專利名稱：：蛋白質(zhì)樣品的比較的制作方法蛋白質(zhì)樣品的比較相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)主張于2010年6月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/355，269的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其全部通過(guò)引用并入本文中。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及使用具有帶穩(wěn)定同位素標(biāo)簽參考標(biāo)準(zhǔn)(StableIsotope-TaggedReferenceStandard,SITRS)的自下而上液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)來(lái)比較兩種或兩種以上蛋白質(zhì)樣品的分析方法。在蛋白質(zhì)分析中使用具有質(zhì)譜法(MS)檢測(cè)的肽作圖以確認(rèn)ー級(jí)序列。已知的分析方法主要定性確認(rèn)預(yù)期肽的存在情況。發(fā)明簡(jiǎn)述在ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及表征蛋白質(zhì)樣品的方法，所述方法包括(i)提供具有已知氨基酸序列的第一蛋白質(zhì)樣品，其中該第一蛋白質(zhì)中的至少ー個(gè)氨基酸被同位素標(biāo)記的氨基酸取代；(ii)提供未標(biāo)記的第二蛋白質(zhì)樣品，其包含對(duì)應(yīng)于第一蛋白質(zhì)中同位素標(biāo)記變體的未標(biāo)記的氨基酸；(iii)將第一樣品與第二樣品混合以形成混合物；(iv)對(duì)該混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)消化以形成第一消化物；(V)對(duì)該第一消化物進(jìn)行自下而上液相色譜-質(zhì)譜，以形成包括一個(gè)或多個(gè)雙峰或單峰的第一波譜，每一雙峰表明存在來(lái)自第一樣品的同位素標(biāo)記的肽和來(lái)自第ニ樣品的相應(yīng)的未標(biāo)記的肽，每ー單峰表明存在具有突變、修飾或雜質(zhì)的肽。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)ー步包括(Vi)比較雙峰中的峰的相對(duì)強(qiáng)度以測(cè)定各肽的相對(duì)量的步驟，其中1:1峰比率表明第一和第二肽基本上相同，并且其中峰強(qiáng)度的差異反映存在化學(xué)上不同的肽。在另ー實(shí)施方案中，該方法進(jìn)ー步包括基于峰強(qiáng)度的相對(duì)降低來(lái)定量該化學(xué)上不同的肽的量的步驟。在另ー實(shí)施方案中，該方法進(jìn)ー步包括(Vii)對(duì)消化物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜以測(cè)定由波譜中的單峰代表的肽序列的步驟。在另一方面，本發(fā)明為定性檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品中的突變、修飾或雜質(zhì)存在情況的方法。該方法允許通過(guò)將兩種或兩種以上蛋白質(zhì)樣品中的各樣品與穩(wěn)定同位素標(biāo)簽參考標(biāo)準(zhǔn)(SITRS)蛋白質(zhì)比較來(lái)相互比較這些樣品。該方法包括提供第一蛋白質(zhì)的樣品，其中在具有已知氨基酸序列的第一蛋白質(zhì)(SITRS)中的至少ー個(gè)氨基酸被同位素標(biāo)記的氨基酸取代；提供未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品，其包括對(duì)應(yīng)于第一蛋白質(zhì)中的同位素標(biāo)記氨基酸的未標(biāo)記的氨基酸；將第一蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合以形成混合物；對(duì)該混合物進(jìn)行消化，隨后通過(guò)自下而上液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行分析，以確定波譜是否包括表明各蛋白質(zhì)中存在該特定肽的雙峰。若未觀察到雙峰，則單峰可能對(duì)應(yīng)于因以下可能性之一而產(chǎn)生的肽(I)該肽不含標(biāo)記的氨基酸；(2)該肽含有修飾；(3)該肽含有突變、插入或缺失；(4)該肽對(duì)應(yīng)于雜質(zhì)，且不含蛋白質(zhì)樣品中存在的氨基酸序列。然后可通過(guò)MS/MS分析單峰來(lái)掲示肽的序列，并確定存在以上所列四種可能性中的哪種。在另一方面，本發(fā)明為定量測(cè)定蛋白質(zhì)樣品中突變或修飾的存在情況的方法。