專利名稱：磺酸化絲素蛋白材料的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物材料領域，具體涉及一種可用于韌帶、血管及骨組織工程材料的磺酸化絲素蛋白材料的制備方法。
背景技術：
生物材料是一類應用于治療、診 斷、修復或替換人體組織、器官或增進其功能的新型高技術材料，涉及億萬人的健康，是保障人類健康的必需品，其成功應用挽救了危重病人的生命，同時也提高了病人的生活質量和健康水平。天然聚合物材料與生物大分子物質極為相似，能夠被生物體內酶降解，比人工合成材料組織相容性好，具有較小的免疫原性，但其也存在不足，如生物活性偏低。為了保持生物材料優(yōu)點的同時又提高其生物活性，對天然聚合物進行化學修飾是解決此問題的有效途徑。我國是產絲大國，具有幾千年應用蠶絲的歷史，但都局限于初級的使用。絲素蛋白作為天然生物蛋白由蠶繭經脫膠、溶解、透析和冷凍干燥獲得，具有較好的生物相容性、低免疫源性、良好的機械性能以及物理化學性質。近年來，絲素蛋白在眼角膜、血管、人造皮膚、韌帶及骨等組織工程，藥物緩控釋，酶固定化等領域都有較廣泛的應用，但其生物學活性較低。本發(fā)明在天然絲素蛋白材料的基礎上采用偶氮鹽方法進行化學修飾，獲得磺酸化絲素蛋白，提高絲素蛋白的生物學活性。目前，國內專利CN 1608683A公開了一種抗凝血不溶性絲素蛋白的制備方法，采用的是將肝素和絲素蛋白共混方法制備不同形貌和結構的抗凝血不溶性絲素蛋白材料，在一定程度上達到目的。為了提高絲素蛋白的生物活性，CN 101029079A公開了硫酸化絲素蛋白的制備方法及其在抗凝血藥物上的應用，采用氯磺酸為原料結絲素蛋白進行修飾。在溶液中硫酸基團化學性質穩(wěn)定，能很好地模擬肝素性質，起到抗凝血作用。采用偶氮鹽方法對絲素蛋白進行磺酸化修飾，可得到有生物活性的磺酸化絲素蛋白，并且制備方法方便，可行。

發(fā)明內容
解決的技術問題本發(fā)明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種磺酸化絲素蛋白材料的制備方法，該磺酸化絲素蛋白材料在起到抗凝血作用的同時還可以提高材料對細胞或生長因子的粘附、擴散和增殖能力。技術方案磺酸化絲素蛋白材料的制備方法，步驟為a.偶氮鹽儲備液的配制將ImM O. 4M對氨基苯磺酸溶液滴加到O. OlM 4M對甲基苯磺酸溶液，使對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I : (2 8)，保持溫度在O 5°C ；b.向步驟a混合液中滴加冰浴冷卻的
O.OlM 6M亞硝酸鈉水溶液，混勻，使亞硝酸鈉與對氨基苯磺酸的物質的量之比為(O. 01 2) :1，冰浴10 30min，得偶氮鹽儲備液，儲存待用；c.將絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液中，獲得質量體積比濃度為I 20%的絲素蛋白溶液，添加上述偶氮鹽儲備液O. 01 2mL/100mg絲素蛋白，用檸檬酸緩沖液維持pH在7. 5 10，冰浴反應10 20min，透析、冷
凍干燥得磺酸化絲素蛋白。所述檸檬酸鹽緩沖溶液為O. 05 O. 2M, pH 8 10。有益效果I.本發(fā)明首次采用偶氮鹽法對絲素蛋白進行磺酸化修飾，反應迅速，反應效率高，鑒別容易且手段多樣，對生物材料的開發(fā)利用具有十分重要的意義。2.本發(fā)明的制備產物不僅是一種具有較好抗凝血的材料，而且具有較少的免疫原性，可以明顯改善絲素蛋白與細胞和生長因子的粘附、擴散和增殖能力的生物活性材料，豐富生物材料的種類，為其在血管、韌帶、骨等組織工程應用提供依據。


圖I絲素蛋白磺酸化修飾原理圖；圖2絲素蛋白溶液(a)和磺酸化絲素蛋白溶液(b)；圖3磺酸化絲素蛋白紫外全波長掃描；圖4絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白FTIR比較；圖5絲素蛋白修飾前后免疫原性比較。
