驟I)向人胰腺的組織塊中加入O. 05-0. 2% (質(zhì)量/體積)膠原酶消化，終止消化后過濾、離心并清洗得到單細(xì)胞，加入所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)2-3天；2)在顯微鏡下挑出胰島細(xì)胞團(tuán)，O. 25% (質(zhì)量/體積)蛋白酶將其進(jìn)一步消化成單細(xì)胞，接種于多孔板內(nèi)，添加所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)；3)待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，以O(shè). 25%蛋白酶消化，以I : 3_1 5比例傳代，加入所述培養(yǎng)液B進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)超過50代后得到胰島細(xì)胞來源的人胰腺干細(xì)胞系。本發(fā)明的第二方面提供一種使人胰腺干細(xì)胞系誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞團(tuán)的方法，包括以下步驟I)將人胰腺干細(xì)胞接種于含有O. 8-1. 2% BSA,O. 8-1. 2mM 丁酸鈉、80_120ng/mLActivinA,40-60mM LY294002、8_12mM尼克酰胺、(λ 8-1. 2 X ITS 的 RPMI1640/B27 培養(yǎng)液，在貼壁皿內(nèi)培養(yǎng)3-4天；0. 25%蛋白酶消化，懸浮培養(yǎng)形成EB (類胚體)，更換將上述培養(yǎng)液撤去丁酸鈉、ActivinA和 LY294002 并添加 O. 8-1. 2 X ICT6M RA (維甲酸)、18_22ng/mLEGF和18-22ng/mL bFGF的培養(yǎng)液，繼續(xù)在常規(guī)培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)進(jìn)行初步分化誘導(dǎo)7_9天；在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接種培養(yǎng)液還含有I. 8-2. 2mM L-谷氨酰胺、O. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和O. 8-1. 2mM丙酮酸鈉；2)將初步分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有0.8-1.2% BSA、1.8-2. 2mM谷氨酰月安、O. 8-1. 2mM 丙酮酸鈉、22-28 μ M 醋酸鋅、O. 8-1. 2Χ ITS、90_110mM 煙堿、8_12ng/mLexendin-4和8-12ng/mL β -細(xì)胞素的RPMI1640/B27培養(yǎng)液上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，得到胰島樣細(xì)胞團(tuán)；在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液還含有I. 8-2. 2mM L-谷氨酰胺、O. 8-1. 2mM β-巰基乙醇和O. 8-1. 2mM丙酮酸鈉。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的人胰腺干細(xì)胞系是依照本發(fā)明第一方面的方法構(gòu)建的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系。本發(fā)明的第三方面提供一種使依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系體外誘導(dǎo)分化成類神經(jīng)細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞接種于培養(yǎng)液B培養(yǎng)20-30h后棄去培養(yǎng)液，添加神經(jīng)細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)液處理20-30h后，換成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)作用8-12h ;所述神經(jīng)細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)液為Low-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入lmmol/L β -巰基乙醇；所述神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液為Low-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入5mmol/L β-巰基乙醇。本發(fā)明的第四方面提供一種使依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰島來源的 胰腺干細(xì)胞系誘導(dǎo)成類脂肪細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80-90%，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基(STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit 試劑盒(GIBCO))繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)14 21天。本發(fā)明的第五方面提供一種使依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系誘導(dǎo)成類骨細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80-90%，即更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基(STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit 試劑盒(GIBCO))繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)21 28天。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過上述方法得到的類骨細(xì)胞為茜素紅染色陽性。本發(fā)明的第六方面提供依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰腺干細(xì)胞系。本發(fā)明的第七方面提供依照本發(fā)明第二方面的方法建立的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。