專利名稱：Bmp-2親和肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的特異性親和肽。另外，本發(fā)明涉及這些親和肽在BMP-2控釋裝置中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
BMP-2是一種屬于稱為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)的超家族的蛋白質(zhì)。已知ΒΜΡ-2可誘導(dǎo)骨和軟骨的形成。例如，ΒΜΡ-2已被用于通過(guò)手術(shù)植入與該蛋白質(zhì)組合的膠原基質(zhì)來(lái)促進(jìn)骨修復(fù)。ΒΜΡ-2以水性懸浮液的形式加載到可吸收的膠原海綿中。ΒΜΡ-2與膠原非特異性地締合。然而，由于膠原原纖維對(duì)ΒΜΡ-2的低結(jié)合能力(反之亦然)，ΒΜΡ-2可能會(huì)從膠原基質(zhì)滲漏出去。ΒΜΡ-2從膠原海綿的這種滲漏會(huì)導(dǎo)致在植入部位或其附近出現(xiàn)不良的旺盛骨形成和/或異位骨形成。不良的骨骼生長(zhǎng)會(huì)引起進(jìn)一步的并發(fā)癥，導(dǎo)致病人需要 一項(xiàng)或多項(xiàng)額外矯正手術(shù)。因此，需要一種ΒΜΡ-2控釋裝置來(lái)消除在不希望的位置的骨形成的問(wèn)題性副作用。制備控釋裝置的標(biāo)準(zhǔn)方法包括使用聚合物基質(zhì)，通常為微球、棒、片或丸的形式，其用于封裝活性劑。已知有多種技術(shù)可將活性劑摻入到聚合物基質(zhì)中。例子包括對(duì)具有離散性(discrete)大小或形狀的顆粒的溶劑蒸發(fā)、噴霧干燥、乳化、熔融共混和簡(jiǎn)單物理混合。由于肽或蛋白質(zhì)的微妙性質(zhì)，這些方法均不可應(yīng)用于將這些分子摻入到聚合物中。肽和蛋白質(zhì)容易因?yàn)槿軇?、乳化、高溫?尤其是)最終滅菌而變性。因此，需要一種制備BMP-2控釋裝置的方法，并且該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)變性或失去活性。還期望一種能提供蛋白質(zhì)的局部持續(xù)釋放從而避免不期望的異位骨形成的BMP-2控釋裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述了 BMP-2親和肽。這些親和肽對(duì)BMP-2具有特異性親和力，可用于制備親和生物基質(zhì)。還描述了 BMP-2控釋裝置，其由親和生物基質(zhì)和BMP-2制備而成。


圖I.對(duì)BMP-2具有特異性親和力的氨基酸序列(親和肽)，其包含線性肽和受二硫鍵約束的肽。圖2.控釋裝置的圖形表示，其包含親和生物基質(zhì)和BMP-2。圖3. BMP-2噬菌體ELISA測(cè)定證實(shí)了從噬菌體選擇產(chǎn)生的噬菌體展示肽結(jié)合到BMP-2。圖4A.用遞增的噬菌體數(shù)目/孔進(jìn)行的驗(yàn)證性和交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定，顯示出最小交叉反應(yīng)的結(jié)合噬菌體。圖4B.用遞增的噬菌體數(shù)目/孔進(jìn)行的驗(yàn)證性和交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定，顯示出高度交叉反應(yīng)的結(jié)合噬菌體。
圖4C.用遞增的噬菌體數(shù)目/孔進(jìn)行的驗(yàn)證性和交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定，顯示出在高噬菌體濃度(101°個(gè)噬菌體/孔)下交叉反應(yīng)的結(jié)合噬菌體。圖5A.對(duì)人IgG的交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定。圖5B.對(duì)人血清白蛋白(HSA)的交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定。圖6.親和肽與BMP-2的濃度依賴性結(jié)合，采用放大發(fā)光接近均勻測(cè)定法(amplified luminescent proximity homogenous assay, ALPHA)。圖7.通過(guò)評(píng)估在存在BMP-2的情況下3天后小鼠(MCH 1/26)成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性得出的親和肽對(duì)BMP-2受體結(jié)合的功能干擾。