專利名稱：精制海狗油及其在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種精制海狗油及其在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及該精制海狗油在制備降低血清中總膽固醇或甘油三酯的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海狗油(harp seal oil)俗稱海豹油，是從深海高寒(_50°C )水域中的哺乳動(dòng)物海狗的脂肪層提煉加工的油。海狗是以名貴鱈魚，三文魚等為食，體內(nèi)富集厚厚的脂肪層，海狗油中富含ω-3多不飽和脂肪酸(EPA、DPA、DHA)，加之北極無污染潔凈的自然生態(tài)環(huán)境，海狗油成為大自然中最理想的ω-3不飽和脂肪酸的重要來源。其具有保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)血脂等作用在一些文獻(xiàn)中已有報(bào)道，引起了國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域的高度重視。
不飽和脂肪酸是一類極其重要的脂肪酸，它包括ω-3和ω-6系列，但人體不能合成，必須通過生物途徑攝取，前者來自海洋動(dòng)物(魚，海狗等)，后者來自植物油(如花生，豆油等)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)ω-3和ω-6系列必須保持合適的比例才能維持人體正常的生理活動(dòng)。WHO認(rèn)為ω-3和ω-6的最佳比例為I :4，而現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)往往導(dǎo)致人們的ω-3不飽和脂肪酸攝入不足，大量統(tǒng)計(jì)資料表明，目前人體內(nèi)該比例嚴(yán)重偏離至1:25，甚至1:30。據(jù)此，WHO和聯(lián)合國糧農(nóng)組織發(fā)表聲明鑒于產(chǎn)品本身的重要性和人類普遍缺乏的現(xiàn)狀，需要在世界范圍推廣ω-3系列不飽和脂肪酸。由于海狗與人類同屬哺乳動(dòng)物，海狗提供的ω-3與人體的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)相同，可以直接為人體吸收和利用，而魚類是低級的冷血?jiǎng)游铮商峁┑摩?3必須經(jīng)過肝臟轉(zhuǎn)化后方可為人體吸收與利用。脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過多的病變。脂肪性肝病正嚴(yán)重威脅國人的健康，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，已被公認(rèn)為隱蔽性肝硬化的常見原因。脂肪肝是一種常見的臨床現(xiàn)象，而非一種獨(dú)立的疾病。脂肪肝如果不及時(shí)治療，很有可能引起脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。目前脂肪肝的檢測手段眾多，但能夠準(zhǔn)確判斷脂肪肝程度及逆轉(zhuǎn)變化的，是“肝/脾CT值”，屬于“上腹部常規(guī)CT平掃”中的一項(xiàng)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示0. 7〈肝/脾CT值< I則為輕度脂肪肝，O. 5〈肝/脾CT值< O. 7為中度脂肪肝，肝/脾CT值< O. 5為重度脂肪肝肝/脾，CT值是目前最為準(zhǔn)確檢測脂肪肝的科學(xué)方法。2006年4月12日授權(quán)公開的申請?zhí)枮椤?1135517. 4”的中國發(fā)明專利申請公開了海狗油作為制備治療脂肪肝藥的應(yīng)用，但是該海狗油所需要的劑量大，對于患者來說該藥物過于昂貴。因此，盡快地開發(fā)出對于患者來說相對經(jīng)濟(jì)的具有有效地治療脂肪肝，尤其是非酒精性脂肪肝，特別是重度非酒精性脂肪肝的藥物是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種較低ω-3不飽和脂肪酸含量的精制海狗油，其可以以較低的劑量有效地治療非酒精性脂肪肝，尤其是重度非酒精性脂肪肝。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種精制海狗油，其特征在于該精制海狗油中ω-3多不飽和脂肪酸的重量百分比含量分別為二十碳五烯酸(C2tlH3tlO2, ΕΡΑ) 4. 64%_5· 03% ；二十二碳五烯酸(C22H34O2, DPA) 3. 86%-4. 18% ；二十二碳六烯酸(C22H32O2, DHA) 9. 5%-10. 29% 進(jìn)一步地，本發(fā)明也提供了該精制海狗油在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的 應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明該精制海狗油在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用中所述的非酒精性脂肪肝是輕度、中度或重度非酒精性脂肪肝，其中O. 7〈肝/脾CT值< I為輕度非酒精性脂肪肝，O. 5〈肝/脾CT值< O. 7為中度非酒精性脂肪肝，肝/脾CT值< O. 5為重度非酒精性脂肪肝。