專利名稱：一種確定食道癌病人生存預(yù)后的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)申請(qǐng)涉及根據(jù)病人的microRNA水平來(lái)進(jìn)行疾病(例如食管癌)診斷、預(yù)后和提高生存率的方法。
背景技術(shù)：
食管癌是消化道的第三大癌，也是全球癌癥致死的第七大起因。食管癌最常見的類型是鱗狀上皮細(xì)胞癌和腺癌。鱗狀上皮細(xì)胞癌發(fā)生于沿食管排列的扁平細(xì)胞。腺癌發(fā)生于食管內(nèi)層并和Barrett’ s食管相關(guān)。食管鱗狀上皮細(xì)胞癌具有典型的從侵襲前發(fā)育異常到侵襲性鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)展階段，晚期通常伴隨轉(zhuǎn)移(Wen et al. , Fam. Cancer. 2006 May 25 ； [Epub ahead of print])。食管癌通常伴隨許多基因的表達(dá)變化。比如，C0X-2和VEGF通常和化生發(fā)展與發(fā)育異常有關(guān)，和癌癥有關(guān)，和潛在轉(zhuǎn)移有關(guān)(Liang et al, Cancer Res. 2006,66 7111-7118 ；Vallbohmer et al,Arch Surg. 2006,141 :476-481 ；Fam. Cancer. 2006 May 25， [Epub ahead of print] ；Matsumoto et al, J Gastrointest Surg. 2006,10 :1016-1022 ; Soma et al, Int J Cancer. 2006,119 :771-782)。microRNA(miRNA)是一類小的、22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的非編碼單鏈RNA，部分或完全與靶標(biāo)序列同源，與靶標(biāo)mRNA分子的非編碼區(qū)(3:_相互作用(Bartel, Cell 2004， 116 =281-297)。miRNA和靶標(biāo)mRNA的相互作用阻止mRNA翻譯為蛋白。在一些情況下，當(dāng)靶標(biāo)mRNA和miRNA精確匹配時(shí)，mRNA也會(huì)發(fā)生降解。miRNA參與一系列細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡(Cheng et al, Nucleic Acids Res 2005,33 :1290-7 John et al, PLoS Biol. 2004，2 :e363)。據(jù)估計(jì)人類基因組上存在多達(dá) 1000 個(gè) miRNA(Zamore and Haley, Science 2005,309 :1519-1524)。約有三分之一的人類mRNA可能是潛在的miRNA靴標(biāo)(Lewis et al, Cell 2005,115 :787-798) 越來(lái)越多的證據(jù)表明，不同的miRNA序列對(duì)于癌癥的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用 (Lu et al, Nature 2005,435 :834-838 ；Volinia et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103 :2257-2261 ；Wynter, Med. Hypotheses. 2006,66 :612-35 ；Li et al,Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006，348 :229-237)。miRNA基因通常位于基因組上癌癥容易發(fā)生修飾的位點(diǎn)，例如脆性位點(diǎn)(FRAs)，斷裂點(diǎn)和區(qū)域，基因組擴(kuò)增的最小區(qū)域，以及失異質(zhì)性的區(qū)域(Calin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002,99 :15524-15529 ；Calin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004,101 :2999-3004)，以上說(shuō)明癌癥中所觀察到的一些miRNA表達(dá)水平的變化是基因組不穩(wěn)定性的結(jié)果。人們利用miRNA 芯片表達(dá)譜(Babak et al.，RNA 2004,10 :1813-9 ；Barad et al. ， Genome Res. 2004,14 :2486-94 ；Calin et al. ， Proc Natl Acad Sci USA. 2004,101 11755-11760 ；Liu et al.，Proc Natl Acad Sci USA. 2004,101 :9740-4 ；Nelson et al.， Nat Methods 2004，1 :155-61 ；Thomson et al.，Nat Methods 2004，1 :47-53 ；Ciafre et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005,334 1351-1358 ；Shingara et al. , RNA 2005, 11 :1461-1470)，磁珠雜交(Lu et al. , Nature 2005，435 :834-838)和 RT_PCR(Bandres et al. ,Mol Cancer 2006，5 :29)來(lái)研究癌癥組織的miRNA表達(dá)水平。在許多癌癥中都發(fā)現(xiàn)了 miRNA表達(dá)水平變化，例如慢性淋巴細(xì)胞性白血病(Calin et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 2004，101 :11755-11760)，直腸癌(Bandres et al.，Mol Cancer 2006，5 :29)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ciafre et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005,334 :1351-1358)和胸腺癌 (Iorio et al. , Cancer Research 2005,65 :7065-7070) 目前，一些保存的癌癥組織活組織切片，如福爾馬林保存的石蠟包埋組織(FPPE) (Nelson et al. ,RNA 2006，12 187-191)， 冰凍保存組織(Lu et al, Nature 2005，435 :834-838)，或兩種方法各保存的組織同時(shí)應(yīng)用(He et al, Nature 2005，435 :擬8_833)，或其他未明確說(shuō)明保存情況的組織(Volinia et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 2006，103 :2257-2261 ；Yanaihara et al. ,Cancer Cell 2006,9 :189-198)都被成功應(yīng)用于癌癥中miRNA表達(dá)譜的分析。此處所涉及的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)以及已公開的專利申請(qǐng)均完整地列為參考文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及根據(jù)miRNA的水平或相應(yīng)基因的狀態(tài)，進(jìn)行癌癥的診斷和預(yù)后，特別是用于食管癌的診斷和預(yù)后。另外本發(fā)明也提供了應(yīng)用探針用于癌癥的診斷和預(yù)后，特別是應(yīng)用檢測(cè)miRNA或相應(yīng)基因狀態(tài)探針用于癌癥的診斷和預(yù)后，特別是食管癌的診斷和預(yù)后。與此相應(yīng)，本發(fā)明提供了個(gè)體癌癥診斷的方法，該方法包含以下步驟a)測(cè)定個(gè)體組織樣品中至少一種miRNA水平，b)比較測(cè)定樣品中的miRNA水平與參考miRNA水平， 如果測(cè)定樣品組織中miRNA水平同參考miRNA水平比較有明顯改變，說(shuō)明個(gè)體有癌變。另一方面，本發(fā)明提供了在個(gè)體中診斷食道癌方法，該方法包含以下步驟a)測(cè)定個(gè)體食管組織樣品中懷疑有癌變部分的至少一種miRNA水平，例如測(cè)定圖1中的miRNA 中的至少一種或其相應(yīng)的同源物，b)比較測(cè)定樣品中的miRNA水平與參考miRNA水平，如果測(cè)定樣品組織中miRNA水平同參考miRNA水平比較有明顯改變，說(shuō)明個(gè)體有食道癌。具體地說(shuō)，上述方法測(cè)定的食管癌可以為食管鱗癌，也可以是食管腺癌。具體地說(shuō)，在上述方法中測(cè)定的miRNA不是miRj9b、miRj9a、miR-96、miR-182s、 miR-182as、miR-183 和 miR-U9_l，也不是 miR-15 和 miR-16。具體地說(shuō)，在上述食道癌診斷方法中，至少一個(gè)(例如也可以至少是2，5，10，14 個(gè))從含有SEQ ID Nos. 1-14的選擇的miRNA水平或它們相應(yīng)的同源物水平被測(cè)定；如果在檢測(cè)中結(jié)果中至少有一個(gè)含有SEQ ID Nos. 1-14的miRNA或它們相應(yīng)的同源物有顯著升高，表明樣品中有食道癌。在另外一些具體情況下，至少一個(gè)從含有SEQ ID Nos. 15-38選擇的miRNA或它們相應(yīng)的同源物的水平被測(cè)定，如果在檢測(cè)中結(jié)果中至少有一個(gè)含有SEQ ID Nos. 15-38的miRNA或它們相應(yīng)的同源物有顯著降低，表明樣品中有食道癌。具體說(shuō)，在上述方法中至少一個(gè)從SEQ ID Nos. 1-14中選擇的miRNA和至少一個(gè)從SEQ ID Nos. 15-38的miRNA中選擇，如果在檢測(cè)中結(jié)果中至少有一個(gè)含有SEQ ID Nos. 1-14的miRNA有顯著升高和至少一個(gè)SEQ ID Nos. 15-38的miRNA有顯著降低，表明樣品中有食道癌。