圖8A.用于將SEQ ID NO :6綴合到包含乙?；疦端和接頭的膠原基質(zhì)的肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 23)。 圖8B.耦聯(lián)了 SEQ ID NO 23后的膠原親和生物基質(zhì)的掃描電子顯微鏡(SEM)圖象。圖9.加載到膠原生物基質(zhì)及膠原親和生物基質(zhì)盤中的BMP-2的摻入百分比。圖10.體外釋放研究,示出在36天時(shí)間里從膠原生物基質(zhì)及膠原親和生物基質(zhì)盤釋放的BMP-2的量。圖11A.突變型噬菌體ELISA，示出結(jié)合到BMP-2的SEQ ID NO 3片段。圖11B.突變型噬菌體ELISA，示出結(jié)合到BMP-2的SEQ ID NO 6片段。圖12.用于鑒定結(jié)合到BMP-2的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 6片段的氨基酸序列，以及結(jié)合到BMP-2的片段的氨基酸序列。圖13.體外釋放研究，在包含2%熱滅活的胎牛血清(FBS)的磷酸緩沖鹽水(PBS)中進(jìn)行，示出在15天時(shí)間里從膠原生物基質(zhì)及膠原親和生物基質(zhì)盤釋放的BMP-2的量。圖14.用于體內(nèi)籠狀植入物測(cè)試系統(tǒng)的不銹鋼腔室的圖象。圖15.體內(nèi)釋放研究，示出在7天時(shí)間里從膠原生物基質(zhì)及膠原親和生物基質(zhì)盤釋放的BMP-2的量。
具體實(shí)施例方式本文描述了 BMP-2親和肽。在一個(gè)實(shí)施例中，BMP-2是重組人BMP_2。BMP-2親和肽表示該肽對(duì)BMP-2具有特異性結(jié)合親和力。該肽可以為線性的或受二硫鍵約束的。在一個(gè)實(shí)施例中，BMP-2親和肽為圖I所示親和肽中的任一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，親和肽可以是圖I所示親和肽中的任一個(gè)的片段。雖然親和肽具有對(duì)BMP-2的特異性親和力，但是親和肽不會(huì)干擾BMP-2的生物活性。這些親和肽可用于制備BMP-2控釋裝置。圖I所示的BMP-2親和肽使用美國(guó)專利No. US6472147中所述的pIX噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行鑒定。使用高復(fù)雜性的初級(jí)肽噬菌體文庫(kù)(每個(gè)文庫(kù)IO9個(gè)肽序列)來(lái)選擇BMP-2親和肽。更具體地講，將生物素?；疊MP-2固定在涂布鏈霉抗生物素蛋白的ELISA板上，并引入在PlX次要外殼蛋白上展示肽序列的噬菌體。將未結(jié)合到BMP-2上的噬菌體沖洗掉，并對(duì)結(jié)合到BMP-2的噬菌體進(jìn)行分離和擴(kuò)增。將結(jié)合到BMP-2的分離噬菌體作為輸入用于按照上述程序進(jìn)行第二輪選擇，共計(jì)三輪選擇。在第三輪結(jié)束時(shí)，對(duì)結(jié)合到BMP-2的噬菌體進(jìn)行測(cè)序以確定負(fù)責(zé)結(jié)合到BMP-2的肽。對(duì)BMP-2具有親和力的肽列于圖I中。BMP-2親和肽可用于制備親和生物基質(zhì)。親和生物基質(zhì)通過(guò)將至少一種如上所述的BMP-2親和肽共價(jià)連接至可生物降解的生物相容性聚合物來(lái)制備。此外，親和生物基質(zhì)可用作BMP-2控釋裝置。代表性的實(shí)施例以圖示方式示出于圖2中。BMP-2控釋裝置包含親和生物基質(zhì)和BMP-2。用于制備親和生物基質(zhì)的可生物降解的生物相容性聚合物可以是天然聚合物、合成聚合物以及它們的組合。可生物降解的聚合物在暴露于潮濕的身體組織時(shí)容易分解成小片段。這些片段隨后會(huì)被身體吸收或排泄。更具體地講，由于生物降解的片段被身體吸收或排泄，使得體內(nèi)不會(huì)永久性保留痕量或殘余片段，因此不會(huì)引起永久性的慢性異物反應(yīng)。