專利名稱：山茱萸總苷的提取方法及其在制備耐缺氧藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于本發(fā)明屬于含有原料或其與不明結(jié)構(gòu)之反應(yīng)產(chǎn)物的醫(yī)用配制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到來源于植物的材料。
背景技術(shù)：
山茱萸為山茱萸科、山茱萸屬落葉小喬木山茱萸的干燥成熟果肉。又名山萸肉、棗皮等，味酸潘，性微溫，有溫補(bǔ)肝腎，固澀精氣之功，主治腰膝疼痛、眩暈、耳鳴、小便頻數(shù)、漏下不止等癥，是臨床常用中藥之一。 山茱萸主要化學(xué)成分主要為多糖、有機(jī)酸及酯類、環(huán)烯醚萜苷及苷元、鞣質(zhì)以及揮發(fā)性成分。其中環(huán)烯醚萜苷是山茱萸中的主要活性部位。目前已明確的環(huán)烯醚萜苷類成分包括莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、山茱萸苷、7-0-乙基莫諾苷、7-氧-丁基莫諾苷、7-脫氫馬錢苷、馬錢苷酸等。其中莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷含量最高，三者在山茱萸中的含量分別達(dá)到2.0%、0.6%和O. 1%，占到了山茱萸總環(huán)烯醚萜苷的85%以上。山茱萸總苷具有廣泛的生物活性包括保護(hù)神經(jīng)，影響腦內(nèi)多種細(xì)胞因子，抑制各種模型導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)元死亡，從而發(fā)揮對腦梗死和阿爾茨海默癥的治療作用。作用于心腦血管系統(tǒng)，抑制體內(nèi)外血栓形成，激活抗凝因子，拮抗多種方法誘導(dǎo)的血小板聚集增高，對冠脈結(jié)扎后的心肌缺血起到保護(hù)作用。治療糖尿病，對糖尿病血管并發(fā)癥、心臟并發(fā)癥和腎臟并發(fā)癥均有緩解作用，保護(hù)糖尿病引起的心臟、腎臟及血管組織細(xì)胞的損傷。酶解法在天然產(chǎn)物有效成分的提取中運(yùn)用日益廣泛。酶的催化反應(yīng)具有專一性、高效性、條件溫和等特點(diǎn)，生物酶解提取是通過酶的水解或降解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的成分充分溶解于溶劑中，從而增大提取率。近年來的許多成功實(shí)例，表明酶法提取條件溫和，提取物顯色穩(wěn)定性及重復(fù)性均較好，提取率高于傳統(tǒng)工藝。但尚未有采用此方法輔助山茱萸總苷提取的報(bào)道。缺氧是高原、航空、潛水等特殊環(huán)境最普遍的應(yīng)激因素，急性暴露于缺氧環(huán)境的人或動物將產(chǎn)生缺氧應(yīng)激反應(yīng)。要提高機(jī)體的耐缺氧能力，就要通過降低機(jī)體缺氧應(yīng)激強(qiáng)度，促進(jìn)耐缺氧適應(yīng)的建立，減弱缺氧對機(jī)體的損傷，使機(jī)體在缺氧環(huán)境中維持較正常的生理機(jī)能。山茱萸補(bǔ)益肝腎，澀精固脫。臨床中對眩暈耳鳴，腰膝酸痛，大汗虛脫，遺精遺尿等虛癥有顯著療效。迄今為止，尚未見山茱萸總苷用于防治心腦缺氧的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于提供山茱萸總苷的制備方法。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于為山茱萸總苷提供一種新用途。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是由下述步驟組成I、燙煮將山茱萸新鮮果實(shí)投入沸水中至浸沒，沸水煮10 15分鐘，撈出后冷卻片刻，用手?jǐn)D壓出果核，果肉40°C烘干，粉碎，過20目篩，得山茱萸藥材粉末。2、酶解提取取山茱萸藥材粉末，加2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶，山茱萸藥材粉末與苦杏仁酶的質(zhì)量比為I : O. 005 O. 015，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4 4. 5，恒溫40 50°C酶解3 5小時，加與水等質(zhì)量的乙醇，終止酶解，再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27 %，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為12 16倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I . 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物。3、純化山茱萸乙醇提取物以等質(zhì)量的水稀釋并混勻，通過大孔樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗脫，至洗脫液無色，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48 % 55%乙醇水溶液洗脫，洗脫體積8 9倍柱體積，上樣量40 50mg/g，合并洗脫液，減壓濃縮至無醇味，在烘箱中50°C干燥，粉碎，過20目篩，得山茱萸總苷，在山茱萸總苷中，莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷總含量不低于70%。