具體地說(shuō)，在上述方法中測(cè)定miRNA的水平用生物芯片分析方法。具體地說(shuō)，在上述方法中miRNA水平通過(guò)芯片上miRNA的雜交信號(hào)確定。具體地說(shuō)在上述方法中miRNA水平通過(guò)芯片上miRNA的雜交信號(hào)與參考樣品雜交信號(hào)之間比率確定。具體地說(shuō)上述方法中miRNA水平用Northern雜交、原位雜交和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法中的任一方法確定。具體說(shuō)，一種在人體中診斷食道癌的方法，該方法包含分析人體中食管組織樣品中懷疑有癌變的組織部分中至少一種miRNA相應(yīng)的基因狀態(tài)，例如在圖1中的miRNA相應(yīng)的基因狀態(tài)；比較檢測(cè)樣品中的miRNA的基因狀態(tài)與參照品miRNA的基因狀態(tài)，如果檢測(cè)樣品組織中的miRNA的相應(yīng)基因同參照品miRNA中基因相比較有明顯改變，說(shuō)明人體有食道癌。具體說(shuō)，上述方法中測(cè)定miRNA的基因狀態(tài)通過(guò)基因刪除或擴(kuò)增來(lái)確定。具體說(shuō)，在上述方法中確定miRNA的基因改變是根據(jù)基因拷貝數(shù)的改變。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了用于測(cè)定至少一個(gè)如圖1所示miRNA或它們的相應(yīng)類似物 (或者相應(yīng)的miRNA基因狀態(tài))的水平的系統(tǒng)，例如微陣列芯片；該系統(tǒng)由多個(gè)探針組成， 每個(gè)探針可以檢測(cè)食管組織樣本中的一個(gè)miRNA或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)，至少有15 % (包括例如至少20 %、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了一個(gè)來(lái)診斷食管癌的系統(tǒng)，例如微陣列芯片；該系統(tǒng)由許多探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA (或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))，至少有15% (包括例如至少20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的miRNA(或相應(yīng) miRNA的基因狀態(tài))。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用一個(gè)系統(tǒng)來(lái)診斷食管癌，該系統(tǒng)由至少一個(gè)(包括例如至少2、5、10、15、20、25、30、35和40個(gè))探針組成，例如寡核苷酸，每個(gè)探針可以檢測(cè)如圖1中所示的miRNA水平或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)，如果如圖1中所示的miRNA水平或它們相應(yīng)的類似物，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)中的至少一個(gè)有明顯改變，說(shuō)明有食管癌。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用系統(tǒng)來(lái)診斷食管癌，例如微陣列芯片，該系統(tǒng)由許多探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中一個(gè)miRNA或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)的水平，其中至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)的水平，如果如圖1中所示的 miRNA或它們的相應(yīng)類似物或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)的水平有明顯變化表明有食管癌。本發(fā)明也提供了檢測(cè)miRNA的探針用于制備上述系統(tǒng)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了用一個(gè)或多個(gè)探針(例如寡核苷酸)來(lái)制造用于診斷個(gè)體食管癌的系統(tǒng)，每個(gè)探針可以檢測(cè)如圖1中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)水平。具體說(shuō)，本發(fā)明用探針(例如寡核苷酸)來(lái)制造用以診斷食管癌的系統(tǒng)(例如微陣列芯片)，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中一個(gè)miRNA的水平或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)，至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的 miRNA或它們的相應(yīng)類似物，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)水平。另一方面，本發(fā)明還提供了食管癌患者分型的方法，例如確定食道癌的分化水平、腫瘤分期和病理類型。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了劃分食管癌病人的方法，包括例如判定分化水平、腫瘤分期和病理類型，該方法包含檢測(cè)個(gè)體食管癌組織中至少一個(gè)miRNA，例如表2 中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)，而miRNA的水平或相應(yīng) miRNA的基因狀態(tài)是作為劃分食管癌病人的基礎(chǔ)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了決定個(gè)體食管癌分化水平的方法，包含檢測(cè)個(gè)體食管癌組織中如圖加中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物的水平，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)，而 miRNA的水平或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)是作為決定個(gè)體食管癌分化水平的基礎(chǔ)。具體說(shuō)，檢測(cè)的miRNA至少一個(gè)是hsa-miR-335或它的相應(yīng)類似物。在某些情況下，至少一個(gè)miRNA 是hsa-miR-25或它的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，檢測(cè)的miRNA至少一個(gè)是hsa_miR-130b或它的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，檢測(cè)的miRNA至少一個(gè)是hSa-miR-130a或它的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，檢測(cè)的miRNA至少一個(gè)是hsa-miR-181d或它的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了一個(gè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)樣本中至少一個(gè)如表2所示miRNA或它們的相應(yīng)類似物，或者相應(yīng)的miRNA基因狀態(tài)的水平，例如微陣列系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含有多個(gè)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)，至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如表2中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)來(lái)劃分食管癌患者，例如微陣列；該系統(tǒng)由多個(gè)探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)水平，至少有15% (包括例如至少20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如表2中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))的水平。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用一個(gè)系統(tǒng)來(lái)劃分食管癌患者，該系統(tǒng)由一個(gè)或多個(gè)探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)如表2中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物的水平，或相應(yīng) miRNA的基因狀態(tài)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用一個(gè)系統(tǒng)來(lái)劃分食管癌患者，系統(tǒng)由一個(gè)或多個(gè)探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA，至少50 %的探針能夠檢測(cè)如表2中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物的水平。