合適的天然聚合物包括但不限于蛋白質(zhì)，諸如膠原、彈性蛋白、角蛋白、絲、葡糖胺聚糖(GAG)、凝血酶、纖連蛋白、明膠、纖維蛋白、彈性蛋白原、多肽、層粘連蛋白、蛋白聚糖、纖維蛋白膠、纖維蛋白凝塊、富血小板血漿(PRP)凝塊、貧血小板血漿(PPP)凝塊、自組裝肽水凝膠和去端肽膠原(atelocollagen);多糖，諸如淀粉、果膠、纖維素、烷基纖維素(如甲基纖維素)、烷基羥烷基纖維素(如乙基羥乙基纖維素)、羥烷基纖維素(如羥乙基纖維素)、硫酸纖維素、羧甲基纖維素的鹽、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、幾丁質(zhì)、羧甲基幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸的鹽、藻酸鹽、交聯(lián)藻酸鹽藻酸、丙二醇藻酸鹽、糖原、葡聚糖、硫酸 葡聚糖、凝膠多糖、果膠、普魯蘭多糖、黃原膠、軟骨素、硫酸軟骨素、羧甲基葡聚糖、羧甲基殼聚糖、殼聚糖、肝素、硫酸肝素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、卡拉膠、殼聚糖、淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、聚-N-葡糖胺、聚甘露糖醛酸、聚葡糖醛酸以及衍生物；聚核苷酸，諸如核糖核酸、脫氧核糖核酸，以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，天然聚合物為膠原。在另一個(gè)實(shí)施例中，天然聚合物可獲自脫細(xì)胞組織(decellularized tissue)。脫細(xì)胞組織可從自體組織、同種異體組織或異種組織獲得。合適的脫細(xì)胞組織包括但不限于皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸系膜(mesenter)、骨骼、腱等。合適的合成聚合物的例子包括但不限于脂族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亞烷基草酸酯、聚酰胺、聚(亞胺基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧雜酯、聚酰胺酯、含胺基團(tuán)的聚氧雜酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子以及它們的共混物。出于本發(fā)明的目的，脂族聚酯包括但不限于下列單體的均聚物和共聚物及其聚合物共混物丙交酯(包括乳酸、d-、I-和內(nèi)消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己內(nèi)酯、對(duì)二氧雜環(huán)己酮(1，4_ 二氧六環(huán)-2-酮)、三亞甲基碳酸酯(I，3- 二氧六環(huán)-2-酮)、三亞甲基碳酸酯的烷基衍生物、δ -戊內(nèi)酯、β-丁內(nèi)酯、Y-丁內(nèi)酯、ε-癸內(nèi)酯、羥基丁酸酯(重復(fù)單元)、羥基戊酸酯(重復(fù)單元)、1，4- 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮(包括其二聚體1，5，8，12-四氧雜環(huán)十四烷_(kāi)7，14- 二酮)、1,5- 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮、6，6_ 二甲基-1，4- 二氧六環(huán)-2-酮、2，5- 二酮嗎啉、新戊內(nèi)酯、α，α-二乙基丙內(nèi)酯、碳酸亞乙酯、草酸乙烯酯、3-甲基-1，4-二氧六環(huán)-2，5-二酮、3，3- 二乙基-1，4- 二氧六環(huán)-2，5- 二酮和6，8- 二氧雜雙環(huán)辛烷-7-酮。合適的脂族聚酯包括但不限于下列單體的均聚物和共聚物及其聚合物共混物丙交酯(包括乳酸、D-、L_和內(nèi)消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己內(nèi)酯、對(duì)二氧雜環(huán)己酮(1，4_ 二氧六環(huán)-2-酮)、三亞甲基碳酸酯(1，3_ 二氧六環(huán)-2-酮)、三亞甲基碳酸酯的烷基衍生物、S-戊內(nèi)酯、β-丁內(nèi)酯、Υ-丁內(nèi)酯、ε-癸內(nèi)酯、羥基丁酸酯(重復(fù)單元)、羥基戊酸酯(重復(fù)單元)、I，4- 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮(包括其二聚體I，5，8，12-四氧雜環(huán)十四烷-7，14- 二酮)、1，5- 二氧雜環(huán)庚烷-2-酮和6，6- 二甲基-1，4- 二氧六環(huán)_2_酮。