在本發(fā)明的酶解提取步驟2中，取山茱萸藥材粉末，加2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶，山茱萸藥材粉末與苦杏仁酶的質(zhì)量比為I : O. 01，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5，恒溫50°C酶解4小時，加與水等質(zhì)量的乙醇，終止酶解，再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為8 10倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27%的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I. 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物。有效成分山茱萸總苷在制備耐缺氧藥物中的用途。有效成分山茱萸總苷制備耐缺氧藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的常規(guī)藥用制劑含作為活性成分的山茱萸總苷，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于胃腸內(nèi)給藥的有機(jī)或無機(jī)的固體或液體賦形劑混合。該藥用制劑可以是固體形式如片齊IJ、顆粒劑、膠囊劑；也可以是液體形式如懸浮劑、糖漿劑、乳劑等。上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤濕劑、增溶劑和其它常用的添加劑，如乳糖、滑石粉、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、果膠、吐溫-80、聚乙烯醇等。上述制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。本發(fā)明的活性成分山茱萸總苷制成各種劑型的口服藥物，成人口服，常用劑量每日180mg，飯后服用，兒童用藥酌情減量。山茱萸總苷的適應(yīng)癥治療處于缺氧環(huán)境或心腦供血不足所導(dǎo)致的缺氧癥狀，如頭暈、頭痛、耳鳴、眼花、四肢軟弱無力；或者惡心、嘔吐、心慌、氣短、呼吸急促、心跳快速無
力，缺氧等癥。將上述提取物山茱萸總苷按常規(guī)方法制成的口服藥劑是制劑學(xué)上所述的片劑或顆粒劑或膠囊劑或口服液。本發(fā)明將酶解法應(yīng)用于山茱萸總苷的提取過程，苦杏仁酶對山茱萸藥材粉進(jìn)行酶解，山茱萸醇提物中有效成分溶出量增加了 20% ;采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，分別對山茱萸總苷的提取和純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了山茱萸總苷的提取純化最優(yōu)工藝參數(shù)，所制得的山茱萸總苷中有效成分(莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷)含量達(dá)到70%，回收率達(dá)到80%，制備效率高，原料利用率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
采用本發(fā)明方法提取的山茱萸總苷經(jīng)藥效試驗(yàn)證明其能提高小鼠的耐心腦缺氧能力，增強(qiáng)體力，提高機(jī)體抗疲勞，促進(jìn)耐缺氧適應(yīng)的建立。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對 本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I以山茱萸新鮮果實(shí)的提取物山茱萸干燥藥材粉末IOOg為例，所用的原料及其提取方法如下I、燙煮將山茱萸新鮮果實(shí)投入沸水中至浸沒，沸水煮10 15分鐘，撈出后冷卻片刻，用手?jǐn)D壓出果核，果肉40°C烘干，粉碎，過20目篩，得山茱萸藥材粉末。2、酶解提取取山茱萸藥材粉末100g，加2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶lg，苦杏仁酶的型號為M0034-1，苦杏仁酶為市場銷售的商品，由上?？婆d商貿(mào)有限公司銷售，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5，恒溫50°C酶解4小時，加與水等質(zhì)量的乙醇，終止酶解，再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為12 16倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I. 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物。3、純化山茱萸乙醇提取物以等質(zhì)量的水稀釋，通過大孔樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗脫，至洗脫液無色，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48 % 55 %乙醇水溶液洗脫，洗脫體積8 9倍柱體積，上樣量40 50mg/g，合并洗脫液，減壓濃縮至無醇味，在烘箱中50°C干燥，粉碎，過20目篩，得山茱萸總苷，在山茱萸總苷中，莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷總含量不低于70%。