進(jìn)一步地，本發(fā)明該精制海狗油在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用中所述的精制海狗油的日服用劑量為33mg/kg-lllmg/kg。進(jìn)一步地，本發(fā)明該精制海狗油在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用中所述的精制海狗油的日服用劑量為O. 036ml/kg-0. 121ml/kg。本發(fā)明也提供了該精制海狗油在制備降低血清中總膽固醇或甘油三酯的藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，該精制海狗油在制備降低血清中總膽固醇或甘油三酯的藥物中的應(yīng)用中所述的精制海狗油的日服用劑量為33mg/kg-lllmg/kg。進(jìn)一步地，該精制海狗油在制備降低血清中總膽固醇或甘油三酯的藥物中的應(yīng)用中所述的精制海狗油的日服用劑量為O. 036ml/kg-0. 121ml/kg。本發(fā)明的精制海狗油以較低的ω-3多不飽和脂肪酸含量和較低的日服用劑量就可以達(dá)到治療非酒精性脂肪肝，尤其是重度非酒精性脂肪肝的效果，也可以有效地降低血清中總膽固醇和甘油三酯。對于企業(yè)來說對于原料的選擇范圍更廣，可以減少藥物的生產(chǎn)成本，降低藥物的價(jià)格，進(jìn)而減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明海狗油的制備方法參考本案申請人于2011年9月7日提交的申請?zhí)?01110263392. 7號(hào)專利申請，該專利申請公布日是2012年2月8日。當(dāng)然也可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的其它制備方法進(jìn)行本發(fā)明海狗油的制備。實(shí)施例I :精制海狗油的制備設(shè)備采用德國UIC公司制造的EA250/KD200單級短程分子蒸餾提取設(shè)備.I.制備流程如下I.將IOOkg海狗動(dòng)物脂肪切碎；2.將切碎的海狗動(dòng)物脂肪用40°C溫度的溫水清洗；3.將切碎的海狗動(dòng)物脂肪清洗后放入油水分離器中離心分離得到分離的水和脂肪原料；4.對步驟3中分離出的水進(jìn)行過濾得到水和離心分離遺漏的脂肪原料，將離心分離遺漏的脂肪原料加入脂肪原料中；
5.開啟分子蒸餾器，當(dāng)系統(tǒng)真空達(dá)到O. OOlmbar時(shí)，設(shè)定主加熱器溫度為310°C，設(shè)定進(jìn)料加熱器溫度為200°C，對脂肪原料進(jìn)行脫氣；6.主加熱器溫度達(dá)到200°C，開始進(jìn)料，進(jìn)料速度80L/h ;主加熱器溫度達(dá)到31 (TC，進(jìn)料速度 140L/h ；7.冷卻收集蒸餾出來的精制海狗油成品。II. 二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)含量檢測I.檢測原理對于實(shí)施例I所制得的精制海豹油中的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)含量測定，本公司采用HPLC外標(biāo)測定法將樣品中的不飽和脂肪酸進(jìn)行甲酯化，成為二十碳五烯酸甲酯(EPAM)、二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)和二十二 碳五烯酸甲酯(DPAM)，采用HPLC外標(biāo)測定法測定三種不飽和脂肪酸甲酯的含量，換算出相應(yīng)不飽和脂肪酸的含量。2.色譜條件儀器安捷倫公司出廠的高效液相色譜儀包括G1316A智能型柱溫箱、G1314F可變波長紫外檢測器、G1311C1260四元泵(含內(nèi)置脫氣機(jī))、G2170BA色譜工作站、G1329B全自動(dòng)進(jìn)樣器(600bar);優(yōu)譜超純水制備機(jī)。試劑2，6_ 二叔丁基對甲酚(BHT)、金屬鈉、冰醋酸、異丙醇，均為國產(chǎn)分析純；甲醇、乙腈，均為國產(chǎn)色譜純。EPA甲酯(EPAM)標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/ml)、DHA甲酯(DHAM)標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/ml)、DPA甲酯(DPAM)標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/ml),均為Sigma公司旗下Supelco公司產(chǎn)品。樣品實(shí)施例I所制得的精制海豹油。色譜柱LichrospherRP-18, 5um, |()θΑ，4mmX 250mm。流動(dòng)相乙腈甲醇水=7 :1 :2A 泵甲醇:水=1:2 (O. 3ml/min)B 泵乙腈(O. 7ml/min)等梯度洗脫流速I. Oml/min柱溫45°C檢測波長2IOnm進(jìn)樣量20ul理論塔板數(shù)按EPAM峰計(jì)算應(yīng)不低于5000分離度三個(gè)主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于I. O分析時(shí)間45min3.