在一個(gè)實(shí)施例中，可生物降解的生物相容性聚合物和BMP-2親和肽具有合適的活性基團(tuán)和相應(yīng)的官能團(tuán)以將親和肽共價(jià)連接到聚合物?；钚曰鶊F(tuán)和官能團(tuán)可以在聚合物、親和肽以及它們的組合上。合適的活性基團(tuán)包括但不限于芳基疊氮化物、碳二亞胺、肼、羥甲基膦、亞氨酸酯、異氰酸酯、羰基、馬來(lái)酰亞胺、NHS酯、PFP酯、硫醇、吡啶基二硫化物和/或乙烯基砜等。合適的官能團(tuán)包括但不限于羥基、羧基、醛、酯、硫醇、胺、烯烴、炔烴、烷基鹵、肼和/或疊氮化物官能團(tuán)。有機(jī)化學(xué)或高分子化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠用上述合適的活性基團(tuán)和相應(yīng)官能團(tuán)將親和肽及聚合物官能化，以使親和肽共價(jià)連接到聚合物。例如，可以使用簡(jiǎn)單的碳二亞胺化學(xué)作用，將從膠原展示的賴氨酸殘基上的胺官能團(tuán)連接到親和肽的C末端羧基基團(tuán)。任選地，可將接頭序列添加到圖I所示的肽，以提高親和肽對(duì)BMP-2的結(jié)合性。接頭序列可以為(SGG)n* (XXX)n，其中X可以是絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸或蘇氨酸的任何組合。在一個(gè)實(shí)施例中，重復(fù)單元數(shù)η為約I至約10。在另一個(gè)實(shí)施例中，重復(fù)單元數(shù)η為約3至約5。例如，親和生物基質(zhì)可由可溶性和/或纖維狀的I型牛膠原制成。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將膠 原在水中的均質(zhì)化懸浮液(具有約10mg/mL至約100mg/mL的濃度)燒注到模具中，然后凍干。在熱脫水步驟之后，使用I-乙基-3-[3_ 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)耦聯(lián)化學(xué)反應(yīng)將親和肽綴合至膠原。這樣制備的膠原親和生物基質(zhì)為多孔三維泡沫支架的形式。親和生物基質(zhì)可用作BMP-2控釋裝置。BMP-2控釋裝置包含親和生物基質(zhì)和BMP-2。可以加載到親和生物基質(zhì)的BMP-2的量取決于綴合到可生物降解的生物相容性聚合物的親和肽的量?？缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔锷洗嬖诘挠H和肽的量可等于或大于控釋裝置中所需BMP-2的量。因此對(duì)于I摩爾的要遞送的BMP-2，可能至少有I摩爾的親和肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠確定骨修復(fù)的控釋裝置中需要的BMP-2量。該控釋裝置可以為海綿、顆粒、注射用凝膠或液體、膜、薄膜、纖維和基于纖維的支架等形式。在一個(gè)實(shí)施例中，控釋裝置為注射用凝膠或液體的形式，其中親和生物基質(zhì)在水溶液中并含有BMP-2。合適的水溶液的例子包括但不限于生理緩沖溶液、鹽水、水、緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖溶液、Hank' s平衡鹽溶液、PBS、Tris緩沖鹽水、Hepes緩沖鹽水，以及它們的混合物。用于制備注射用凝膠或液體裝置的聚合物可選自上述的天然或合成聚合物。在注射用液體或凝膠的情況下，親和生物基質(zhì)可以以約10mg/mL至約150mg/mL的量存在于水溶液中。任選地，還可將合成骨礦物質(zhì)摻入到BMP-2控釋裝置中以定制用于特定應(yīng)用的機(jī)械性能。例如，可以摻入具有生物活性的無(wú)機(jī)物以增加生物基質(zhì)的拉伸強(qiáng)度，所述無(wú)機(jī)物包括但不限于羥基磷灰石、氟代羥基磷灰石和/或硅酸鹽。BMP-2控釋裝置還可以任選地具有摻入在其中的細(xì)胞。合適的細(xì)胞類型包括但不限于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、臍帶細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞；衍生自脂肪組織的前體細(xì)胞；外周血祖細(xì)胞；分離自成體組織的干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及它們的組合。BMP-2控釋裝置可以作為試劑盒出售，其包含無(wú)菌親和生物基質(zhì)和無(wú)菌BMP-2凍干粉。包含在試劑盒中的親和生物基質(zhì)和BMP-2可以使用常規(guī)滅菌程序進(jìn)行滅菌，常規(guī)滅菌程序可包括但不限于電子束、Y輻照和滅菌制備方法。