具體實施例方式實施例I將2mL O. 4M對氨基苯磺酸水溶液與ImL I. 6M對甲苯磺酸水溶液混合并，對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I :2，保持溫度在5°C。向步驟I混合液中添加ImL O. 8M冰浴亞硝酸鈉水溶液，混勻，維持冰浴15min，得到偶氮鹽反應液。將O. 8g絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液(O. 05M pH 8)中，獲得濃度為10%(w/V, g/mL)的絲素蛋白溶液8mL,添加16mL的偶氮鹽反應液(2mL/100mg絲素蛋白)，用朽1檬酸緩沖液維持pH在8，冰浴反應20min，利用截留分子量為3500的透析袋透析2 3d，冷凍干燥，得磺酸化絲素蛋白。實施例2將IOmL O. 08M對氨基苯磺酸水溶液與4mL I. 6M對甲苯磺酸水溶液混合并，對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I :8，保持溫度在0°C。向步驟I混合液中添加1. 6mL IM冰浴亞硝酸鈉水溶液，混勻，冰浴維持30min，得到偶氮鹽反應液。將O. 8g絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液(O. 05M pH 8)中，獲得濃度為20%(w/v, g/mL)的絲素蛋白溶液4mL,添加O. 08mL的偶氮鹽反應液(O. OImL/1OOmg絲素蛋白)，用檸檬酸緩沖液維持pH在10，冰浴反應15min，利用截留分子量為3500的透析袋透析2 3d，冷凍干燥，得磺酸化絲素蛋白。實施例3將IOOmL ImM對氨基苯磺酸水溶液與40mL O. OlM對甲苯磺酸水溶液混合并冰浴冷卻，對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I :4，保持溫度在2°C。
向步驟I混合液中添加0.0017mL 6M冰浴亞硝酸鈉水溶液，混勻，冰浴維持20min，
得到偶氮鹽反應液。將O. Ig絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液(O. 05M pH 8)中，獲得濃度為1% (w/V, g/mL)的絲素蛋白溶液IOmL,添加ImL的偶氮鹽反應液(lmL/100mg絲素蛋白)，用朽1檬酸緩沖液維持pH在9，冰浴反應lOmin，利用截留分子量為3500的透析袋透析2 3d，冷凍干燥，得磺酸化絲素蛋白。實施例4
本實施例產率高于其它實施例，將4mL O. 125M對氨基苯磺酸水溶液與4mL O. 5M對甲苯磺酸水溶液混合并，對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I :4，保持溫度在(TC。 向步驟I混合液中添加O. 125mL 2M冰浴亞硝酸鈉水溶液，混勻，冰浴維持30min，
得到偶氮鹽反應液。將O. 5g絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液(O. 05M pH 8)中，獲得濃度為15%(w/V, g/mL)的絲素蛋白溶液IOmL,添加2. 5mL的偶氮鹽反應液(O. 5mL/100mg絲素蛋白),用朽1檬酸緩沖液維持PH在10，冰浴反應15min，利用截留分子量為3500的透析袋透析2 3d，冷凍干燥，得磺酸化絲素蛋白。絲素蛋白中酪氨酸修飾百分率在實施例5將4mL O. 333M對氨基苯磺酸水溶液與ImL 4M對甲苯磺酸水溶液混合，對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I :3，保持溫度在4°C。向步驟I混合液中添加O. 5mL 4M冰浴亞硝酸鈉水溶液，混勻，冰浴維持25min，得到偶氮鹽反應液。將I. 8g絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液(O. 05M pH 10)中，獲得濃度為15%(w/v, g/mL)的絲素蛋白溶液12mL,添加27mL的偶氮鹽反應液(I. 5mL/100mg絲素蛋白)，用檸檬酸緩沖液維持PH在8，冰浴反應lOmin，利用截留分子量為3500的透析袋透析2 3d，冷凍干燥，得磺酸化絲素蛋白。絲素蛋白的修飾原理如圖I。修飾前后絲素蛋白溶液由無色變成紫紅色，這是由于在反應過程中形成偶氮鹽，偶氮鹽顯色產生的，如圖2 ;經紫外分光光度計全波長掃描發(fā)現，絲素蛋白僅在275nm處有蛋白吸收峰，而磺酸化絲素蛋白不僅具有蛋白吸收峰，在325nm存在偶氮鹽吸收峰，同時在395nm處還存在一個肩峰，如圖3 ;紅外比較修飾先后發(fā)現絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白都具備典型的酰胺I、酰胺II和酰胺III的蛋白二級結構特征吸收峰，說明對絲素蛋白進行磺酸化修飾未影響蛋白質的二級結構。