該方法包括提供具有已知氨基酸序列的第一蛋白(SITRS)的樣品，其中在該第一蛋白質(zhì)中的至少ー個(gè)氨基酸被同位素標(biāo)記的氨基酸取代；提供未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品的樣品，其包括對(duì)應(yīng)于第一蛋白質(zhì)中的同位素標(biāo)記氨基酸的未標(biāo)記的氨基酸；將第一蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品混合以形成混合物；對(duì)該混合物進(jìn)行消化，隨后通過(guò)自下而上液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行分析，以確定波譜是否包括表明SITRS和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品中都存在該特定肽的雙峰；并比較雙峰中峰的強(qiáng)度以測(cè)定各蛋白質(zhì)中該特定肽的相對(duì)豐度?？赏ㄟ^(guò)首先與如上文所述相同的SITRS抗體比較，然后比較各未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品的結(jié)果，來(lái)相互比較另外的未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在查閱說(shuō)明書(shū)后將會(huì)理解并明了本發(fā)明的這些和其它方面。附圖簡(jiǎn)述圖1為按照本發(fā)明的SITRS實(shí)驗(yàn)的示意圖。圖2為按照本發(fā)明在存在其SITRS對(duì)應(yīng)物時(shí)通過(guò)胰蛋白酶消化所產(chǎn)生的MAb-1肽的代表性質(zhì)譜。圖3為按照本發(fā)明的SITRS實(shí)驗(yàn)的提取離子質(zhì)譜(extractedionmassspectra),其中將wtmAb_l與摻加突變型達(dá)20%的mAb_l進(jìn)行比較(顯示在wt與突變型mAb中都存在的wtHC(255-273)月太)。圖4為按照本發(fā)明的來(lái)自圖3的HC(255-273)的單同位素峰強(qiáng)度的表格。圖5為按照本發(fā)明的SITRS實(shí)驗(yàn)的提取離子質(zhì)譜，其中將wtmAb-1與摻加突變型達(dá)20%的mAb-1進(jìn)行比較(顯示突變型mAb中經(jīng)修飾的wtHC(218-247)肽)。圖6為按照本發(fā)明的來(lái)自圖5的HC(218-247)的單同位素峰強(qiáng)度的表格。圖7為按照本發(fā)明的SITRS實(shí)驗(yàn)的提取離子質(zhì)譜，其中將wtmAb-1與摻加突變型達(dá)20%的mAb-1進(jìn)行比較(顯示僅存在于突變型mAb中且不存在于SITRS樣品中的突變型HC(218-247)月太)。圖8為按照本發(fā)明的LC色譜圖，其顯示利用尺寸排阻色譜-高效液相色譜(SEC-HPLC)進(jìn)行抗體去鹽。圖9為來(lái)自⑷純的未標(biāo)記的MAb-1及⑶污染有10%MAb-2的MAb-1的肽的質(zhì)譜比較。讓SITRS以1:1比率與每ー種混合，隨后按照本發(fā)明進(jìn)行胰蛋白酶消化及分析。圖10為按照本發(fā)明的圖示，其描繪污染有10%MAb-2的MAb-1樣品的定量中所研究的6種肽的SITRS值。圖11為按照本發(fā)明的來(lái)源于人胚腎293細(xì)胞與中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞的MAb-1肽的SV比較。圖12為按照本發(fā)明的SITRS實(shí)驗(yàn)的SITRS柱狀圖，其中將wtmAb-1與摻加突變型達(dá)20%的mAb-1進(jìn)行比較。圖13為按照本發(fā)明的SITRS實(shí)驗(yàn)的SITRS柱狀圖，其中將wtmAb-1與摻加突變型達(dá)2.5%的mAb-1進(jìn)行比較。圖14為按照本發(fā)明的摻加突變型的抗體相對(duì)于野生型抗體中肽HC(218-247)、HC(344-359)及HC(288-300)的量的圖，其如通過(guò)各種摻加突變型的mAb_l樣品的SITRS分析所測(cè)量。圖15為按照本發(fā)明的用于比較通過(guò)使用兩種不同方法由兩種不同細(xì)胞系產(chǎn)生的(CH0產(chǎn)生的(圖15A)及HEK產(chǎn)生的(圖15B))各批MAb-1樣品的SITRS柱狀圖。圖16為按照本發(fā)明的用常規(guī)分析呈現(xiàn)于圖15B中的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽參考標(biāo)準(zhǔn)(SITRS)結(jié)果的表格。將來(lái)自第2批(CHO產(chǎn)生的)及第3批(HEK產(chǎn)生的)mAb_l的SITRS分析(n=6)的所選結(jié)果與通過(guò)常規(guī)方法(n=3)所獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。