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)探針來(lái)制造用以劃分食管癌患者的系統(tǒng)， 每個(gè)探針可以檢測(cè)如表2中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物的水平，或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用探針來(lái)制造用以劃分食管癌患者的系統(tǒng)，例如微陣列； 每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA的水平或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)水平，至少有15% (包括例如至少20 %、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如表2中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))的水平。具體說(shuō)，本系統(tǒng)應(yīng)用于確定個(gè)體食管癌患者食道癌的分化水平。具體說(shuō)，本系統(tǒng)應(yīng)用于從病理上劃分食管鱗狀上皮細(xì)胞癌。具體說(shuō)，本系統(tǒng)可以應(yīng)用于確定個(gè)體食管癌的腫瘤分期。本發(fā)明另外一方面提供關(guān)于判斷食管癌患者預(yù)后的方法，包括判斷食管癌患者的生存預(yù)后。具體說(shuō)，提供了判斷食管癌患者的生存預(yù)后方法，該方法包含以下步驟a) 檢測(cè)個(gè)體食管癌組織樣本中至少一個(gè)miRNA的水平，b)將該miRNA的水平和臨界值相比較，該比值與個(gè)體的生存率成正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了判斷食管癌患者的生存預(yù)后的方法，包括分析至少一個(gè)miRNA基因狀態(tài)，例如hsa-miR-103、hsa-miR-107和
6hsa-miR-23b中的一個(gè)的基因狀態(tài)，和對(duì)照樣本相比基因狀態(tài)的有變化說(shuō)明患者的高生存率或低生存率。具體說(shuō)，上述miRNA 中至少一個(gè)是 hsa-miR-103、hsa-miR-107 或 hsa_miR-23b 中的一個(gè)或它們的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，至少一個(gè)miRNA是hsa-miR-107。具體說(shuō)，至少一個(gè) miRNA是hsa-miR-23b。具體說(shuō)，生存率是總生存率。具體說(shuō)，生存率是無(wú)病生存率。具體說(shuō)，個(gè)體處于食管癌早期。具體說(shuō)，該方法還包括決定個(gè)體的適宜療程。本發(fā)明還提供了應(yīng)用可以檢測(cè)miRNA水平或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài)的探針，或應(yīng)用包含有一個(gè)或多個(gè)探針的系統(tǒng)的用于判定生存預(yù)后。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一個(gè)或多個(gè)探針或包含有由一個(gè)或多個(gè)探針組成的系統(tǒng)來(lái)判定食管癌患者的生存預(yù)后，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA，將該miRNA的水平和臨界值相比較，該比值與該個(gè)體的生存率成正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)探針來(lái)判定食管癌患者的生存預(yù)后，將miRNA的水平和臨界值相比較，該比值與該個(gè)體的生存率負(fù)相關(guān)，這些miRNA至少有一個(gè)是 hsa-miR-103、hsa-miR-107 或 hsa_miR-2;3b 或它們的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)探針來(lái)制造用以預(yù)測(cè)食管癌患者生存預(yù)后的試劑(或系統(tǒng))，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的miRNA，將該miRNA的水平和臨界值相比較， 該比值與該個(gè)體的生存率成正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。具體說(shuō)，提供了用一個(gè)或多個(gè)探針來(lái)制造用以預(yù)測(cè)食管癌患者生存預(yù)后的試劑(或系統(tǒng))，miRNA水平與臨界的比值與該個(gè)體的生存率負(fù)相關(guān)，這樣的miRNA至少有一個(gè)是hsa-miR-103、hsa-miR-107或hsa_miR-2;3b或它們的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，至少有一個(gè) miRNA 是 hsa-miR-103、hsa-miR-107 或 hsa_miR-23b。本發(fā)明同時(shí)提供了提高食管癌患者生存率的方法。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了提高食管癌患者生存率的方法，該方法包含給患者提供降低某種miRNA水平的有效量的試劑， 這種miRNA水平與閾值的比值與該個(gè)體的生存率負(fù)相關(guān)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了降低某種 miRNA水平的試劑在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用來(lái)提高食管癌患者生存率，這種miRNA水平與臨界值的比值與該個(gè)體的生存率負(fù)相關(guān)。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了提高食管癌患者生存率的方法，該方法包括給與患者有效劑量來(lái)降低某種 miRNA 水平的試劑，miRNA 包括 hsa-miR-103、hsa-miR-107、hsa_miR-23b 或它們的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，本發(fā)明還提供了使用降低某種miRNA水平的試劑，在制備提高食管癌患者生存率的藥物中應(yīng)用，此類miRNA包括hsa-miR-103、hsa-miR-107、 hsa-miR-23b或它們的相應(yīng)類似物。具體說(shuō)，這些試劑至少同時(shí)降低hsa-miR-103、 hsa-miR-107或hsa-miR-23b中的兩種。具體說(shuō)，這些試劑可以同時(shí)降低hsa-miR-103、 hsa-miR-107 禾口 hsa_miR-23b。具體說(shuō)，本發(fā)明提供了含有至少能夠降低一種miRNA水平的試劑和一種藥物可應(yīng)用的載體的藥物復(fù)合物，該藥物復(fù)合物能降低的miRNA包括hsa-miR-103、hsa-miR-107 或hSa-miR-2;3b或它們的相應(yīng)類似物中的至少一種。某些情況下，至少一個(gè)miRNA是 hsa-miR-103 ο具體說(shuō)，至少一個(gè)miRNA是hsa-miR-107。具體說(shuō)，至少一個(gè)miRNA是 hsa-miR-23b0具體說(shuō)，此種藥物是雙鏈RNA (例如短的或小的干擾RNA，或siRNA)、反義核苷酸或具有酶活性的RNA分子例如核酶。本發(fā)明還包括提供上述各種方法的試劑盒。


圖1在食管癌患者中水平發(fā)生變化的miRNA。圖加在不同分化階段的食管癌患者中水平發(fā)生變化的miRNA。圖2b在了菌傘型以及髓質(zhì)型食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中水平發(fā)生變化的miRNA圖2c在不同腫瘤期(N0/N1)的食管癌患者中水平發(fā)生變化的miRNA。圖3表達(dá)水平與食管癌生存率負(fù)相關(guān)的miRNA。圖4用微陣列顯著性分析(SAMs)方法所挑選出的miRNA的聚類分析。有40個(gè) miRNA在冰凍的食管癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)，對(duì)31對(duì)樣本組中這40個(gè)miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行聚類分析。樣本按列排列，miRNA按行排列。標(biāo)有#的樣本表示“錯(cuò)誤分類”。圖5比較了新鮮組織和冰凍組織的miRNA表達(dá)譜。miRNA表達(dá)譜通過(guò)5對(duì)新鮮組織驗(yàn)證。這10個(gè)樣本用SVM方法驗(yàn)證，證實(shí)10個(gè)樣本全部正確分類。標(biāo)有#的訓(xùn)練樣本提示“錯(cuò)誤分類”。圖6是食管癌患者的Kaplan-Meier生存曲線。圖6A提示hsa_miR-103的低表達(dá)(n = 15)和食管癌患者的總生存率正相關(guān)，hsa-miR-103的高表達(dá)(n = 16)和食管癌患者的總生存率負(fù)相關(guān)。圖6Β提示hsa-miR-107的低表達(dá)(n = 14)和食管癌患者的總生存率正相關(guān)，hsa-miR-107的高表達(dá)(n = 17)和食管癌患者的總生存率負(fù)相關(guān)。圖C提示 hsa-miR-23b的低表達(dá)(n = 17)和食管癌患者的總生存率正相關(guān)，hsa-miR-23b的高表達(dá) (n = 14)和食管癌患者的總生存率負(fù)相關(guān)。圖D提示hsa-miR-103的低表達(dá)(n = 15)和食管癌患者的無(wú)病生存率正相關(guān)，hsa-miR-103的高表達(dá)(n = 16)和食管癌患者的無(wú)病生存率負(fù)相關(guān)。圖E提示hsa-miR-107的低表達(dá)(n = 14)和食管癌患者的無(wú)病生存率正相關(guān)，hsa-miR-107的高表達(dá)(n = 17)和食管癌患者的無(wú)病生存率負(fù)相關(guān)。