檢測方法具體如下3. I樣品衍生化取樣品精制海豹油約100mg(120ul)，精密稱定，置IOOml棕色容量瓶中，加入新制的O. 5mol/l甲醇鈉4ml，置于恒溫振蕩搖床30°C 120r/min不斷振搖，反應(yīng)約30分鐘后，查看是否還有油滴，若仍存在，繼續(xù)振搖，以小油滴沒有為準(zhǔn)。向其中加入O. 2ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含O. 005%BHT的甲醇定容。4°C放置不得超過24小時(shí)。3. 2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密量取EPAM標(biāo)準(zhǔn)液O. Iml，DHAM標(biāo)準(zhǔn)液O. lml.DPAM標(biāo)準(zhǔn)液O. 1ml,置于IOml棕色容量瓶中,異丙醇定容,作為混標(biāo)溶液。3. 3進(jìn)樣取步驟3. I制成的衍生化樣品，用O. 45um濾膜過濾，精密量取20ul進(jìn)樣，記錄色譜圖；另取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同法測定。EPAM、DHAM、DPAM三種甲酯的相對保留時(shí)間分別在 21min、28min、38min 左右。4.結(jié)果計(jì)算按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。準(zhǔn)確稱取實(shí)施例I所制得的精制海豹油3份，分別記錄稱取質(zhì)量m(每份約lOOmg)，按照上述方法進(jìn)行操作，外標(biāo)法以峰面積測定三種脂肪酸甲酯的含量，計(jì)算公式如下 海豹油中EPAM峰面積一
EPAM= - X標(biāo)準(zhǔn)品EPAM含量
標(biāo)準(zhǔn)品中EPAM峰面積上述公式對DHAM、DPAM亦適用。對計(jì)算出的甲酯含量，尚需進(jìn)行以下折算
EPA 分子量(302.450)
EPA # = - XEPAM 含景 =0.95567 X EPAM 含暈
EPAM 分子量(316.478)
DHA 分子量(328.487)
DHA #Ht= - X DHAM 含量=0.95904 X DHAM 含量
DHAM 分子量(342.515)
DPA 分子量(330.530)
DPA 含暈 =-X DPAM 含量 =0.95936 X DPAM 含量
DPAM 分子量(344.531)III.碘值I.試驗(yàn)方法依據(jù)GB/T5532-2008中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)植物油脂碘值的測定》。2.試驗(yàn)方法取實(shí)施例所制得的精制海豹油I. Og，置500ml干燥碘瓶中，加入環(huán)己烷和冰乙酸等體積混合液20ml，溶解后，精密加入韋氏(Wijs)試劑25ml，密塞搖勻，在暗處放置I個(gè)小時(shí)，加入碘化鉀溶液20ml與水150ml，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液(O. lmol/L)滴定剩余的碘，滴定時(shí)充分振搖，待混合液的棕色變?yōu)榈S色時(shí)，加淀粉指示液1ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。以消耗硫代硫酸鈉滴定液(O. lmol/L)的體積(Hil)SV2，空白試驗(yàn)消耗的體積(ml)為V1,樣品重量(g)為M,硫代硫酸鈉滴定液(0. lmol/L)的濃度為c (mol/
1)，照下式計(jì)算樣品精制海豹油的碘值
(V1-V2)Xc
樣品碘值(g/100g) = ---- X 12.69
M3.測定結(jié)果的取值碘值(g/lOOg)結(jié)果取值到
~<20O
20-6005
~> 60 4.相關(guān)試劑要求4. I碘化鉀溶液(KI) :100g/L，不含碘酸鹽或游離碘。4. 2淀粉溶液將5g可溶性淀粉在30ml水中混合，加入IOOOml沸水，并煮沸3分
鐘，然后冷卻。 4. 3硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c (Na2S2O3 · 5H20) =0. lmol/L,標(biāo)定后7天內(nèi)使用。4. 4環(huán)己烷和冰乙酸等體積混合液。4. 5韋氏(Wijs)試劑稱取一氯化碘25g溶于1500ml冰乙酸中。配制韋氏(Wijs)試劑的冰乙酸應(yīng)不得含有還原物質(zhì)，且該試劑還應(yīng)做空白樣的對照測定。鑒定冰乙酸是否含有還原物質(zhì)的方法取冰乙酸2ml，加IOml蒸餾水稀釋，加入lmol/L高錳酸鉀O. 1ml，所呈現(xiàn)的顏色應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)保持不變。若紅色褪去，說明有還原物質(zhì)存在?？刹捎檬惺垌f氏(Wijs)試劑。IV.酸值I.試驗(yàn)方法依據(jù)GB/T5530-2005中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測定》中熱乙醇測定法。