圖17為按照本發(fā)明的在兩種不同配制緩沖液(formulationbuffer)中受到適度壓カ的mAb-1樣品的比較的SITRS柱狀圖。圖18為按照本發(fā)明的DTPA-MAb-1綴合物與未經(jīng)修飾MAb-1的比較的SITRS柱狀圖。優(yōu)選實(shí)施方案詳述現(xiàn)將詳細(xì)地提及本發(fā)明的實(shí)施方案，其中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例如下文所示。通過(guò)解釋本發(fā)明而非限制本發(fā)明的方式提供每ー實(shí)施例。事實(shí)上，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可在不脫離本發(fā)明的范圍或精神下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改及改變。例如，作為ー個(gè)實(shí)施方案部分所闡明或闡述的特征可用于另ー實(shí)施方案，以得到又一個(gè)實(shí)施方案。因此，本發(fā)明意欲涵蓋這樣的修改和變化，其同樣落入隨附權(quán)利要求書(shū)及其等同物的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征及方面在以下詳述中公開(kāi)或根據(jù)以下詳述而明了。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的討論僅為說(shuō)明例示性實(shí)施方案，并非意欲限制本發(fā)明的更廣泛的方面。本文所用術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”或“多肽”指10個(gè)或更多個(gè)氨基酸(例如50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、500個(gè)或更多個(gè)氨基酸)的聚合物。本發(fā)明的例示性蛋白質(zhì)包括但不限于重組蛋白質(zhì)、生物治療蛋白質(zhì)、單克隆抗體和其它抗體、抗體-藥物綴合物或其它生物綴合物、成像抗體、融合蛋白或聚こニ醇化蛋白(PEGylatedproteins)。本文所用術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指在ー個(gè)特定位點(diǎn)(抗原位點(diǎn))與特定靶分子(抗原)結(jié)合的ー類抗體蛋白。由本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的測(cè)量不僅考慮在蛋白水解消化期間所產(chǎn)生的肽的質(zhì)量，而且亦考慮每種所得肽的豐度。通過(guò)利用在蛋白質(zhì)消化前與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)混合的SITRS樣品使得能夠經(jīng)MS對(duì)肽的豐度進(jìn)行測(cè)量。本文所用術(shù)語(yǔ)“SITRS樣品”或“SITRS標(biāo)準(zhǔn)品”，意為用存在于蛋白質(zhì)中的至少ー個(gè)氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記變體來(lái)標(biāo)記的已知序列的蛋白質(zhì)(例如抗體)。因此，在ー個(gè)方面，本發(fā)明為比較兩種蛋白質(zhì)(例如抗體)樣品以定性和/或定量鑒別這些樣品中的差異(例如突變、修飾或雜質(zhì))的方法。所述測(cè)量可通過(guò)利用在蛋白質(zhì)消化和LC-MS前與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)(例如未標(biāo)記的抗體)混合的SITRS樣品來(lái)進(jìn)行。引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的變體作為內(nèi)標(biāo)減少由可能會(huì)影響定量的樣品處理和MS檢測(cè)所導(dǎo)致的變化及假象。本發(fā)明減少的潛在變化的實(shí)例包括蛋白質(zhì)消化程度、由于樣品處理引起的假象形成和/或MS檢測(cè)期間電離效率的變化。通過(guò)利用本方法，所述參數(shù)可相對(duì)于SITRS樣品標(biāo)準(zhǔn)化。在ー個(gè)方面，本方法包括制備標(biāo)記的蛋白質(zhì)(SITRS樣品)和將該標(biāo)記的蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品混合。然后可對(duì)混合的樣品進(jìn)行自下而上LC-MS，以定性和/或定量測(cè)定未標(biāo)記的樣品中的低水平突變、修飾或雜質(zhì)。