實(shí)施例2以山茱萸新鮮果實(shí)的提取物山茱萸干燥藥材粉末IOOg為例，所用的原料及其提取方法如下在酶解提取步驟2中，取山茱萸藥材粉末100g，W 2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶O. 5g，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4，恒溫45°C酶解6小時，加與水等質(zhì)量的乙醇，終止酶解，再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為12 16倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27 %的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I. 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物。其他步驟與實(shí)施例I相同。提取出山茱萸總苷。實(shí)施例3以山茱萸新鮮果實(shí)的提取物山茱萸干燥藥材粉末IOOg為例，所用的原料及其提取方法如下在酶解提取步驟2中，取山茱萸藥材粉末IOOgjP 2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶I. 5g，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5，恒溫50C酶解4小時，加與水等質(zhì)量的乙醇，終止酶解，再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為12 16倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27 %的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I. 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物。其他步驟與實(shí)施例I相同。提取出山茱萸總苷。實(shí)施例4藥用制劑山茱萸總苷制備成片劑，以生產(chǎn)片劑產(chǎn)品1000片為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下
山茱萸總苷20g
糊精50g
硬脂酸鎂2g 淀粉加至300g其制備工藝按制劑學(xué)片劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每片重O. 3g，每片含山茱萸總苷20mg，日服三次，每次3片。實(shí)施例5藥用制劑山茱萸總苷制備成膠囊劑，以生產(chǎn)膠囊劑產(chǎn)品1000粒為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下山茱萸總苷20g硬脂酸鎂Ig淀粉加至300g其制備方法按制劑學(xué)膠囊劑的常規(guī)方法進(jìn)行，每粒重O. 3g，每粒含山茱萸總苷20mg，日服三次，每次3粒。實(shí)施例6藥用山茱萸總苷制備成顆粒劑，以生產(chǎn)顆粒劑產(chǎn)品IOOOg為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下
山茱萸總苷36g
蔗糖200g
淀粉400g
糊精加至IOOOg其制備方法按制劑學(xué)顆粒劑的常規(guī)方法進(jìn)行，每袋重5g，每克含山茱萸總苷18mg,日服兩次,每次I袋。實(shí)施例7藥用山茱萸總苷制備成口服液，以生產(chǎn)口服液產(chǎn)品IOOOmL為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下山茱萸總苷6g甜蜜素IOg
蒸餾水加至IOOOmL其制備方法按制劑學(xué)口服液的常規(guī)方法進(jìn)行，每瓶重10mL，lmL含山茱萸總苷6mg,日服三次,每次I瓶。
為了確定本發(fā)明的最佳原料配比和最佳工藝步驟，發(fā)明人進(jìn)行了大量的試驗(yàn)室研究試驗(yàn)，各種試驗(yàn)情況如下I、山茱萸藥材中莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷的定量分析含量測定方法色譜柱Welchrom_C18柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),柱溫35°C ;流動相甲醇(A)-O. I %磷酸水(B)，梯度洗脫(O 8分鐘，28 % A ;8 15分鐘，28 % A —35%A ; 15 20分鐘，28% A)，流速lmL/min ;檢測波長240nm ;進(jìn)樣量10 μ L。在上述色譜條件下，莫諾苷，馬錢苷與獐牙菜苷能夠與其他成分達(dá)到基線分離。方法學(xué)考察本方法莫諾苷的線性范圍10. O 600. O、檢測限O. 21 μ g/ml，定量限O. 67 μ g/ml，相關(guān)系數(shù)O. 9996 ;馬錢苷的線性范圍7. 2 432. O,檢測限O. 18 μ g/ml，定量限O. 58 μ g/ml，相關(guān)系數(shù)O. 9998 ;獐牙菜苷的線性范圍3. I 186. 0，檢測限O. 16 μ g/ml，定量限O. 50 μ g/ml，相關(guān)系數(shù)O. 9999 ;本測定方法的日內(nèi)及日間精密度、重現(xiàn)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD < I. 2% ;穩(wěn)定性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD < 2. 2% ;加樣回收率在95% 105%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD < 2. O %。