2.試驗(yàn)方法稱取5. Og實(shí)施例I所制得的精制海豹油試樣M(試樣稱重的精確度0. 02g)，裝入錐形瓶中。將含有O. 5ml酚酞指示劑(10g/L，IOg的酚酞溶解于IL的95%乙醇溶液中)的50ml乙醇溶液置入錐形瓶中，加熱至沸騰，當(dāng)乙醇的溫度高于70°C時(shí)，用0. lmol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液滴定至溶液變色，并保持溶液15s不褪色，即為終點(diǎn)。將中和后乙醇轉(zhuǎn)移至裝有測試樣品的錐形瓶中，充分混合，煮沸。用氫氧化鈉或氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定過程要不斷振搖，至溶液顏色發(fā)生變化，并且保持15s不褪色，即為滴定終點(diǎn)。3.結(jié)果計(jì)算酸值(S) (mg/g)按下式計(jì)算
56.1 XVXCS=-
M式中V :所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml ；C :所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度，mol/L ；M :試樣的質(zhì)量，go
V .過氧化值I.試驗(yàn)方法依據(jù)GB/T5538-2005中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)植物油脂過氧化值測定》。2.試驗(yàn)方法用純凈干燥的二氧化碳或氮?dú)鉀_洗碘量瓶，精密稱取實(shí)施例I所制得的海豹油樣品(M)5. Og(稱量精確度±0. Olg),置于上述碘量瓶中，加入50ml乙酸-異辛烷溶液，蓋上塞子搖動(dòng)至樣品溶解。加入O. 5ml飽和碘化鉀溶液，蓋上塞子使其反應(yīng)，時(shí)間為lmin±ls，在此期間搖動(dòng)碘量瓶至少3次，然后立即加入30ml蒸餾水。用硫代硫酸鈉溶液(C: O. Olmol/L)滴定上述溶液，直到黃色幾乎消失，添加約O. 5ml淀粉溶液，繼續(xù)滴定，至藍(lán)色消失，即為終點(diǎn)。記錄消耗的硫代硫酸鈉溶液體積V2。同時(shí)做空白對照，記錄消耗的硫代硫酸鈉溶液體積VI。當(dāng)空白實(shí)驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉溶液(O. 01mol/L)超過O. 1ml，應(yīng)更換硫代硫酸鈉溶液(O.Olmol/L)，重新對樣品進(jìn)行測定。3.結(jié)果計(jì)算過氧化值P按下式計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種精制海狗油，其特征在于該精制海狗油中《_3多不飽和脂肪酸的重量百分比含量分別為 二十碳五烯酸4. 64%-5. 03% ； 二十二碳五烯酸3. 86%-4. 18% ； 二十二碳六烯酸9. 5%-10. 29%。
2.權(quán)利要求I所述的精制海狗油在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非酒精性脂肪肝是輕度、中度或重度非酒精性脂肪肝，其中0. 7〈肝/脾CT值< I為輕度非酒精性脂肪肝，0. 5〈肝/脾CT值(0. 7為中度非酒精性脂肪肝，肝/脾CT值< 0. 5為重度非酒精性脂肪肝。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的精制海狗油的日服用劑量為33mg/kg-lllmg/kg。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的精制海狗油的日服用劑量為 0. 036ml/kg-0. 121ml/kg。
6.權(quán)利要求I所述的精制海狗油在制備降低血清中總膽固醇或甘油三酯的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的精制海狗油的日服用劑量為33mg/kg-lllmg/kgo
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的精制海狗油的日服用劑量為0.036ml/kg-0. 121ml/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種精制海狗油，其特征在于該精制海狗油中ω-3多不飽和脂肪酸的重量百分比含量分別為二十碳五烯酸(C20H30O2，EPA)4.64%-5.03%；二十二碳五烯酸(C22H34O2，DPA)3.86%-4.18%。二十二碳六烯酸(C22H32O2，DHA)9.5%-10.29%；本發(fā)明也公開了該精制海狗油在制備治療非酒精性脂肪肝的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的精制海狗油可以治療非酒精性脂肪肝，也可以有效地降低血清中總膽固醇和甘油三酯。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102755350SQ20121027046
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者侯國新, 茹玲玲 申請人:浙江金諾康生物制藥有限公司