亦可將該分析用于確定表達(dá)細(xì)胞系的選擇不當(dāng)、生長(zhǎng)培養(yǎng)基的效率低下、細(xì)胞培養(yǎng)條件的效率低下、純化過(guò)程的效率低下或配制緩沖液的不適當(dāng)。在ー個(gè)例示性實(shí)施方案中，未標(biāo)記的抗體在實(shí)驗(yàn)性生長(zhǎng)培養(yǎng)基中形成，或由實(shí)驗(yàn)性細(xì)胞系/克隆產(chǎn)生，將所得未標(biāo)記的抗體與SITRS樣品混合，然后對(duì)混合的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)消化及自下而上LC-MS，其可用于確定該實(shí)驗(yàn)性生長(zhǎng)培養(yǎng)基細(xì)胞系/克隆是否可接受用于產(chǎn)生所需抗體。在標(biāo)準(zhǔn)反相-高效液相色譜(RP-HPLC)條件下，標(biāo)記的和未標(biāo)記的肽具有幾乎相同的保留時(shí)間并因此一起遷移。雖然不可通過(guò)色譜將其分離，但可通過(guò)MS檢測(cè)來(lái)區(qū)分標(biāo)記的和未標(biāo)記的肽，產(chǎn)生相當(dāng)于特定肽中標(biāo)記的殘基數(shù)目的道爾頓(Da)差異。因此，當(dāng)SITRS樣品與未標(biāo)記的抗體或其它蛋白質(zhì)混合時(shí)，表明Da差異的雙峰將出現(xiàn)在質(zhì)譜中，這表明標(biāo)記的氨基酸摻入到SITRS樣品中，以及在SITRS樣品和未標(biāo)記的抗體二者中都存在具有相同氨基酸序列的肽。與其未標(biāo)記的對(duì)應(yīng)物(在1:1混合物中)的唯一差異為存在標(biāo)記的氨基酸的SITRS樣品，將產(chǎn)生其中各峰具有相同強(qiáng)度的雙峰。可使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備SITRS樣品，其中使用重氨基酸代替標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。例如，當(dāng)制備包括精氨酸和賴氨酸殘基的蛋白質(zhì)時(shí)，生長(zhǎng)培養(yǎng)基可包括由6個(gè)13C原子而非天然豐富的12C原子構(gòu)成的精氨酸及賴氨酸殘基(精氨酸_6和賴氨酸-6)?？紤]本領(lǐng)域已知的重同位素標(biāo)記的變體可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)至IJ，重同位素標(biāo)記變體的選擇將視所形成的蛋白質(zhì)和對(duì)制備用于LC-MS檢測(cè)的蛋白質(zhì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)消化而定。例如，當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括精氨酸和/或賴氨酸并將經(jīng)受胰蛋白酶消化時(shí)，可能期需重精氨酸和/或賴氨酸。類似地，當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括天冬氨酸并將經(jīng)受內(nèi)切蛋白酶AspN消化時(shí)，可能期需重天冬氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括谷氨酸并將經(jīng)受內(nèi)切蛋白酶GluC消化時(shí)，可能期需重谷氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸鏈并將經(jīng)受腸激酶消化吋，可能期需重天冬氨酸和/或重賴氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括異亮氨酸-谷氨酸或天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸鏈并將經(jīng)受因子X(jué)a消化時(shí)，可能期需重異亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和/或精氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括精氨酸-X-X-精氨酸鏈并將經(jīng)受弗林蛋白酶消化時(shí)，可能期需重精氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括組氨酸-酪氨酸連接并將經(jīng)受麥芽糖酶(genease)I消化吋，可能期需重組氨酸及/或酪氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸并將經(jīng)受胰凝乳蛋白酶消化吋，可能期需具有芳香族側(cè)鏈的重氨基酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括賴氨酸并將經(jīng)受Lys-C或Lys-N消化時(shí)，可能期需重賴氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括甲硫氨酸并將經(jīng)受CNBr消化時(shí)，可能期需重甲硫氨酸。