專(zhuān)利名稱(chēng)：一種昆崳林蛙改造體抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體地說(shuō)是ー種昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體抗菌肽Kunyuenin-3及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自由基指任何包含ー個(gè)未成對(duì)電子的原子或原子團(tuán)。生物體與外界接觸和自身產(chǎn)生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過(guò)氧化氫、脂質(zhì)過(guò)氧自由基、ニ氧化氮、一氧化氮自由基、單線(xiàn)態(tài)氧和臭氧。在較高濃度下，活性氧自由基對(duì)生物細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核酸、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)造成損傷。造成DNA損傷，進(jìn)一歩引起復(fù)制錯(cuò)誤、基因組不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)錄意外起始或終止，從而導(dǎo)致生物體變異或疾病發(fā)生；引起細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變；引起蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和失活。
·
目前發(fā)現(xiàn)，活性氧自由基與多種人類(lèi)疾病有關(guān),如癌癥、心腦血管疾病、缺血再灌注損傷、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病和衰老等。為了抵抗活性氧自由基對(duì)機(jī)體的損害，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中生物體形成多種不同的自由基清除系統(tǒng)，包括非基因編碼的小分子物質(zhì)，如尿酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜烯類(lèi)、硫辛酸和輔酶Q等；基因編碼的大分子抗氧化酶類(lèi)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、硫氧還蛋白酶系統(tǒng)和谷胱甘肽酶系統(tǒng)；基因編碼的小分子抗氧化肽類(lèi)，如從兩棲類(lèi)蛙科動(dòng)物皮膚中發(fā)現(xiàn)的各種小分子抗氧化多肽。各種不同類(lèi)型的自由基清除劑在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，如維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。昆箭林娃(Rana kunyuensis)屬于兩棲綱無(wú)尾目娃科娃屬，為中國(guó)特有種,僅分布于山東省煙臺(tái)市昆崳山。目前關(guān)于昆崳林蛙形態(tài)、發(fā)育和分子進(jìn)化已有報(bào)道，但是關(guān)于昆崳林蛙來(lái)源抗氧化多肽的研究還沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于ー種昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體抗菌肽Kunyuenin-3及其制備方法和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為ー種昆箭林娃改造體抗菌肽，改造體抗菌肽為昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體Kunyuenin-3,其是直鏈多肽，含有14個(gè)氨基酸殘基，分子量1587. 97Da，等電點(diǎn) 8. 96。所述改造體抗菌肽為苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸ー丙氨酸一丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー異亮氨酸一蘇氨酸一精氨酸ー賴(lài)氨酸一半胱氨酸。改造體抗菌肽的應(yīng)用，所述所述的改造體抗菌肽用于制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的用途。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明根據(jù)昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨基酸序列，利用分子改造方法設(shè)計(jì)Kunyuenin的改造體Kunyuenin-3,該改造體具有極強(qiáng)的抗氧化活性，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、溶血活性低、制備方法簡(jiǎn)單等有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆I)昆崳林蛙皮膚總RNA提取①取300mg昆崳林蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中，加入Iml總RNA提取緩沖液(Trizol,美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品)，充分混勻，而后于4°C,12000rpm 離心 lOmin。②離心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)こ醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為昆崳林蛙皮膚總RNA。2)昆崳林蛙皮膚cDNA文庫(kù)構(gòu)建采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(I) cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):①經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是在含0. I % (V/V) DEPC的水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入Iul昆箭林娃皮膚總RNA、1 ii I 3’端一鏈合成引物(3’ In-FusionSMARTer CDS Primer)和 2. 5 y I DEPC 處理的水(DEPC 處理的水是含 0. I % (V/V) DEPC 的水，放置過(guò)夜，高壓滅菌)使總體積達(dá)到4. 5iU，混勻后短暫離心(2000rpm，30s)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。 ②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫(kù)試劑盒中配備),2. 0 u I 5X 第一鏈緩沖液、0.25iil IOOmM DTTU. Ou I IOmM dNTPMixU. Ou I SMARTer V Oligonucleotide、0. 25 u I RNase Inhibitor 和 I. Ou I SMARTScribe Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶，混合離心管中試劑并短暫離心(2000rpm,30s),在42°C保溫90min,然后68°C保溫lOmin。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 Ul所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫(kù)試劑盒中配備)①將2 ul cDNA 第一鏈(mRNA 反轉(zhuǎn)錄)、80 U I 去離子水、10 U I IOXAdvantage2PCR 緩沖液、2iil 50 XdNTP 混合物、2 ii I 5’PCR 引物、2yl CDS III/3’PCR 引物以及 2 y I50 X Advantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預(yù)熱的 PCR 管中進(jìn)行混合。②在PCR 儀中按以下程序擴(kuò)增95°C，lmin ; 18 個(gè)循環(huán)95°C，15sec，65°C，30sec，68°C，6min。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈ー 80°C保存。(3)昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆篩選
根據(jù)蛙科抗菌肽信號(hào)肽區(qū)保守序列設(shè)計(jì)正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列為 5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另ー擴(kuò)增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列為5’ -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR 反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行94°C 4min，94°C 30sec,57 °C 30sec和72°C lmin,30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl2-MgCl2法制備好的DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。涂板并進(jìn)行氨芐青霉素和藍(lán)白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測(cè)插入片段大小。挑取陽(yáng)性菌落,搖菌提取質(zhì)粒,使用Applied Biosystems DNAsequencer, model ABIPRISM 377 進(jìn)行核苷酸測(cè)序。測(cè)定結(jié)果編碼昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No. I所示atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct 60·ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc 120
gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt 180ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac 240昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin基因核苷酸的序列表為序列長(zhǎng)度為279個(gè)堿基，序列類(lèi)型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類(lèi)cDNA，來(lái)源昆崳林蛙皮膚。昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的化學(xué)合成I、昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的化學(xué)合成方法根據(jù)基因推導(dǎo)的成熟肽氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過(guò)HPLC反相柱層析脫鹽。II、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)。III、純化的昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin是昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因編碼的一種環(huán)狀多肽，含有十四個(gè)氨基酸殘基，分子量1584. 97Da，等電點(diǎn)8. 96。昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin全序列為苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸ー丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー異亮氨酸一蘇氨酸一精氨酸ー賴(lài)氨酸一半胱氨酸，其中兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成ー對(duì)分子內(nèi)ニ硫鍵，且C末端酰胺化。制備Kunyuenin-3 I、Kunyuenin-3的制備方法根據(jù)上述Kunyuenin的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,利用HPLC反相柱層析脫鹽。II、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)。III、純化的Kunyuenin-I用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。測(cè)定結(jié)果為
Kunyuenin-3是昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的一種改造體。Kunyuenin-3是一種直鏈多肽，含有14個(gè)氨基酸殘基，分子量1587. 97Da，等電點(diǎn)8. 96。Kunyuen in-3全序列為苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸ー丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー異亮氨酸一蘇氨酸一精氨酸ー賴(lài)氨酸一半胱氨酸。實(shí)施例2Kunyuenin_3藥理實(shí)驗(yàn)I. Kunyuenin-3抗氧化活性測(cè)定DPPH (2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl hydrate) (.2,2' - ニ苯代苦味酸基苯肼)用甲醇溶解配成6X KT5M的溶液。將48 ill DPPH溶液分別與上述2 ill不同濃度的Kunyuenin-3樣品混合,分別室溫下避光靜置30min,并分別于517nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照組為溶解樣品所用滅菌去離子水。實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行(表I )，紫外分光光度計(jì)調(diào)零時(shí)使用甲醇。DPPH 清除率) = (AB — AA)/ABX 100 (AB:空白對(duì)照組吸光值；AA:樣品組吸·
光值)。表I. Kunyuenin-3 抗氧化活性
抗菌肽最終濃度DPPH清除率1%
(|Lig/ml )
40065.2
200 61.1 10063.3
50J60.7結(jié)果如表I所示，Kunyuenin-3具有極強(qiáng)的抗氧化活性，且其活性隨著濃度的升高而逐步增強(qiáng)。在樣品濃度為400ii g/ml時(shí)，其DPPH清除率1%達(dá)到65. 2°ん2. Kunyuenin-3 抗菌活性檢測(cè)分別挑取保存于斜面上的試驗(yàn)菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌090223+和星形諾卡菌090312+)均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)平板上，將經(jīng)過(guò)滅菌的0. 5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的Kunyuenin-3樣品溶液10 yl，于37°C倒置培養(yǎng)18 — 20小吋，觀(guān)察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會(huì)在濾紙片周?chē)纬汕逦该鞯囊志?，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越?qiáng)。3. Kunyuenin-3 最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration)測(cè)定試驗(yàn)菌株分別接種到MH液體培養(yǎng)基中(購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)，370C振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而后將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液用新鮮MH液體培養(yǎng)基稀釋到2X105cfu/ml。取I. 9mL上述稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)液，加入經(jīng)0. 22m孔徑膜過(guò)濾的2mg/ml的昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin-3樣品溶液0. ImL作為第一管，第一管混勻后取出ImL加入第2管中，依次倍比稀釋(參見(jiàn)表2)，自第9管吸出ImL棄去，第10管系對(duì)照管。表2稀釋方法
權(quán)利要求
1.一種昆箭林娃改造體抗菌肽，其特征在于改造體抗菌肽為昆箭林娃(Ranakunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體Kunyuenin-3,其是直鏈多肽，含有14個(gè)氨基酸殘基，分子量1587. 97Da，等電點(diǎn)8. 96。
2.按權(quán)利要求I所述的昆崳林蛙改造體抗菌肽，其特征在于所述改造體抗菌肽為苯丙氨酸一売氨酸一脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸一丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸一異亮氨酸一蘇氨酸一精氨酸一賴(lài)氨酸一半胱氨酸。
3.—種權(quán)利要求I所述的昆崳林蛙改造體抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于所述的改造體抗菌肽用于制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種昆崳林蛙(Rana kunyuensis抗菌肽Kunyuenin改造體抗菌肽Kunyuenin-3及其制備方法和應(yīng)用。改造體抗菌肽為昆崳林蛙(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造體Kunyuenin-3，其是直鏈多肽，含有14個(gè)氨基酸殘基，分子量1587.97Da，等電點(diǎn)8.96。本發(fā)明改造抗菌肽Kunyuenin-3具有極強(qiáng)的抗氧化活性，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、溶血活性低、制備方法簡(jiǎn)單等有益特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K8/64GK102786583SQ20121028750
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者于海寧, 王義鵬, 秦松 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所