2、不同前處理方法對山茱萸提取物中環(huán)烯醚萜苷含量的影響水煮法取20g山茱萸新鮮果實(shí)投入沸水中，分別煮沸1、5、10、20分鐘，撈出后冷卻，用手?jǐn)D壓出果核，再將果肉40°C烘干,取干燥果肉IOOmg,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %的乙醇水溶液25mL進(jìn)行超聲提取，提取液通過高效液相色譜進(jìn)行含量測定。常壓水蒸法取20g山茱萸新鮮果實(shí)放入蒸籠中，分別待上汽后蒸1、5、10、20分鐘，取出后冷卻，用手?jǐn)D壓出果核，再將果肉40°C烘干，以25%乙醇25mL進(jìn)行超聲提取，提取液通過高效液相色譜進(jìn)行含量測定。微波法取20g山茱萸新鮮果實(shí)，分別微波加熱20、30、40、50、60秒，取出后冷卻，用手?jǐn)D壓出果核，再將果肉40°C烘干，以25%乙醇25mL進(jìn)行超聲提取，提取液通過高效液相色譜進(jìn)行含量測定。未經(jīng)處理的山茱萸新鮮果實(shí)，直接用手去除核，再將果肉40°C烘干，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的乙醇水溶液25mL進(jìn)行超聲提取，提取液通過高效液相色譜進(jìn)行含量測定。作為陰性對照。試驗(yàn)結(jié)果見表I。表I不同前處理方法對山茱萸提取物中3種環(huán)烯醚萜苷含量的影響
化有效成分含量陰性對照水煮法常壓水蒸法微波法
莫諾苷(mg/g)16.0424.4021. 1518. 75
馬錢苷(mg/g)8TT210. 139 859 27
獐牙菜苷(mg/g) Οδ051Λ75798
由表I可見，最佳前處理?xiàng)l件是將山茱萸新鮮果實(shí)20g投入沸水中，燙煮10分鐘后撈出，冷卻片刻去除果核，40°C烘干至恒重。3、酶的種類對山茱萸提取物中環(huán)烯醚萜苷含量的影響取山茱萸藥材IOOg共5份，分別加入300ml水溶脹，其中4份各加入蝸牛酶、果膠酶、纖維素酶、苦杏仁酶各lg，另一份作為陰性對照。用冰乙酸調(diào)PH值為4.5，恒溫50°C，酶解4小時，加乙醇300mL終止酶解。加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取40分鐘。提取液以高效液相色譜進(jìn)行含量測定。試驗(yàn)結(jié)果見表2。表2酶的種類對山茱萸提取物中3種環(huán)烯醚萜苷含量的影響
權(quán)利要求
1.一種山茱萸總苷的提取方法，其特征在于它是由下述步驟組成 (1)燙煮 將山茱萸新鮮果實(shí)投入沸水中至浸沒，沸水煮10 15分鐘，撈出后冷卻片刻，用手?jǐn)D壓出果核，果肉40°C烘干，粉碎，過20目篩，得山茱萸藥材粉末； (2)酶解提取 取山茱萸藥材粉末，加2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶，山茱萸藥材粉末與苦杏仁酶的質(zhì)量比為I : O. 005 O. 015，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4 4. 5，恒溫40 50°C酶解3 5小時,加與水等質(zhì)量的乙醇,終止酶解。再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為12 16倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I. 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物； (3)純化 山茱萸乙醇提取物以等質(zhì)量的水稀釋并混勻，通過大孔樹脂柱進(jìn)行純化，用去離子水洗脫，至洗脫液無色，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48 % 55%乙醇水溶液洗脫，洗脫體積8 9倍柱體積，上樣量40 50mg/g，合并洗脫液，減壓濃縮至無醇味，在烘箱中50°C干燥，粉碎，過20目篩，得山茱萸總苷，在山茱萸總苷中，莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷總含量不低于70%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的山茱萸總苷的提取方法，其特征在于在酶解提取步驟(2)中，取山茱萸藥材粉末，加2 4倍水溶脹，再加入苦杏仁酶，山茱萸藥材粉末與苦杏仁酶的質(zhì)量比為I : O. 01，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5，恒溫50°C酶解4小時，加與水等質(zhì)量的乙醇，終止酶解，再加水至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% 27%，用頻率為25kHz、功率為300W的超聲波提取30 40分鐘，傾出上清液；山茱萸藥材粉末渣再以液料比為8 10倍、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 % 27 %的乙醇水溶液提取一次，減壓抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對密度為I. 20的浸膏，得山茱萸乙醇提取物。
3.有效成分山茱萸總苷在制備耐缺氧藥物中的用途。
全文摘要
一種山茱萸總苷的提取方法，它是由燙煮、酶解提取、純化步驟組成，所提取的有效成分山茱萸總苷在制備耐缺氧藥物中的用途。采用本發(fā)明方法提取的山茱萸總苷經(jīng)藥效試驗(yàn)證明其能提高小鼠的耐心腦缺氧能力，增強(qiáng)體力，提高機(jī)體抗疲勞，促進(jìn)耐缺氧適應(yīng)的建立。
文檔編號A61P39/00GK102614243SQ20121012634
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者余靜潔, 孫文基, 朱砂, 梁晉如 申請人:西北大學(xué)