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括精氨酸并將經(jīng)受內(nèi)切蛋白酶ArgC消化時(shí)，可能期需重精氨酸。本發(fā)明并非意欲限于特定同位素標(biāo)記的變體或特定蛋白質(zhì)消化方法，并且同位素標(biāo)記的變體及方法可視蛋白質(zhì)而變化。本發(fā)明可進(jìn)ー步包括蛋白質(zhì)純化步驟?？紤]本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)純化方法可用于本發(fā)明并可被利用。蛋白質(zhì)純化步驟可在蛋白質(zhì)消化之前進(jìn)行，在一些實(shí)施方案中，可能期需在混合樣品之前進(jìn)行蛋白質(zhì)純化步驟。在其它實(shí)施方案中，可能期需在混合樣品之后但在蛋白質(zhì)消化之前進(jìn)行蛋白質(zhì)純化步驟。在一些實(shí)施方案中，可能需要在蛋白質(zhì)消化之前使混合樣品變性、還原和/或烷基化?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)實(shí)施變性、還原和烷基化步驟。例如，可使用透析、脫機(jī)(off-line)固相萃取(SPE)、在線SPE或液相色譜(LC)例如尺寸排阻色譜-高效液相色譜(SEC-HPLC)或反相-高效液相色譜(RP-HPLC))來(lái)實(shí)施變性步驟。在在線SPE或LC方法中，可控制流速，可監(jiān)測(cè)紫外(UV)信號(hào)，并且可定時(shí)進(jìn)行流分收集以僅收集經(jīng)純化的蛋白質(zhì)而非任何殘余緩沖液或來(lái)自生長(zhǎng)過(guò)程或樣品處理的其它污染物。圖1提供示意性SITRS分析。圖3和5顯示來(lái)自對(duì)兩種混合樣品的SITRS分析的質(zhì)譜，這些混合樣品包括未標(biāo)記的MAb及其相應(yīng)的SITRS標(biāo)準(zhǔn)品(無(wú)修飾或突變)。由此可見(jiàn)，以1:1比率混合SITRS標(biāo)準(zhǔn)品和未標(biāo)記的MAb，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)(胰蛋白酶)消化，然后進(jìn)行自下而上LC-MS。所得到的未標(biāo)記的樣品與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品所共有的肽質(zhì)譜的獨(dú)特之處在于質(zhì)荷比(m/z)峰表現(xiàn)為雙峰，這是由于SITRS標(biāo)準(zhǔn)品中存在標(biāo)記的氨基酸。因此，化學(xué)組成與其SITRS對(duì)應(yīng)物相同且以與其SITRS對(duì)應(yīng)物相同的量存在的肽，將具有等于標(biāo)準(zhǔn)品的強(qiáng)度(在1:1混合物中)的強(qiáng)度(見(jiàn)例如圖3)。其群體部分地由點(diǎn)突變型或位點(diǎn)特異性修飾分子例如脫酰胺化、N-末端焦谷氨酸化(N-terminalpyroglutamate)或差異糖基化構(gòu)成的肽將具有如下質(zhì)譜其中與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品相比，來(lái)自未標(biāo)記樣品的峰強(qiáng)度降低了反映化學(xué)上不同的肽的豐度的量，其可如圖5中所見(jiàn)。因此，通過(guò)將SITRS標(biāo)準(zhǔn)品與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)制品混合并對(duì)混合樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)消化及自下而上LC-MS，可鑒別及定量未標(biāo)記的蛋白質(zhì)制品中的突變、修飾和/或位點(diǎn)特異性修飾分子的存在?？衫蒙鲜霾呗员容^來(lái)自不同細(xì)胞系的抗體制品。例如，可采用本發(fā)明的方法，來(lái)定性鑒別實(shí)驗(yàn)性生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或由實(shí)驗(yàn)性克隆/細(xì)胞系產(chǎn)生的未標(biāo)記抗體中的突變和/或修飾的存在情況。在本實(shí)施方案中，將包括至少ー個(gè)同位素標(biāo)記氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品(“SITRS標(biāo)準(zhǔn)品”)與由實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系產(chǎn)生的未標(biāo)記的抗體混合。