BMP-2控釋裝置允許人們以受控方式局部遞送BMP-2。該控釋裝置可以植入或注入需要骨修復(fù)或再生的部位。這種局部遞送有助于消除現(xiàn)有遞送方法所導(dǎo)致的旺盛骨形成和/或異位骨形成的不期望的效應(yīng)。異位骨形成的這一減少繼而會(huì)降低這些植入物的失敗率，從而提高患者的生活質(zhì)量。SM實(shí)例I-俥用噬菌體展示講行的BMP-2親和狀詵擇使用高復(fù)雜性的初級(jí)肽噬菌體文庫(kù)(每個(gè)文庫(kù)IO9個(gè)肽序列)來(lái)選擇BMP-2親和肽。更具體地講，將生物素?；疊MP-2固定在涂布鏈霉抗生物素蛋白的ELISA板上，并且引入在PlX次要外殼蛋白上展示肽序列的噬菌體。將未結(jié)合到BMP-2的噬菌 體沖洗掉，并對(duì)結(jié)合到BMP-2的噬菌體進(jìn)行分離和擴(kuò)增。將結(jié)合到BMP-2的分離噬菌體作為輸入用于按照上述程序進(jìn)行第二輪選擇，共計(jì)三輪選擇。使酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)板裝載200微升/孔的含5微克/mL鏈霉抗生物素蛋白的磷酸緩沖鹽水(PBS)，并在4°C下保持過(guò)夜。每次選擇涂布兩個(gè)孔。然后使用96孔ELISA洗板機(jī)將涂布鏈霉抗生物素蛋白的ELISA板用含吐溫20 (TBST)的Tris緩沖鹽水洗滌三次，隨后加載含有濃度為5微克/mL的生物素酰化BMP-2(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的安迪生物科技有限公司(R&D Systems Minneapolis，MN)，產(chǎn)品號(hào)355-BM/CF)的PBS溶液。將這些板在室溫下保持30分鐘。同時(shí)，用ImL含3 %脫水牛奶的TBST溶液封閉Eppendorf管(ImL體積,每個(gè)文庫(kù)一個(gè))。將Eppendorf管在室溫下翻轉(zhuǎn)30分鐘。在補(bǔ)加有四環(huán)素的2x YT培養(yǎng)基中，于37°C搖動(dòng)器上開(kāi)始兩組MC1061F’GII大腸桿菌培養(yǎng)。隨后棄去Eppendorf管中的封閉溶液，并更換為100微升的肽庫(kù)和300微升的含3%牛奶的TBST溶液。將此溶液在室溫下翻轉(zhuǎn)I小時(shí)。在封閉初級(jí)肽噬菌體文庫(kù)的同時(shí)，使用洗板機(jī)將涂布鏈霉抗生物素蛋白并加載BMP-2的孔用TBST洗滌3次。然后在室溫下用250微升的含3%牛奶的TBST溶液將板封閉I小時(shí)。移除每個(gè)孔中的封閉溶液并棄去，并且將肽噬菌體庫(kù)溶液以200微升/孔的體積加入各個(gè)相應(yīng)的孔。將其在室溫下保持I小時(shí)。隨后移除每個(gè)孔中的肽庫(kù)-牛奶溶液并棄去，并且用TBST將這些孔手工洗滌3次。在每個(gè)孔中引入200微升的對(duì)數(shù)中期噬菌體MC1061F’ GII大腸桿菌，并在37°C下溫育30分鐘。使感染的細(xì)菌在50mL補(bǔ)充有四環(huán)素的2xYT培養(yǎng)基中于37°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。然后，將細(xì)菌通過(guò)離心進(jìn)行分離，并使用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌體。將PEG沉淀的噬菌體用于第二輪，并重復(fù)以上過(guò)程共進(jìn)行三個(gè)循環(huán)的選擇過(guò)程。在第三輪結(jié)束時(shí)，對(duì)結(jié)合到BMP-2的噬菌體進(jìn)行測(cè)序以確定負(fù)責(zé)結(jié)合到BMP-2的肽。在含MC1061F’GII大腸桿菌的頂層瓊脂中，接種噬菌體感染的細(xì)菌以得到單個(gè)噬菌斑。所得的噬菌斑用于使用ELISA分離結(jié)合到BMP-2的噬菌體。鑒定出單個(gè)噬菌體后，將結(jié)合到BMP-2的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增、PEG沉淀，并進(jìn)行序列分析。對(duì)BMP-2具有親和力的肽列于圖I中。這些噬菌體用于實(shí)例2中所述噬菌體滴定以及實(shí)例3中所述的驗(yàn)證性和交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定。