本發(fā)明的第八方面提供包含本發(fā)明第六方面所述的人胰腺干細(xì)胞系或本發(fā)明第七方面所述的胰島樣細(xì)胞團(tuán)的藥物、試劑、組合物、試劑盒。本發(fā)明的第九方面提供本發(fā)明第六方面所述的人胰腺干細(xì)胞系或本發(fā)明第七方面所述的胰島樣細(xì)胞團(tuán)在制備用于降低血糖或治療糖尿病的藥物、試劑、組合物、試劑盒中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果I)本發(fā)明獲得的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系，其生長狀況良好，其群體倍增時(shí)間由原來的50. 48 ± I. 56h縮短為24. 75 ± I. 34h，且細(xì)胞的存活率較之以前的大大提高，便于規(guī)?；膽?yīng)用；在體外傳代50代以上仍有較好的活力，仍保持分裂增殖，不易發(fā)生衰老和凋亡。2)本發(fā)明獲得的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系，其營養(yǎng)要求較低，原始分離得到的胰島細(xì)胞的培養(yǎng)需要20%的胎牛血清、EGF、bFGF、尼克酰胺等各種營養(yǎng)因子，而現(xiàn)在只要求約10%的胎牛血清和bFGF，大大降低了培養(yǎng)的成本。3)本發(fā)明獲得的人胰腺干細(xì)胞系來源于人胰島β細(xì)胞的去分化，添加誘導(dǎo)因子后其分化形成功能性胰島樣細(xì)胞團(tuán)效率顯著提高，高糖刺激后能夠分泌胰島素和C-肽，將其移植到患有糖尿病的裸鼠模型的體內(nèi)，能降低血糖濃度甚至可恢復(fù)至正常的血糖水平，并且在40天內(nèi)能夠維持較低的血糖水平。4)由于本發(fā)明獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)是人源的，因此可以預(yù)期其在用于治療患有糖尿病的患者時(shí)的相容程度優(yōu)于其他來源的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。


圖I為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征顯示圖；圖2為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞特征性標(biāo)志鑒定圖；圖3Brdu檢測的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞的細(xì)胞增殖結(jié)果圖；圖4為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞生長曲線圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間(天數(shù))，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)(IO4)；·圖5為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為類神經(jīng)細(xì)胞的特征性標(biāo)志鑒定圖；圖6為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)的特征性標(biāo)志鑒定圖；圖7為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的特征性標(biāo)志鑒定圖；圖8為人胰島來源的胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的特征性標(biāo)志鑒定圖；圖9為胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植裸鼠糖尿病模型后的血糖濃度變化曲線，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間(天數(shù))，縱坐標(biāo)為血糖濃度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建及分化的方法。該細(xì)胞系在體外傳代50代以上仍有較好的活力，保持分裂增殖，不易發(fā)生衰老和凋亡，經(jīng)過誘導(dǎo)后能夠分化形成功能性胰島樣細(xì)胞團(tuán)。以下通過對(duì)該細(xì)胞系的構(gòu)建、細(xì)胞形態(tài)特征、標(biāo)志物的基因及免疫學(xué)鑒定、誘導(dǎo)分化，高低糖刺激胰島素和C-肽分泌以及移植糖尿病模型體內(nèi)的血糖變化試驗(yàn)來做詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。本說明書中的FBS是指胎牛血清，關(guān)于FBS的百分?jǐn)?shù)，如無特別說明，均是指體積百分?jǐn)?shù)。本說明書中的BSA是指牛血清白蛋白，關(guān)于FBS的百分?jǐn)?shù)，如無特別說明，均是指質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。本說明書中使用的其他百分?jǐn)?shù)，如無特別說明，則依從本領(lǐng)域慣常使用的含義。本說明書中提及的培養(yǎng)液均購自Gibico公司，試劑均購自Sigma公司本。說明書中所述的常規(guī)培養(yǎng)液、常規(guī)培養(yǎng)條件，是指本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定的適合培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件。實(shí)施例實(shí)施例I、人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建具體包括以下步驟I)在患者同意的情況下，在需要進(jìn)行部分胰腺切除治療的急性胰腺炎患者的胰腺切除手術(shù)過程中無菌采集所切除的人胰腺組織，置于預(yù)冷的Hank' s中沖洗并除去外周的血液和剪去周圍的脂肪、血管、組織被膜及結(jié)締組織，然后剪成Imm3左右的組織塊，加入O. 1% IV型膠原酶，于37°C消化20-30min。期間不時(shí)振蕩，含有10% FBS Hank' s的終止消化后過80目篩網(wǎng)，離心(500171^11)31^11，并清洗2次，加入含有20% FBSUmM丙酮酸鈉、IOmM 尼克酰胺、O. ImM β -巰基乙醇、2mM 谷氨酰胺、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF 和 IOOmg/mL青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。