然后可對(duì)混合樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)消化及自下而上LC-MS，以確定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系是否可接受用于產(chǎn)生所需抗體。類似于上述實(shí)施方案，若未標(biāo)記的抗體和SITRS標(biāo)準(zhǔn)品的差異僅在于SITRS標(biāo)準(zhǔn)品中存在標(biāo)記的氨基酸，則兩種樣品將一起遷移通過(guò)MS，并且質(zhì)譜中的唯一顯著差異將以雙峰形式出現(xiàn)，這表明SITRS標(biāo)準(zhǔn)品中存在標(biāo)記的氨基酸。若未觀察到雙峰，則單峰可能對(duì)應(yīng)因以下可能性之一而產(chǎn)生的肽(I)該肽不含標(biāo)記的氨基酸；(2)該肽含有修飾；(3)該肽含有突變、插入或缺失；(4)該肽對(duì)應(yīng)于雜質(zhì)，且不含在抗體樣品中存在的氨基酸序列。然后可通過(guò)MS/MS分析單峰以掲示肽的序列，并確定存在這四種可能性中的哪ー種。例如，圖7顯示存在突變型肽，其不具有姐妹雙峰(sisterdoublet)。因此,可通過(guò)將SITRS標(biāo)準(zhǔn)品與未標(biāo)記的抗體混合,并對(duì)混合樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)消化及自下而上LC-MS，來(lái)鑒別未標(biāo)記的抗體中的突變、修飾和/或位點(diǎn)特異性修飾分子的存在情況。然后為了選擇最佳克隆，可利用上述相同策略來(lái)比較由不同細(xì)胞系所制備的若干未標(biāo)記的MAb。在本發(fā)明的另一方面，標(biāo)記的SITRS標(biāo)準(zhǔn)品使能夠通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)定量蛋白質(zhì)，其經(jīng)由比較各雙峰中各標(biāo)記的SITRS標(biāo)準(zhǔn)肽的m/z峰強(qiáng)度與其未標(biāo)記樣品的相應(yīng)未標(biāo)記肽的m/z峰強(qiáng)度。這進(jìn)而使得可比較幾乎涵蓋整個(gè)蛋白質(zhì)序列的所有肽。然后可利用上述策略對(duì)若干未標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行相互比較。在本發(fā)明的這一方面,制備未標(biāo)記的蛋白質(zhì)。另外，獲得對(duì)應(yīng)于未標(biāo)記的MAb的SITRS標(biāo)準(zhǔn)品。未標(biāo)記的蛋白質(zhì)和SITRS標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)基本上相同，并且若混合則應(yīng)在MS中顯示1:1雙峰，例如在圖1中所見(jiàn)。為定量未標(biāo)記的蛋白質(zhì)中任何突變或修飾的存在，將相應(yīng)的SITRS標(biāo)準(zhǔn)品與未標(biāo)記的樣品混合。然后可對(duì)相應(yīng)的SITRS標(biāo)準(zhǔn)品與未標(biāo)記的樣品的混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)消化和自下而上LC-MS。然后可分析所得波譜以確定雙峰的強(qiáng)度是否相同。另外，為驗(yàn)證未標(biāo)記的MAb與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品除了SITRS標(biāo)準(zhǔn)品中的同位素標(biāo)記變體以外都相同，可將未標(biāo)記的MAb與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品混合在一起，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)消化并進(jìn)行自下而上LC-MS。所得質(zhì)譜圖案應(yīng)產(chǎn)生如圖1中所見(jiàn)的基本上1:1的峰。然而，其群體部分地由點(diǎn)突變型或位點(diǎn)特異性修飾分子(例如脫酰胺化、N-末端焦谷氨酸化或差異糖基化)構(gòu)成的肽將具有如下質(zhì)譜其中與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品相比，來(lái)自未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰強(qiáng)度降低了反映化學(xué)上不同的肽的豐度的量(圖1)。當(dāng)相互比較兩種未標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品時(shí)，例如比較未標(biāo)記的樣品A與未標(biāo)記的樣品B時(shí)，可能需要進(jìn)ー步使可能由移液誤差及MS檢測(cè)引起的變化減至最少。