實(shí)例2-BMP-2詵擇輸出噬菌體滴定進(jìn)行噬菌體滴定，以確定如實(shí)例I所述對(duì)結(jié)合到BMP-2的噬菌體進(jìn)行PEG沉淀所得到的噬菌體的濃度。使大腸桿菌MC1061F’ GII在補(bǔ)加有四環(huán)素的2xYT培養(yǎng)基中于搖動(dòng)器上(180-250rpm)37°C生長(zhǎng)2_3小時(shí)。在96孔板中，進(jìn)行噬菌體稀釋，假設(shè)PEG沉淀的原液含有1012個(gè)噬菌體/mL。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將100微升的2xYT培養(yǎng)基引入到96孔板的各孔。向第I列引入10微升相應(yīng)的噬菌體原液。在整個(gè)板上進(jìn)行I : 10的系列稀釋直至第12列，得到的噬菌體濃度分別為 ο1。、ΙΟ9、108、IO7,IO6,ΙΟ5、104、IO3,IO2UO1UO0,ΚΓ1，其中每行含有不同的噬菌體。對(duì)于噬菌斑生長(zhǎng)，將I. 5微升的各個(gè)相應(yīng)噬菌體系列稀釋液引入到涂布了固化頂層瓊脂/細(xì)菌懸浮液的LB/四環(huán)素/X-Ga瓊脂板。將這些板在37°C下倒置溫育過(guò)夜。過(guò)夜溫育后，選擇噬菌斑良好分離并且可以計(jì)數(shù)的稀釋液。用以下公式計(jì)算滴定度(斑塊數(shù))(66. 7) (10* ^1) XlOO =噬菌體/mL，其中66. 7為各個(gè)孔中噬菌體的稀釋倍數(shù)，而稀釋次數(shù)為直到噬菌斑可以計(jì)數(shù)為止所進(jìn)行的稀釋次數(shù)。乘以100后得到噬菌體懸浮原液中每毫升的噬菌體數(shù)。

計(jì)算出的噬菌體濃度示于表I中。用所獲得的噬菌體濃度進(jìn)行稀釋，以用于實(shí)例3所述的驗(yàn)證性和交叉反應(yīng)性噬菌體ELISA測(cè)定。表I
權(quán)利要求
1.ー種 BMP-2 親和肽，選自 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 22以及它們的片段。
2.一種親和生物基質(zhì),包含可生物降解的生物相容性聚合物和至少ー種BMP-2親和肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的親和生物基質(zhì)，其中所述親和肽選自SEQID NO: USEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21 和 SEQ ID NO: 22。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的親和生物基質(zhì)，其中所述可生物降解的生物相容性聚合物為天然聚合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的親和生物基質(zhì)，其中所述天然聚合物選自膠原、弾性蛋白、角蛋白、絲、多糖、GAG以及它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的親和生物基質(zhì)，其中所述天然聚合物為膠原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的親和生物基質(zhì)，其中所述天然聚合物為選自以下組織的脫細(xì)胞組織皮膚、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、腸系膜、骨骼和腱。
8.一種控釋裝置，包含親和生物基質(zhì)和BMP-2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控釋裝置，其中所述裝置為選自海綿、顆粒、注射用凝膠、注射用液體、膜、薄膜、纖維和基于纖維的支架的形式。
10.ー種試劑盒，包含親和生物基質(zhì)和BMP-2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了BMP-2親和肽。更具體地講，公開(kāi)了一種親和生物基質(zhì)，其中所述親和肽共價(jià)地連接到可生物降解的生物相容性聚合物。所述親和生物基質(zhì)可用于制備BMP-2控釋裝置。
文檔編號(hào)A61K51/08GK102858793SQ201180013994
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者J.克赫, D.A.薩利克, C.H.方, C.楊, A.克里西 申請(qǐng)人:先進(jìn)科技及再生醫(yī)學(xué)有限責(zé)任公司