2)在顯微鏡下手工挑出胰島細(xì)胞團(tuán)，O. 25%胰蛋白酶將其進(jìn)一步消化形成單細(xì)胞懸液，終止消化后接種于12孔板內(nèi)，添加含有20% FBS、ImM丙酮酸鈉、IOmM尼克酰胺、O. ImMβ-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，以O(shè). 25%胰蛋白酶消化，以I : 3比例傳代，將細(xì)胞接種于含有10% FBS,O. ImM β-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/鏈霉素的Low-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每兩天半量換液。實(shí)施例2、人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的鑒定2. I細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征在相差顯微鏡下觀察人胰島來源的胰腺干細(xì)胞的形態(tài)變化。具體結(jié)果如圖I所·示，其中，圖A為原代分離的人胰島細(xì)胞團(tuán)，圖B為擴(kuò)大培養(yǎng)后的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞(hPSC)，與胰島細(xì)胞相比，細(xì)胞為成纖維樣，多呈三角形和短梭狀，呈網(wǎng)絡(luò)狀排列，細(xì)胞間存在接觸抑制，圖C為對(duì)人胰腺干細(xì)胞進(jìn)行吉姆薩染色，細(xì)胞為單核，核比較明顯，有2個(gè)或2個(gè)以上的核仁，能夠看到明顯的細(xì)胞分裂相。該細(xì)胞在體外傳代50代以上仍有較好的活力，仍保持分裂增殖，不易發(fā)生衰老和凋亡。2. 2胰腺干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記的鑒定2. 2. I免疫熒光檢測將人胰島來源的胰腺干細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后，免疫熒光染色對(duì)胰腺干細(xì)胞特征性標(biāo)志進(jìn)行鑒定。免疫突光染色步驟為a.細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定lOmin，用PBS洗滌2-3次；b.加入 O. I % TritionX-IOO 室溫作用 lOmin, PBS 洗 2-3 次，每次作用 5min ；c.加入含 I % BSA 的 PBS 作用 30min ；d.加入一抗，4°C過夜；e. PBS洗2-3次，每次作用5min，加入熒光二抗，37°C作用Ih ；f. PBS洗2-3次，熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光檢測所使用的一抗主要有波形蛋白(Vim)、PDXU Ngn3、葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子(Glut2)和CK19。免疫熒光染色結(jié)果分別如圖2A所示，結(jié)果顯示該胰腺干細(xì)胞系呈波形蛋白(Vim)、PDXl、Ngn3和葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子(Glut2)陽性，而不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記CK19。2. 2. 2PCR檢測胰腺干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)根據(jù)GenBank中已發(fā)表的反轉(zhuǎn)錄酶基因參考序列，設(shè)計(jì)并人工合成特異性檢測引物，相關(guān)引物序列、長度、及Tm值見表I。表I.胰腺干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及其相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟 1)將人胰腺細(xì)胞加入培養(yǎng)液A中培養(yǎng)2-3天； 2)挑出上述培養(yǎng)物中的胰島細(xì)胞團(tuán)，用蛋白酶消化成單細(xì)胞，接種于培養(yǎng)液A中培養(yǎng)； 3)待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，傳代，加入培養(yǎng)液B培養(yǎng)，得到胰島細(xì)胞來源的人胰腺干細(xì)胞系(hPSC)； 其中所述培養(yǎng)液A為含有10-25% FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mLEGF和18_22ng/mL bFGF 的 RPMI1640 ;所述培養(yǎng)液 B 為含有 10-25% FBS、18_22ng/mLbFGF 的 Low_DMEM。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)液A還含有0.8-1.2mM丙酮酸鈉、1.8-2. 2mM谷氨酰氨、O. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素；所述培養(yǎng)液B還含有O. 05-0. 15mM β -巰基乙醇、I. 8-2. 2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素。
3.權(quán)利要求I或2的方法，該方法包括以下步驟 1)向人胰腺的組織塊中加入O.05-0. 2% (質(zhì)量/體積)膠原酶消化，終止消化后過濾、離心并清洗得到單細(xì)胞，加入所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)2-3天； 2)在顯微鏡下挑出胰島細(xì)胞團(tuán)，O.25% (質(zhì)量/體積)蛋白酶將其進(jìn)一步消化成單細(xì)胞，接種于多孔板內(nèi)，添加所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)； 3)待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)，以O(shè).25%蛋白酶消化，以I : 3_1 5比例傳代，力口入所述培養(yǎng)液B進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)超過50代后得到胰島細(xì)胞來源的人胰腺干細(xì)胞系。