為了使這些變化減至最少，如公式I中所示，可將未標(biāo)記的樣品A與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品的比率與未標(biāo)記的樣品B與SITRS標(biāo)準(zhǔn)品的比率進(jìn)行比較。所得值稱為SITRS值びの。權(quán)利要求1.表征蛋白質(zhì)樣品的方法，所述方法包括(i)提供具有已知氨基酸序列的第一蛋白質(zhì)樣品，其中所述第一蛋白質(zhì)樣品中至少一個(gè)氨基酸被同位素標(biāo)記的氨基酸取代；(ii)提供未標(biāo)記的第二蛋白質(zhì)樣品，其包含對(duì)應(yīng)于所述第一蛋白質(zhì)中的同位素標(biāo)記變體的未標(biāo)記的氨基酸；(iii)將所述第一樣品與所述第二樣品混合以形成混合物；(iv)對(duì)所述混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)消化以形成第一消化物；(v)對(duì)所述第一消化物進(jìn)行自下而上液相色譜-質(zhì)譜以形成包括一個(gè)或多個(gè)雙峰或單峰的第一波譜，各雙峰表明存在來(lái)自所述第一樣品的同位素標(biāo)記的肽和來(lái)自所述第二樣品的相應(yīng)的未標(biāo)記的肽，各單峰表明存在具有突變、修飾或雜質(zhì)的肽，藉此表征所述第二蛋白質(zhì)樣品。2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括步驟(vi):比較所述雙峰中各峰的相對(duì)強(qiáng)度以測(cè)定各肽的相對(duì)量，其中1:1峰比率表明所述第一肽與所述第二肽基本上相同，且其中峰強(qiáng)度的差異反映存在化學(xué)上不同的肽。3.權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包括基于峰強(qiáng)度的相對(duì)降低來(lái)定量所述化學(xué)上不同的肽的量的步驟。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括步驟(vii):對(duì)所述消化物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜以測(cè)定由波譜中單峰所代表的肽的序列。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在所述第一蛋白質(zhì)中基本上所有等同的氨基酸都經(jīng)同位素標(biāo)記。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述同位素標(biāo)記的氨基酸包含至少一個(gè)重同位素。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)消化和所述同位素標(biāo)記的氨基酸選自(a)胰蛋白酶消化和一個(gè)或多個(gè)重精氨酸、重賴氨酸及其組合；(b)內(nèi)切蛋白酶GluC消化和重谷氨酸；(c)腸激酶輕鏈消化和所述同位素標(biāo)記變體選自一種或多種重天冬氨酸、重賴氨酸及其組合；(d)因子X(jué)a消化和一個(gè)或多個(gè)重異亮氨酸、重谷氨酸、重天冬氨酸、重甘氨酸、重精氨酸及其組合；(e)弗林蛋白酶消化和重精氨酸；(f)麥芽糖酶I消化和一個(gè)或多個(gè)重組氨酸、重酪氨酸及其組合；(g)胰凝乳蛋白酶消化和重芳香族氨基酸；(h)Lys-C或Lys-N消化和重賴氨酸；和(i)內(nèi)切蛋白酶ArgC消化和重精氨酸。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在蛋白質(zhì)消化之前純化所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和所述未標(biāo)記的蛋白質(zhì)的步驟。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自重組蛋白質(zhì)、生物治療蛋白質(zhì)、抗體、單克隆抗體、抗體藥物綴合物、成像抗體、融合蛋白和聚乙二醇化蛋白質(zhì)。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)為抗體。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述消化物包含肽群，其具有代表所述蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的組合序列。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合序列包含所述蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列。