具體實(shí)施例方式此項(xiàng)發(fā)明主要基于對(duì)31對(duì)正常食管組織和食管癌組織進(jìn)行的基因組水平的 miRNA表達(dá)譜研究。具體來(lái)說(shuō)，即是用微陣列芯片比較癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的miRNA表達(dá)差異。我們找到40個(gè)在癌組織中高表達(dá)或低表達(dá)的miRNA。我們還找到了不同疾病狀態(tài)下表達(dá)有差異的miRNA。此外，我們還發(fā)現(xiàn)三個(gè)miRNA的水平與食管癌患者的總生存率以及無(wú)病生存率相關(guān)。此項(xiàng)發(fā)明基于某些miRNA的表達(dá)水平或相應(yīng)基因的狀態(tài)，為癌癥(例如食管癌) 的診斷和預(yù)后提供了方法和藥物。從一個(gè)方面來(lái)說(shuō)，我們提供了基于某些miRNA表達(dá)水平的有關(guān)癌癥(例如食管癌) 診斷的方法和藥物。從另一個(gè)方面來(lái)說(shuō)，我們還提供了基于某些miRNA表達(dá)水平的，根據(jù)病理類型、分化水平和腫瘤分期來(lái)劃分癌癥患者，尤其是食管癌患者的方法。從另一個(gè)方面來(lái)說(shuō)，我們還提供了基于某些miRNA表達(dá)水平的，判定癌癥患者，尤其是食管癌患者的生存預(yù)后的方法和藥物。從一個(gè)方面來(lái)說(shuō)，我們提供了用RT-PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)水平的方法，用以診斷疾病。此項(xiàng)發(fā)明提供了上述所有方法的系統(tǒng)和試劑盒。“個(gè)體”表示一個(gè)脊椎動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物，特別是人。哺乳動(dòng)物不僅指家畜、野畜、寵物、靈長(zhǎng)類、小鼠和大鼠。在某些情況下，個(gè)體是指人。在某些情況下，個(gè)體是指用以研究食管癌的模式動(dòng)物。也就是說(shuō)，如果個(gè)體指的不是人，那么miRNA就是指對(duì)應(yīng)人源miRNA 的相應(yīng)類似物或同源物。在某些情況下，個(gè)體是指男性。在某些情況下，個(gè)體是指女性。在某些情況下，個(gè)體并不代表食管癌的病理類型。在某些情況下，個(gè)體是指有食管癌家族史。這里所說(shuō)的一個(gè)“食管組織樣本”是指食管的組織樣本。在某些情況下，組織樣本是新鮮組織。在某些情況下，組織樣本是冰凍組織。在某些情況下，組織樣本是被固定的。 在某些情況下，組織樣本被甲醛固定。在某些情況下，組織樣本被石蠟包埋。如下所述，根據(jù)具體的方法，使用完整組織，或者使用被分成小塊的組織，或者是細(xì)胞團(tuán)塊或單個(gè)細(xì)胞。食管癌包括，但不局限于食管鱗狀上皮細(xì)胞癌和食管腺癌。用以診斷癌癥，特別是食管癌的方法和藥物從一個(gè)方面來(lái)說(shuō)，此項(xiàng)發(fā)明為個(gè)體疾病(例如癌癥)診斷提供的方法包括a)檢測(cè)來(lái)自某個(gè)個(gè)體樣本的至少一個(gè)miRNA的水平；b)將該miRNA的水平和對(duì)照相比較，miRNA 水平的典型變化可作為疾病(例如癌癥)的提示。用此項(xiàng)發(fā)明可以診斷的疾病包括癌癥，例如肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、大腸癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、腎癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、睪丸癌；心血管疾病，例如冠狀動(dòng)脈性心臟病、高血壓、動(dòng)脈硬化；年齡相關(guān)性疾病，例如帕金森氏病、阿爾茨莫氏病、糖尿病。從一個(gè)方面來(lái)講，此項(xiàng)發(fā)明為食管癌診斷提供的方法包括a)檢測(cè)來(lái)自某個(gè)食管癌疑似病例的食管組織樣本的至少一個(gè)miRNA(例如圖1中顯示的至少一個(gè)miRNA或它們相應(yīng)的同源物)的水平；b)將該miRNA的水平和參照相比較，miRNA水平的特征性變化可作為食管癌的提示。在某些情況下，此項(xiàng)發(fā)明為食管癌診斷提供的方法包括a)將來(lái)自某個(gè)食管癌疑似病例的食管組織樣本的miRNA (例如圖1中顯示的至少一個(gè)miRNA或它們相應(yīng)的同源物) 水平和參照相比較；b)根據(jù)至少一個(gè)miRNA水平的特征性變化來(lái)判斷個(gè)體是否患有食管癌。在某些情況下，方法還包括從個(gè)體取得食管組織樣本的步驟。在某些情況下，方法還包括從組織樣本提取miRNA的步驟。在某些情況下，此項(xiàng)發(fā)明為食管癌診斷提供的方法包括a)檢測(cè)來(lái)自某個(gè)食管癌疑似病例的食管組織樣本的至少一個(gè)miRNA(例如圖1中顯示的至少一個(gè)miRNA或它們相應(yīng)的同源物)的水平；b)根據(jù)該miRNA的水平為食管癌診斷提供信息，該miRNA的水平可以作為診斷基礎(chǔ)，該miRNA水平的特征性變化可作為食管癌的提示。在某些情況下，miRNA不是 miRj9b，miR-29a, miR-96, miR-182*，miR_182a*， miR-183，和 miR-U9_l，在某些情況下，miRNA 不是 miR-15 和 miR-16。在某些病例，檢測(cè)SEQ ID編號(hào)1-14或相應(yīng)類似物中至少一個(gè)miRNA(例如至少是 2、5、10中的一個(gè))的水平，其中至少一個(gè)miRNA水平的顯著增加可提示食管癌。在某些病例，檢測(cè)SEQ ID編號(hào)15-38或相應(yīng)類似物中至少一個(gè)miRNA (例如至少是2、5、10、15、20、24 中的一個(gè))的水平，其中至少一個(gè)miRNA水平的顯著增加可提示食管癌。在某些病例，檢測(cè) SEQ ID編號(hào)1-14或相應(yīng)類似物中至少一個(gè)miRNA (例如至少是2、5、10、14中的一個(gè))以及 SEQ ID編號(hào)15-38或相應(yīng)類似物中至少一個(gè)miRNA (例如至少是2、5、10、14中的一個(gè))，其中圖1中編號(hào)1-14 WmiRNA以及它們相應(yīng)類似物中至少有一個(gè)miRNA水平顯著增加，同時(shí)編號(hào)15-38的miRNA以及它們相應(yīng)類似物中至少有一個(gè)miRNA水平顯著下降可以提示食管癌。在某些病例，我們檢測(cè)圖1所示的所有miRNA的水平，SEQ ID編號(hào)1_14中至少一個(gè)miRNA(例如至少是2、5、10中的一個(gè))的水平升高，同時(shí)SEQ ID編號(hào)15-38中至少一個(gè) miRNA (例如至少是2、5、10、14中的一個(gè))的水平下降可以提示食管癌。在某些情況下，SEQ ID編號(hào)1-14中至少兩個(gè)miRNA的水平升高，同時(shí)SEQ ID編號(hào)15-38中至少兩個(gè)miRNA的水平下降可以提示食管癌。在某些情況下，SEQ ID編號(hào)1-14中的miRNA的水平升高，同時(shí) SEQ ID編號(hào)15-38中的miRNA的水平下降可以提示食管癌。組織樣本中miRNA的水平可以反映miRNA基因狀態(tài)的變化?；驙顟B(tài)的改變可由 miRNA基因缺失或擴(kuò)增來(lái)反映或是由miRNA基因的拷貝數(shù)變化來(lái)反映。因此在某些情況下，我們?yōu)槭彻馨┰\斷提供的方法包括分析來(lái)自食管癌疑似病例的組織樣本的至少一個(gè)miRNA(例如圖1中顯示的至少一個(gè)miRNA或它們相應(yīng)的同源物) 基因狀態(tài)，相比于對(duì)照樣本如果發(fā)生基因狀態(tài)的改變可以提示食管癌。在某些情況下，基因狀態(tài)的改變由miRNA基因缺失或擴(kuò)增來(lái)決定，在某些情況下，基因狀態(tài)的改變由miRNA基因的拷貝數(shù)變化來(lái)決定。在某些情況下，我們?yōu)槭彻馨┰\斷提供的方法包括分析來(lái)自食管癌疑似病例的組織樣本的至少一個(gè)圖1中所示的miRNA，看該miRNA基因是否有缺失或擴(kuò)增，相比于對(duì)照樣本如果發(fā)生基因缺失或擴(kuò)增來(lái)可以提示食管癌。例如，在某些情況下，我們分析SEQ ID編號(hào)1-14中的miRNA基因是否發(fā)生擴(kuò)增，至少一個(gè)miRNA基因的擴(kuò)增可以提示食管癌。在某些情況下，我們分析SEQ ID編號(hào)15-38中的miRNA基因是否發(fā)生缺失，至少一個(gè)miRNA基因的缺失可以提示食管癌。在某些情況下，方法還包括從疑似病例取得食管組織樣本的步驟。在某些情況下，方法還包括從組織樣本提取DNA的步驟。在某些情況下，我們?yōu)槭彻馨┰\斷提供的方法包括分析來(lái)自食管癌疑似病例的組織樣本中，是否有圖1中所示的miRNA基因拷貝數(shù)的變化。女性常染色體或性染色體上如果有多于兩個(gè)miRNA基因，男性性染色體上如果有多于一個(gè)miRNA基因可以提示食管癌。例如，在某些情況下，我們分析SEQ ID編號(hào)1-14中的miRNA基因的拷貝數(shù)，至少一個(gè)miRNA 基因如果在女性常染色體或性染色體上有多于兩個(gè)拷貝數(shù)，男性性染色體上有多于一個(gè)拷貝數(shù)可以提示食管癌。在某些情況下，我們分析SEQ ID編號(hào)15-38中的miRNA基因的拷貝數(shù)，至少一個(gè)miRNA基因如果在女性常染色體或性染色體上少于兩個(gè)拷貝數(shù)，男性性染色體上少于一個(gè)拷貝數(shù)可以提示食管癌。