進一步研究發(fā)現磺酸化絲素蛋白的譜圖在lC^OcnT1和lOlOcnT1為苯磺酸中SO2對稱吸收峰，在IHOcnT1出為SO2反對稱吸收峰，結果，如圖4。通過上述三種方法均可以鑒別磺酸化絲素蛋白的生成，檢測方法快速便捷。比較絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白的免疫原性。(I)頸椎脫臼法處死小鼠，置于75%的酒精中對其表面進行消毒，取出置于托盤中，用無菌剪刀剪開腹部皮膚，找到脾臟，另取一無菌剪刀和鑷子，剪下脾臟，放入無菌培養(yǎng)皿中。(2)在另一培養(yǎng)皿中加入Hank’s液3mL，用鑷子取一塊銅網，將脾臟置于銅網上，取一支無菌試管用底部研磨，制成細胞懸液，倒入離心管中。加適量Tris-NH4Cl (O. 17mol/L Tris,O. 16mol/L NH4Cl,兩者的水溶液按體積I 9混勻，10% HCl調pH為7. 2)溶解紅細胞，離心1500rpm，7min,棄去上清，加入培養(yǎng)液，混勻。移取20 μ L細胞懸液置于EP管中，再加入20 μ L臺盼藍染液，混勻，吸取部分混合液用血球計數板計數，并調其濃度為I X IOVmL的脾細胞懸液。(3)取EP管4支,將絲素蛋白和磺酸化絲素蛋白液稀釋至500 μ g/mL, 250 μ g/mL,125 μ g/mL, 67. 5 μ g/mL,分別置于上述管中，每管O. lmL。(4)細胞懸液與蛋白溶液混合向上述管中各加入細胞懸液O. 9mL，使得混合液中的蛋白濃度為50 μ g/mL,25 μ g/mL, 12. 5 μ g/mL, 6. 75 μ g/mL,細胞濃度為9 X 105/mL。另取一管將細胞懸液與培養(yǎng)液以9 1的體積比例混合，作陰性對照。(5)將上述細胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，每孔O. ImL,每個濃度4個平行孔。 (6)將培養(yǎng)板放入含有5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44小時后取出，吸出培養(yǎng)液，向每孔中加入MTT溶液10 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時。(7)各孔內加入二甲亞砜IOOuL/孔,振蕩5min后,用酶標測定儀測OD值,測定波長 578nm。結果如圖5所示，表明絲素蛋白經磺酸化修飾后，免疫原性仍很低，與絲素蛋白相近，可以作為生物材料的原料使用。
權利要求
1.磺酸化絲素蛋白材料的制備方法，其特征在于步驟為a.偶氮鹽儲備液的配制將ImM O. 4M對氨基苯磺酸溶液滴加到O. OlM 4M對甲基苯磺酸溶液，使對氨基苯磺酸與對甲基苯磺酸的摩爾比為I :(2 8)，保持溫度在O 5°C;b.向步驟a混合液中滴加冰浴冷卻的O. OlM 6M亞硝酸鈉水溶液，混勻，使亞硝酸鈉與對氨基苯磺酸的物質的量之比為(O. 01 2) :1，冰浴10 30min，得偶氮鹽儲備液，儲存待用；c.將絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液中，獲得質量體積比濃度為I 20%的絲素蛋白溶液，添加上述偶氮鹽儲備液O. 01 2mL/100mg絲素蛋白，用檸檬酸緩沖液維持pH在7. 5 10，冰浴反應10 20min，透析、冷凍干燥得磺酸化絲素蛋白。
2.根據權利要求I所述的磺酸化絲素蛋白材料的制備方法，其特征在于所述檸檬酸鹽緩沖溶液為O. 05 O. 2M, pH 8 10。
全文摘要
磺酸化絲素蛋白材料的制備方法，步驟為a.偶氮鹽儲備液的配制；b.向步驟a混合液中滴加冰浴冷卻的亞硝酸鈉水溶液，混勻冰浴，得偶氮鹽儲備液；c.將絲素蛋白溶解在檸檬酸鹽緩沖溶液中，獲得絲素蛋白溶液，添加上述偶氮鹽儲備液，用檸檬酸緩沖液維持pH在7.5～10，冰浴反應，透析、冷凍干燥得磺酸化絲素蛋白。本發(fā)明的制備產物不僅是一種具有較好抗凝血的材料，而且具有較少的免疫原性，可以明顯改善絲素蛋白與細胞和生長因子的粘附、擴散和增殖能力的生物活性材料，豐富生物材料的種類，為其在血管、韌帶、骨等組織工程應用提供依據。
文檔編號A61L33/12GK102827376SQ201210330440
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權日2012年9月10日
發(fā)明者顏輝, 李紹群, 唐玉斌, 江明珠, 賈俊強, 吳瓊英 申請人:江蘇科技大學