4.一種使人胰腺干細(xì)胞系體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞團(tuán)的方法，該方法包括以下步驟 1)將人胰腺干細(xì)胞接種于含有O.8-1. 2 % BSA、0. 8-1. 2mM 丁酸鈉、80-120ng/mLActivinA,40-60mM LY294002、8_12mM 尼克酰胺、O. 8-1. 2X ITS 的 RPMI1640/B27 培養(yǎng)液，在貼壁皿內(nèi)培養(yǎng)3-4天；0. 25%蛋白酶消化，懸浮培養(yǎng)形成EB，更換將上述培養(yǎng)液撤去丁酸鈉、ActivinA 和 LY294002 并添加 O. 8-1. 2X KT6M RA、18_22ng/mL EGF 和 18_22ng/mLbFGF的培養(yǎng)液，繼續(xù)在常規(guī)培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)進(jìn)行初步分化誘導(dǎo)7-9天；在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接種培養(yǎng)液還含有I. 8-2. 2mM L-谷氨酰胺、O. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和O.8-1.2mM丙酮酸鈉； 2)將初步分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有O.8-1.2% BSA、1.8-2. 2mM谷氨酰胺、0.8-1.2mM 丙酮酸鈉、22_28μΜ 醋酸鋅、O. 8-1. 2Χ ITS、90_110mM 煙堿、8_12ng/mLexendin-4和8_12ng/mL β -細(xì)胞素的RPMI1640/B27培養(yǎng)液上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，得到胰島樣細(xì)胞團(tuán)；在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液還含有I. 8-2. 2mM L-谷氨酰胺、O. 8-1. 2πιΜβ -巰基乙醇和O. 8-1. 2mM丙酮酸鈉。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述人胰腺干細(xì)胞系是依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法建立的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系。
6.—種使依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法建立的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系誘導(dǎo)分化成類神經(jīng)細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞接種于所述培養(yǎng)液B培養(yǎng)20-30h后棄去培養(yǎng)液，添加神經(jīng)細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)液處理20-30h后，換成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)作用8-12h ;所述神經(jīng)細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)液為Low-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入lmmol/L β -巰基乙醇；所述神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液為Low-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入5mmol/Lβ-巰基乙醇。
7.—種使依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法建立的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系誘導(dǎo)成類脂肪細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90 %，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)14 21 天；其中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit試劑盒(GIBCO)。
8.一種使依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法建立的人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系誘導(dǎo)成類骨細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的細(xì)胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)21 28天；其中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為STEMPRO!0steogenesis Differentiation Kit試劑盒(GIBCO)。
9.依照權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法建立的人胰腺干細(xì)胞系。
10.依照權(quán)利要求4或5的方法建立的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。
11.包含權(quán)利要求9所述的人胰腺干細(xì)胞系或權(quán)利要求10所述的胰島樣細(xì)胞團(tuán)的藥物、試劑、組合物或試劑盒。
12.權(quán)利要求9所述的人胰腺干細(xì)胞系或權(quán)利要求10所述的胰島樣細(xì)胞團(tuán)在制備用于降低血糖或治療糖尿病的藥物、試劑、組合物或試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人胰島來源的胰腺干細(xì)胞系的構(gòu)建與分化的方法，所述的胰腺干細(xì)胞系，是從人胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)擴(kuò)增出胰腺干細(xì)胞，且具有多向分化潛能。其經(jīng)過誘導(dǎo)后能夠分化形成類神經(jīng)細(xì)胞、類脂肪細(xì)胞、類骨細(xì)胞、以及功能性胰島樣細(xì)胞團(tuán)。將功能性胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植到患有糖尿病裸鼠模型的體內(nèi)，能降低模型裸鼠血糖濃度，在24天內(nèi)能夠維持正常的血糖水平。
文檔編號(hào)A61K35/39GK102899288SQ20121044433
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者曹暉, 徐軍軍, 孫振華 申請(qǐng)人:厚樸生物科技(蘇州)有限公司