在某些情況下，方法還包括從疑似病例取得食管組織樣本的步驟。在某些情況下，方法還包括從組織樣本提取DNA的步驟。這里所描述的miRNA有如下作用根據(jù)食管癌組織樣本中一個(gè)以上miRNA的水平以及一個(gè)以上miRNA基因狀態(tài)來(lái)劃分食管癌病人類型、預(yù)測(cè)食管癌的進(jìn)展、監(jiān)測(cè)食管癌病人的病程和監(jiān)測(cè)食管癌病人的治療。在某些情況，我們提供用來(lái)檢測(cè)如圖1所示miRNA或它們的相應(yīng)類似物水平的系統(tǒng)(例如微陣列)，或提供用來(lái)檢測(cè)如圖1所示miRNA或它們的相應(yīng)類似物的基因狀態(tài)的系統(tǒng)(例如微陣列)。這些系統(tǒng)對(duì)于判定如圖1所示miRNA或它們的相應(yīng)類似物水平以及診斷食管癌十分有用。下面著重講述用以檢測(cè)miRNA水平的系統(tǒng)，但對(duì)于熟悉此類操作的人員來(lái)說(shuō)，亦可熟練掌握檢測(cè)miRNA基因狀態(tài)的系統(tǒng)。在某些情況，我們通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)(例如微陣列)來(lái)判定至少一個(gè)如圖1所示miRNA 或它們的相應(yīng)類似物(或者相應(yīng)的miRNA基因狀態(tài))的水平，系統(tǒng)由許多探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)食管組織樣本中的一個(gè)miRNA (或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))，至少有15 % (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))。在某些情況，我們通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)(例如微陣列)來(lái)診斷食管癌，系統(tǒng)由許多探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中的一個(gè)miRNA (或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))，至少有15 % (包括例如至少20 %、30 %、40 %、50 %、 60%、70%、80%、90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的miRNA(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))。在某些情況，我們通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)(例如微陣列)來(lái)診斷食管癌，系統(tǒng)由至少一個(gè) (包括例如至少2、5、10、15、20、25、30、35和40個(gè))探針(例如寡核苷酸)組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)如圖1中所示的miRNA水平(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))。下面將詳細(xì)描述這些系統(tǒng)(例如微陣列)。這些診斷食管癌的系統(tǒng)可以有多種作用。在某些情況，我們通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)來(lái)診斷食管癌，系統(tǒng)由至少一個(gè)(包括例如至少2、5、10、15、20、25、30、35和40個(gè))探針(例如寡核苷酸)組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)如圖1中所示的miRNA水平(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))，因而如圖1中所示的miRNA或它們相應(yīng)的類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))中至少一個(gè)的水平特征性變化可以提示食管癌。在某些情況，我們通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)(例如微陣列) 來(lái)診斷食管癌，系統(tǒng)由許多探針組成，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中一個(gè)miRNA(或相應(yīng)miRNA 的基因狀態(tài))的水平，因而至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80^^90%或95% )的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng) miRNA的基因狀態(tài))的水平，而如圖1中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA 的基因狀態(tài))的水平特征性變化可以提示食管癌。以下是關(guān)于制造系統(tǒng)所用的檢測(cè)miRNA的探針的描述。在某些情況，我們用一個(gè)或多個(gè)探針(例如寡核苷酸)來(lái)制造用以診斷個(gè)體食管癌的系統(tǒng)，每個(gè)探針可以檢測(cè)如圖1 中所示的miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))的水平。在某些情況， 我們用探針(例如寡核苷酸)來(lái)制造用以診斷食管癌的系統(tǒng)(例如微陣列)，每個(gè)探針可以檢測(cè)樣本中一個(gè)miRNA的水平(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))，至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)的探針能夠檢測(cè)如圖1中所示的 miRNA或它們的相應(yīng)類似物(或相應(yīng)miRNA的基因狀態(tài))的水平。診斷食管癌所涉及的miRNA現(xiàn)有的發(fā)明確定了 40個(gè)水平與食管癌相關(guān)的miRNA。如表2和圖1所示。圖1提供了這些miRNA的名稱、序列和染色體定位。可以通過(guò)http://miRNA. sanger. ac. uk/.(參 JAL Griffths-Jones et al. , Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34,Database issue)得到這些miRNA的信息。診斷食管癌的方法基于圖1所示的miRNA水平和基因狀態(tài)。這里所描述的系統(tǒng)就是用來(lái)監(jiān)測(cè)圖1所示的miRNA水平，進(jìn)而診斷食管癌。通過(guò)實(shí)踐，可以確定這些方法用以檢測(cè)單個(gè)miRNA的可接受靈敏度和特異性，然而當(dāng)檢測(cè)兩個(gè)以上miRNA時(shí)方法的有效性(例如靈敏度和特異性)將會(huì)大大提高。例如， 在某些情況下，至少要檢測(cè)圖1中的3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35或38號(hào)miRNA。
在某些情況下，我們至少檢測(cè)SEQ ID編號(hào)1_14中的兩個(gè)miRNA (例如至少是3、 5、10中的一個(gè))。在某些情況下，我們至少檢測(cè)SEQ ID編號(hào)15-38中的兩個(gè)miRNA (例如至少是3、5、10、15、20中的一個(gè))。在某些情況下，我們至少檢測(cè)SEQ ID編號(hào)1_14中的一個(gè)miRNA和SEQ ID編號(hào)15-38中的一個(gè)miRNA的基因狀態(tài)。在某些情況下，我們至少檢測(cè) SEQ ID編號(hào)1-14中的兩個(gè)miRNA (例如至少是3、5、10中的一個(gè))和SEQ ID編號(hào)15-38中的兩個(gè)miRNA(例如至少是3、5、10、15、20中的一個(gè))的基因狀態(tài)。在某些情況下，我們檢測(cè)圖1中所有miRNA的基因狀態(tài)。在某些情況下，需要判斷上述miRNA的相應(yīng)類似物的水平。上述miRNA的“相應(yīng)類似物”指的是和miRNA具有至少50%序列相似性的miRNA(也包括至少60%、70%、80%、 90 %、95%、98%和99%的序列相似性)。例如，SEQ ID NO 1號(hào)miRNA的相應(yīng)類似物具有和 SEQ ID NO :1號(hào)miRNA至少50%的序列相似性(也包括至少60%、70%、80%、90%、95%、 98%和99%的序列相似性)。和參考序列(SEQ ID NO :1號(hào)miRNA)具有95%以上相似性的miRNA可認(rèn)為和參考序列相同，除非每100個(gè)核苷酸有5個(gè)點(diǎn)突變。這5個(gè)點(diǎn)突變可以是缺失、替換、插入，可以在序列的任何地方發(fā)生，可以散布在參考序列中或者集中在參考序列一個(gè)或多個(gè)簇。基于miRNA水平的食管癌診斷方法在某些情況下，食管癌診斷方法是基于miRNA水平的。這里所說(shuō)的“水平”是指miRNA或其前體堆積的量或速度。這個(gè)詞可以指某個(gè)樣品中miRNA的絕對(duì)量(例如用雜交信號(hào)強(qiáng)度來(lái)表示)，也可以指樣品中miRNA量與對(duì)照的比值(例如用樣品比對(duì)照的雜交信號(hào)比值)。對(duì)照miRNA可以是同一樣本中水平相對(duì)恒定的不同的miRNA，也可以是不同樣本中的同一個(gè)miRNA(例如來(lái)自同一個(gè)體的非癌組織樣本， 或者另一個(gè)非食管癌個(gè)體的組織樣本)。miRNA分子的前體或“miRNA前體”指的是未剪切的miRNA基因轉(zhuǎn)錄子，典型的包括大約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的RNA轉(zhuǎn)錄子。