13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(i)提供未標(biāo)記的第三蛋白質(zhì)樣品，其包含對(duì)應(yīng)于所述第一蛋白質(zhì)中的所述同位素標(biāo)記變體的未標(biāo)記的氨基酸；(ii)將所述第一樣品與所述第三樣品混合以形成第二混合物；(iii)對(duì)所述第二混合物進(jìn)行第二蛋白質(zhì)消化以形成第二消化物；和(iv)對(duì)所述第二消化物進(jìn)行自下而上液相色譜-質(zhì)譜以形成包括一個(gè)或多個(gè)雙峰或單峰的第二波譜，各雙峰表明存在來(lái)自所述第一樣品的同位素標(biāo)記的肽和來(lái)自所述第三樣品的相應(yīng)的未標(biāo)記的肽，且各單峰表明存在具有突變、修飾或雜質(zhì)的肽，藉此表征所述第三蛋白質(zhì)樣品。14.權(quán)利要求13的方法，其進(jìn)一步包括步驟(V):比較來(lái)自所述第二消化物的波譜中所述雙峰的相對(duì)強(qiáng)度以測(cè)定各肽的相對(duì)量。15.權(quán)利要求13或14的方法，其進(jìn)一步包括比較所述第一消化物和所述第二消化物的結(jié)果，以測(cè)定所述第二蛋白質(zhì)樣品與所述第三蛋白質(zhì)樣品之間的任何差異。16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述比較包括將來(lái)自所述第一消化物的波譜的峰信號(hào)比率與來(lái)自所述第二消化物的波譜的相應(yīng)峰信號(hào)比率進(jìn)行比較。17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一蛋白質(zhì)樣品為創(chuàng)新生物制品，而所述第二蛋白質(zhì)樣品為所述創(chuàng)新生物制品的生物相似制品。18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一蛋白質(zhì)樣品為未綴合的蛋白質(zhì)，而所述第二蛋白質(zhì)樣品為綴合蛋白質(zhì)。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一蛋白質(zhì)樣品和所述第二蛋白質(zhì)樣品在不同細(xì)胞系、不同細(xì)胞類型或不同制造方法中產(chǎn)生。20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一蛋白質(zhì)樣品和所述第二蛋白質(zhì)樣品已在不同儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存。21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中采用所述方法來(lái)檢測(cè)所述第二蛋白質(zhì)樣品中的突變、修飾或雜質(zhì)。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述突變、修飾或雜質(zhì)選自寡糖含量改變、N-末端谷氨酰胺轉(zhuǎn)化、C-末端賴氨酸去除、焦谷氨酸含量改變和脫酰胺作用或氧化作用增加。23.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一樣品和所述第二樣品為基本上均質(zhì)的蛋白質(zhì)制品。24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一樣品和所述第二樣品為藥物組合物。全文摘要提供了定性和/或定量檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品中突變、修飾或雜質(zhì)的存在的方法。該方法利用在蛋白質(zhì)消化之前將同位素標(biāo)記的氨基酸變體摻入到蛋白質(zhì)中，以使得能夠在自下而上液相色譜中比較兩種蛋白質(zhì)樣品。由本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的測(cè)量不僅考慮蛋白水解消化期間所產(chǎn)生的肽的質(zhì)量，而且亦考慮各所得肽的豐度。通過(guò)在蛋白質(zhì)消化之前利用與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)混合的SITR樣品，使得可經(jīng)MS來(lái)測(cè)量肽的豐度。本文所用術(shù)語(yǔ)“SITRS樣品”或“SITRS標(biāo)準(zhǔn)品”意為具有已知序列的蛋白質(zhì)(例如抗體)，其用存在于蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的變體來(lái)標(biāo)記。文檔編號(hào)A61K38/00GK103025342SQ201180038482公開(kāi)日2013年4月3日申請(qǐng)日期2011年6月16日優(yōu)先權(quán)日2010年6月16日發(fā)明者A.V.馬努伊洛夫,D.H.李申請(qǐng)人:Abbvie公司