miRNA前體被RNA酶(例如Dicer，Argonaut或者 RNA酶III)消化成為活性miRNA分子，典型的為19-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度?！笆彻芙M織樣本的miRNA水平”是指組織樣本的miRNA水平。在大多數(shù)情況下，食管組織樣本的miRNA水平是通過(guò)直接測(cè)量食管組織樣本的miRNA水平獲得，然而食管組織樣本的miRNA水平也可以通過(guò)淋巴結(jié)(例如鄰近的淋巴結(jié)或淋巴液)樣本、血漿、全血或者鄰近的體液如痰液來(lái)反映。在某些情況下，miRNA水平是通過(guò)淋巴結(jié)樣本(例如淋巴結(jié)活切或針吸)的miRNA水平來(lái)決定的。在某些情況下，miRNA水平是通過(guò)全血或血漿中的miRNA 水平來(lái)決定的。在某些情況下，miRNA水平是食管組織拉網(wǎng)的miRNA水平來(lái)決定的。在某些情況下，miRNA水平是通過(guò)內(nèi)窺鏡引導(dǎo)取樣所得樣本中的miRNA水平(例如RT-PCR分析) 來(lái)決定的。內(nèi)窺鏡引導(dǎo)的針吸(FNA)采樣是侵入性最小的技術(shù)，對(duì)于縱隔淋巴結(jié)非手術(shù)性取樣尤其適合，并可以進(jìn)行更詳細(xì)的分子標(biāo)志物分析。對(duì)非食管癌組織的miRNA水平分析可以單獨(dú)和與其它方法聯(lián)合使用。例如，可以首先確定血漿中的miRNA水平，然后分析區(qū)域淋巴結(jié)的miRNA水平，這樣多步驟的分析可以提供更豐富的信息并增加診斷的可信度?？梢栽诓煌臅r(shí)期檢測(cè)miRNA水平。例如，可以在術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后，以及腫瘤治療前、治療中、治療后檢測(cè)miRNA水平。在某些情況下，miRNA水平是由食管組織拉網(wǎng)所取得的樣本(特別是食管組織)中的miRNA水平來(lái)決定的。
測(cè)定miRNA水平的方法在文獻(xiàn)中有報(bào)道。例如，Northern斑點(diǎn)雜交，原位雜交， RT-PCR和微陣列。這些方法在文獻(xiàn)中有報(bào)道，例如Einat，Methods Mol. Biol. 2006,342 139-157 ；Thompson et al.，Genes Dev. 2006,20 :2202-2207.根據(jù)經(jīng)典方法，細(xì)胞的總RNA可以通過(guò)在核酸提取緩沖液的環(huán)境中胞質(zhì)勻漿化然后再離心獲取。核酸被沉淀，DNA通過(guò)DNA酶作用再離心后去除。RNA通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)用凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，進(jìn)行Northern斑點(diǎn)雜交等。RNA通過(guò)加熱固定在膜上。通過(guò)與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的DNA或RNA探針來(lái)鑒定和定量。在成相膜上通過(guò)放射自顯影方法也可以鑒定miRNA。掃描成相膜，可以對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄子的水平精確定量。也可以用光成像計(jì)算機(jī)計(jì)算方法對(duì)雜交斑點(diǎn)進(jìn)行RNA水平精確定量。除了 Northern和其他斑點(diǎn)雜交技術(shù)，RNA轉(zhuǎn)錄子水平還可以通過(guò)原位雜交來(lái)測(cè)定。這項(xiàng)技術(shù)是將整個(gè)細(xì)胞或組織固定在顯微鏡蓋玻片上，利用含有放射線標(biāo)記的探針或其他方式標(biāo)記探針(例如cRNA探針)的溶液來(lái)測(cè)定細(xì)胞或組織的核酸。miRNA水平也可通過(guò)對(duì)miRNA轉(zhuǎn)錄子逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 來(lái)檢測(cè)。miRNA的水平可以通過(guò)和內(nèi)參相比較來(lái)定量，內(nèi)參可以是同一樣本中看家基因的 mRNA等。用作內(nèi)參的適宜的看家基因包括肌球蛋白、3、磷酸甘油醛脫氫酶或人TO基因。在文獻(xiàn)中有定量RT-PCR及其他相關(guān)技術(shù)的描述。表1列出了 RT-PCR的常用引物。在某些情況下，實(shí)時(shí)RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miRNA比經(jīng)典的組織活切或在癌癥早期miRNA染色檢測(cè)方法更加靈敏。qRT-PCR檢測(cè)miRNA水平對(duì)于食管癌的診斷、分類和預(yù)后評(píng)估來(lái)說(shuō)是更靈敏和特異的方法?，F(xiàn)有的發(fā)明，提供了用RT-PCR來(lái)檢測(cè)個(gè)體(患有疾病，例如癌癥的個(gè)體) miRNA水平的方法。在某些情況下，miRNA水平用qRT-PCR方法來(lái)檢測(cè)。在某些情況下，miRNA水平用此文描述的微陣列來(lái)檢測(cè)。上述方法中所述的核酸探針可用體外重組或化學(xué)合成的方法獲得，這在文獻(xiàn)中已有報(bào)道。另外，雜交探針可用不同的標(biāo)記方法來(lái)標(biāo)記，例如放射性同位素、熒光物質(zhì)、報(bào)告系統(tǒng)酶、生物素和其他配體。這些可探測(cè)的標(biāo)記物還可以偶聯(lián)光學(xué)檢測(cè)物質(zhì)，進(jìn)而可以用光化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)。標(biāo)記和探測(cè)的探針在文獻(xiàn)中也有報(bào)道。用于檢測(cè)miRNA的核酸探針可以在嚴(yán)格條件下和樣本中的miRNA雜交。根據(jù)不同的方法，文獻(xiàn)中的成熟技術(shù)可以改變條件，從而優(yōu)化對(duì)特定樣本中特定miRNA的檢測(cè)?？偟膩?lái)說(shuō)，雜交物的穩(wěn)定性依賴于離子濃度和溫度。一般來(lái)說(shuō)，雜交反應(yīng)在低嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下進(jìn)行，然后在高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下洗滌。適度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交是指允許核酸分子例如探針和互補(bǔ)核酸分子雜交的條件。雜交的核酸分子至少有60%的相似性，也包括70%， 75 %，80 %，85 %，90 %，或95 %的相似性。適度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件等價(jià)于42°C在50 %甲酰胺、 ^cDenharfs 溶液、5xSSPE、0. 2% SDS 條件下雜交,然后 42°C用 0. 2xSSPE,0. 2% SDS 洗滌。 高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件可以是42°C在50%甲酰胺、5xDenhart~ s溶液、5xSSPE、0. 2% SDS條件下雜交，然后 65°C用 0. IxSSPE,0. 1% SDS 洗滌。低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交是指在與以下條件相當(dāng)?shù)碾s交條件下雜交10%甲酰胺、 5XDenhart' s 溶液、6XSSPE、0. 2 % SDS，22 °C 雜交，然后在 37 °C 用 1XSSPE、0.2% SDS 清洗。Denhart，s溶液含有Ficoll、l%聚乙烯苯三酚和牛血清。20XSSPE(氯化鈉、磷酸鈉、EDTA)含有3M氯化鈉、0. 2M磷酸鈉和0.025M EDTA。其他適當(dāng)?shù)闹卸葒?yán)謹(jǐn)性和高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交溶液和條件都為此領(lǐng)域內(nèi)的人熟知，他們也報(bào)道過(guò)，例如=Sambrooket al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd ed, Cold Sping Harbor Press, Plainview, N. Y. (1989) ；and Ausubel et al. , supra,1999)。具體地說(shuō)，miRNA的水平是在多于一個(gè)時(shí)間點(diǎn)從一個(gè)患者中獲得的。這種“連續(xù)的”取樣的方法很適合于對(duì)食管癌患者的癌癥發(fā)展進(jìn)行監(jiān)視。連續(xù)取樣可以根據(jù)需要在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，如每半年、每年、每?jī)赡昊蚋L(zhǎng)時(shí)間取樣一次。測(cè)量得到的水平與參考水平之間的比較可以每次測(cè)量一個(gè)新樣品后進(jìn)行，也可以獲得一定測(cè)量數(shù)據(jù)后再進(jìn)行。在此描述的方法，參考水平指的是某種miRNA通常被認(rèn)為“正常”的水平。有時(shí)候， 參考水平是指同一個(gè)人的非食管癌組織中的miRNA水平。有時(shí)候，是指沒有食管癌的人的水平。有時(shí)候是指一群沒有食管癌的人的水平的平均水平。有時(shí)候，參考水平來(lái)自于樣品庫(kù)，包括被測(cè)樣品本身。參考水平可以事先決定也可以在測(cè)量樣品的同時(shí)決定。在此使用的“參考”的值可以是絕對(duì)值，相對(duì)值，有上限或下限的值，一序列值，平均值，中值，中間值，或者與特定對(duì)照或基準(zhǔn)值比較的值。與參考值的比較可以是圖1 中 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，或 38 的任意miRNA或者他們的同源物。比較一個(gè)miRNA水平與參考水平的過(guò)程可以根據(jù)檢測(cè)組織中miRNA值的類型使用方便的方法進(jìn)行。例如，當(dāng)通過(guò)miRNA的雜交信號(hào)來(lái)檢測(cè)miRNA水平時(shí)，水平的比較可能通過(guò)肉眼定性地比較雜交信號(hào)的強(qiáng)弱。對(duì)于定量檢測(cè)，比較可能通過(guò)觀察數(shù)據(jù)，洞察數(shù)據(jù)所代表的涵義進(jìn)行(如，將觀察數(shù)據(jù)用圖形表示，諸如柱狀圖、線形圖之類)。比較的過(guò)程可以是手工(如通過(guò)專業(yè)的方法進(jìn)行視覺觀察)也可以是自動(dòng)的。有時(shí)候，對(duì)比是通過(guò)比較測(cè)量的和參考的水平的數(shù)量級(jí)進(jìn)行的(例如，比較“比值”或百分比的不同)。在此，“比值”指的是數(shù)字描述的miRNA測(cè)量值與參考值之間的數(shù)量級(jí)不同。在miRNA水平中一個(gè)“特征性的改變”可能是相對(duì)參考水平來(lái)說(shuō)患者中miRNA水平顯著的減少或增加?！帮@著的增加”在此指的是miRNA水平至少增加5%，包括例如至少 6%，7%，8%，9%，10%，15%，20%，30%，40%，50%或更多。類似的，“顯著的減少”指的是 miRNA 水平至少減少 5%，包括例如至少 6%，7%，8%，9%，10%，15%，20%，30%，40%， 50%或更多。圖1展示的是表示的miRNA改變的總結(jié)。miRNA水平特征性的改變是用來(lái)診斷食管癌的基礎(chǔ)。例如，有時(shí)候，當(dāng)SEQ ID Nos. 1-14中至少一個(gè)miRNA的水平確定了，測(cè)量的 miRNA水平至少一個(gè)顯著的增加就暗示有患食管癌的可能。有時(shí)候，當(dāng)SEQ ID Nos. 15-38中至少一個(gè)miRNA的水平確定了，測(cè)量的miRNA水平至少一個(gè)顯著的減少就暗示有患食管癌的可能。有時(shí)候，當(dāng)SEQ ID Nos. 1-14中至少一個(gè)miRNA的水平確定了和SEQ ID Nos. 15-38 中至少一個(gè)miRNA的水平確定了，SEQ ID Nos. 1_14中至少有一個(gè)顯著的增加和SEQ ID Nos. 15-38中至少有一個(gè)顯著的減少就暗示有患食管癌的可能。有時(shí)候圖1中所有的miRNA水平都決定了，SEQ ID Nos. 1-14中至少有一個(gè)顯著的增加和SEQ ID Nos. 15-38中至少有一個(gè)顯著的減少就暗示有患食管癌的可能。有時(shí)候， SEQ ID Nos. 1-14中至少有兩個(gè)顯著的增加和SEQ ID Nos. 15-38中至少有兩個(gè)顯著的減少就暗示有患食管癌的可能。在那些情況下，當(dāng)使用多于一個(gè)miRNA而這些miRNA的水平并不一致暗示患有食管癌時(shí)，“大多數(shù)”的指示可以被認(rèn)為是檢測(cè)結(jié)果。例如，當(dāng)使用5個(gè)miRNA時(shí)，其中3個(gè)暗示有食管癌，結(jié)果可以認(rèn)為暗示此人診斷為食管癌。然而，在某些情況下，食管癌的診斷需要至少一個(gè)或更多特異的miRNA特征性的變化。例如，假設(shè)一個(gè)miRNA是has-miR-16， has-miR-16水平顯著的增加可能是食管癌診斷的先決條件。基于miRNA基因水平的診斷方法有些情況下，基于圖1中至少一種miRNA或他們的同源物的基因在患者樣品中的水平可以提供多種食管癌診斷方法。有時(shí)候，基因水平的評(píng)估是通過(guò)分析至少一個(gè)miRNA基因在樣品中的刪除或擴(kuò)增，相對(duì)于對(duì)照樣品在miRNA基因中探測(cè)到刪除或擴(kuò)增則暗示此患者有患食管癌的可能。miRNA基因的刪除或擴(kuò)增可以通過(guò)檢測(cè)被懷疑患有食管癌的患者的食管癌組織細(xì)胞中基因的結(jié)構(gòu)或序列，然后與對(duì)照樣品的基因結(jié)構(gòu)或序列對(duì)比。任何適用于檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)或序列改變的技術(shù)都可以被用來(lái)實(shí)踐此方法。例如，miRNA基因刪除或擴(kuò)增可以通過(guò)基因組DNA的Southern Blot和miRNA序列特異性核酸探針雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)。也可以利用序列分析和單鏈構(gòu)象多態(tài)性。miRNA基因的刪除或擴(kuò)增也可以通過(guò)PCR擴(kuò)增這些基因片段來(lái)檢測(cè)，通過(guò)測(cè)序或電泳來(lái)分析從患者DNA樣品中擴(kuò)增出來(lái)的片段序列或者長(zhǎng)度是否與對(duì)照相同。miRNA基因的刪除也可以通過(guò)其附近的染色體標(biāo)記的刪除來(lái)鑒定。一個(gè)患者的細(xì)胞中的mi RNA基因水平也可以通過(guò)測(cè)量樣品中至少一個(gè)mi RNA基因的拷貝數(shù)來(lái)評(píng)估，其中基因只有一個(gè)拷貝數(shù)意味著此患者有患食管癌的可能，而不是體細(xì)胞染色體上和女性染色體上的兩個(gè)拷貝，也不是男性染色體上的一個(gè)拷貝。任何適用于檢測(cè)基因拷貝數(shù)的技術(shù)都可以應(yīng)用于此方法，包括Southern Blot和 PCR擴(kuò)增技術(shù)。還有一個(gè)確定食管癌組織樣品中miRNA拷貝數(shù)的方法是根據(jù)很多miRNA或基因簇都與染色體標(biāo)記或其他基因緊密相連?；颊咧幸粋€(gè)與標(biāo)記或其他雜合基因相連的 miRNA基因的丟失可以從雜合性或標(biāo)記基因的信息上得知。因此確定雜合性標(biāo)記的技術(shù)也可用于此方法?！皩?duì)照樣品”可以是來(lái)自沒有食管癌患者的組織樣品?；蛘呤莵?lái)自一群患者的組織樣品集合。圖1 中的miRNA 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，或 38任意一個(gè)或其同
源物的基因水平都可以確定。當(dāng)使用多于一個(gè)miRNA的基因水平但是并不一致表明有食管癌時(shí)，“大多數(shù)”的指示可以被認(rèn)為是檢測(cè)結(jié)果。例如，當(dāng)使用5個(gè)miRNA時(shí)，其中3個(gè)暗示有食管癌，結(jié)果可以認(rèn)為暗示此人診斷為食管癌。然而，在某些情況下，食管癌的診斷需要至少一個(gè)或更多特異的miRNA特征性的變化。有多種技術(shù)可以用來(lái)確定miRNA基因水平，例如包括為陣列上的等位基因特異性延伸，PCR/LDR通用陣列，基于微滴的單堿基鏈延伸，序列標(biāo)簽分子倒置探針和組合的雜交測(cè)序。食管癌病人的分類方法另一方面，這為食管病人提供了一個(gè)分類方法，例如，分化水平、腫瘤階段和病理的分類。具體來(lái)說(shuō)就是提供了一個(gè)食管病人(包括諸如確定分化的水平，確定腫瘤階段，和食管病人的病理分類)分類方法，包括檢測(cè)至少一種miRNA(例如表2中的miRNA或者他們的同源物)的水平或食管癌病人組織中的miRNA基因水平，在此miRNA的水平(或者相應(yīng)的miRNA基因水平)用來(lái)作為食管病人分類的基礎(chǔ)。這為確定食管癌患者中的分化水平提供了一種方法，包括圖加中的至少一種 miRNA(或相應(yīng)的基因)在患者的食管癌組織中的水平，在此miRNA(或相應(yīng)的基因)水平被用來(lái)作為確定食管癌分化水平的基礎(chǔ)。例如，通過(guò)測(cè)定的miRNA水平可以確定患者的高、 中、低分化水平。miRNA(或相應(yīng)的基因)水平與分化水平之間的關(guān)系也可以確定，例如，可以通過(guò)分析用已知的方法被分為不同分化水平的食管癌群體樣品的miRNA(或相應(yīng)基因) 的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。miRNA 可以是 hsa-miR-25，hsa_130b 和 hsa_miR-130a 的任意一個(gè)或他們的同源物，食管癌樣品中的miRNA水平與分化水平是相反的，也就是說(shuō)低水平的miRNA與高分化水平相關(guān)聯(lián)，而高水平的miRNA與低分化水平相關(guān)聯(lián)。有時(shí)候至少一個(gè)miRNA是hsa-miR-335。 有時(shí)候至少一個(gè)miRNA是hsa-miR-25。有時(shí)候至少一個(gè)miRNA是hsa_miR-130b。有時(shí)候至少一個(gè) miRNA 是 hsa-miR-130a。有時(shí)候至少一個(gè) miRNA 是 hsa_miR-181d。這為食管上皮細(xì)胞癌患者病理分類提供了一種方法，包括圖2b中的至少一種 miRNA (或相應(yīng)的基因)在患者的食管癌組織中的水平，在此miRNA (或相應(yīng)的基因)水平被用來(lái)作為患者病理的分類基礎(chǔ)。例如，某個(gè)患者有可能被確定為霉菌狀生長(zhǎng)或髓質(zhì)狀食管上皮細(xì)胞癌，這取決于檢測(cè)到的miRNA水平。miRNA(或相應(yīng)基因)的水平與癌癥不同的病理狀態(tài)之間的關(guān)系可以建立起來(lái)，例如，可以通過(guò)分析用已知的方法被分為不同病理類別的樣品的miRNA(或相應(yīng)基因)的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。這為確定食管癌患者內(nèi)的腫瘤階段提供了一種方法，包括圖2c中的至少一種 miRNA(或相應(yīng)的基因)在患者的食管癌組織中的水平，在此miRNA(或相應(yīng)的基因)水平被用來(lái)作為確定腫瘤階段的基礎(chǔ)。例如，某個(gè)患者有可能被確定為有I，II，或III階段的腫瘤，這取決于檢測(cè)到的miRNA水平。有時(shí)候某患者被確定有T1，T2，或T3階段的腫瘤，這也取決于檢測(cè)到的miRNA水平。有時(shí)候某患者被確定有NO或m階段的腫瘤，這也取決于檢測(cè)到的miRNA水平。miRNA(或相應(yīng)基因)的水平與腫瘤不同階段之間的關(guān)系可以建立起來(lái)， 例如，可以通過(guò)分析用已知的方法被分為不同腫瘤階段的樣品的miRNA(或相應(yīng)基因)的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。這里還提供了一些系統(tǒng)(例如微陣列)，這些系統(tǒng)包含了可以檢測(cè)表2(包括圖 2a, 2b, 2c中的任意miRNA或其同源物)中的miRNA的探針以及決定表2中miRNA的基因或其同源物的水平的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)在決定表2中miRNA (或其相應(yīng)的基因)水平和對(duì)食管癌患者進(jìn)行分類很有用。因此，這提供了一個(gè)確定表2中的至少一種miRNA或其同源物(或相應(yīng)的基因)水平的系統(tǒng)(例如微陣列)，在此系統(tǒng)中包含了多數(shù)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到一種 miRNA (或其基因)，至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%， 或95%)的探針可以檢測(cè)到表2中的miRNA或其同源物(或相應(yīng)的基因)。這為食管癌病人分類提供了一個(gè)系統(tǒng)(如微陣列)，在此系統(tǒng)中包含了多數(shù)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到一種 miRNA (或其基因)，至少 15% (包括 20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，或 95% )的探針可以檢測(cè)到表2中的miRNA或其同源物(或相應(yīng)的基因)。這為患有食管癌的患者分類提供了一個(gè)系統(tǒng)(如微陣列)，在此系統(tǒng)中包含了至少2，5，10，20，30，或40個(gè)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到表2中的一種miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因)。另外這里提供的系統(tǒng)還可以用來(lái)對(duì)食管癌病人進(jìn)行分類。例如，這里提供了一個(gè)有用的系統(tǒng)可以對(duì)患食管癌的患者進(jìn)行分類，在此系統(tǒng)中包含一個(gè)或多個(gè)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到一種表2中miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因)。這里提供了一個(gè)有用的系統(tǒng)可以用來(lái)確定食管癌分化的水平，此系統(tǒng)包含了一個(gè)或多個(gè)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到一種表或其同源物(或其相應(yīng)的基因)。這里提供了一個(gè)有用的系統(tǒng)可以用來(lái)對(duì)食管上皮細(xì)胞癌患者進(jìn)行病理分類，此系統(tǒng)包含了一個(gè)或多個(gè)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到一種表2b中miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因)。這里提供了一個(gè)有用的系統(tǒng)可以用來(lái)確定食管癌患者的腫瘤階段，此系統(tǒng)包含了一個(gè)或多個(gè)探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)到一種表2c中miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因)。還為制造提供所描述的用來(lái)檢測(cè)miRNA (或其相應(yīng)基因)的系統(tǒng)的探針。這里為制造提供了食管癌患者分類系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)探針，每個(gè)探針可以確定表2中的一個(gè)miRNA 或其同源物(或其相應(yīng)的基因)水平。這里為制造業(yè)提供了一個(gè)用來(lái)對(duì)食管癌患者進(jìn)行分類系統(tǒng)(如微陣列)的探針，每個(gè)探針可以檢測(cè)不同的miRNA(或其相應(yīng)基因)的水平，至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探針可以檢測(cè)表 2中的一種miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因)。這為確定食管癌分化水平的系統(tǒng)制造業(yè)提供了一種或更多探針，每種探針可以確定圖加中的一個(gè)miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因)水平。這為確定食管上皮細(xì)胞癌患者病理分類的系統(tǒng)制造業(yè)提供了一種或更多探針，每種探針可以確定圖2b中的一個(gè)miRNA 或其同源物(或其相應(yīng)的基因)水平。這為確定食管癌病人腫瘤階段的系統(tǒng)制造業(yè)提供了一種或更多探針，每種探針可以確定圖2c中的一個(gè)miRNA或其同源物(或其相應(yīng)的基因) 水平。預(yù)后的方法與組成及促進(jìn)食管癌患者的生存另一方面此發(fā)明為食管癌病人預(yù)測(cè)提供了方法，例如包括確定食管癌病人生存率的方法。此發(fā)明的預(yù)測(cè)方法在確定食管癌病人的治療過(guò)程方面很有用。例如，確定生存的可能性可以幫助決定使用保守療法還是激進(jìn)療法，或各種藥征是否可以結(jié)合使用。另外，這種預(yù)后可以幫助決定改進(jìn)生存的藥劑(如這里提到的藥劑)是否是必要或是否有效。這里為食管癌患者預(yù)后生存概率提供了方法，包括(a)確定患者的食管癌組織樣品中至少一種miRNA的水平和(b)將上述樣品的miRNA水平與閾值進(jìn)行比較，其中與閾值比較的miRNA水平與患者生存相關(guān)聯(lián)或反相關(guān)聯(lián)。此處的“相關(guān)聯(lián)”指的是與閾值相比低水平的miRNA暗示低生存率，反之亦然。此處的“反相關(guān)聯(lián)”指的是與閾值相比高水平的 miRNA暗示高生存率，反之亦然。有時(shí)候，至少一種miRNA是調(diào)節(jié)目的基因的miRNA，目的基因是從一組基因里選出來(lái)的，包括PPP6C，SATB2, CHSTl 1, CRELD1, ESRRA, MTMR4, RNF125 ；SYNJl, TAF5, YWHAH, ZYX, CHSTl 1，KIAA1033, TGFBR3, SNRK, RNF125, AXIN2, CAPZA2, SYNJl, DLLl，YWHAH, MTMR4, PPP6C, CAMKV,禾P TAF5, PPPlCB, P0U4F2, MYHl，MYH2, T0P2B, STX17, GBAS, MYH4, CPSF4, EIF4EBP3, LHX4, CLK3, CAPN6, KIAA1622, AUH, PPIF, KCNK3, IL6R, CSNK2A2, ZNF579, NRGN, CUL3, CIB2, ZBTB26, GPBPl，TMEM16D, HOXAl，CAMTA1，MCM3AP，MPPED2, H00K2, PLAU, MCFD2, BLCAP, DHX15, FBNl，NC0A6, SNRPC, CCK, SFRS15, TMODl，GPRC5B, ZNF403, DCUN1D5, ZNF423, 和GPR64。有時(shí)候，至少一種miRNA可以調(diào)節(jié)選自于以下一組基因的目的基因PPP6C， SATB2, CHSTl 1，CRELDl，ESRRA, MTMR4, RNF125 ；SYNJl，TAF5, YWHAH，禾口 ZYX.。有時(shí)候，至少一種miRNA可以調(diào)節(jié)選自于以下一組基因的目的基因CHST11，KIAA1033, TGFBR3, SNRK, RNF125, AXIN2, CAPZA2, SYNJl, DLLl, YWHAH, MTMR4, PPP6C, CAMKV，禾口 TAF5。有時(shí)候，至少一種miRNA可以調(diào)節(jié)選自于以下一組基因的目的基因PPP1CB，P0U4F2，MYH1，MYH2，T0P2B, STX17, GBAS, MYH4, CPSF4, EIF4EBP3, LHX4, CLK3, CAPN6, KIAA1622, AUH, PPIF, KCNK3, IL6R, CSNK2A2, ZNF579, NRGN, CUL3, CIB2, ZBTB26, GPBPl，TMEMl6D，HOXA1，CAMTA1，MCM3AP， MPPED2，H00K2，PLAU，MCFD2，BLCAP，DHX15，F(xiàn)BNl，NC0A6，SNRPC，CCK，SFRS15，TMOD1，GPRC5B， ZNF403, DCUN1D5, ZNF423，和GPR64.有時(shí)候，miRNA相應(yīng)的基因位于5、10、9號(hào)染色體中的任意一條上。有時(shí)候，miRNA是圖3中的任意一個(gè)或者是他們的同源物。有時(shí)候，至少一個(gè) miRNA 是 hsa-miR-103。有時(shí)候，至少一個(gè) miRNA 是 has-miR-107.有時(shí)候，至少一個(gè) miRNA 是 has-miR-23b.這里為食管癌患者預(yù)后生存概率提供了方法，包括(a)確定患者的食管癌組織樣品中至少一種miRNA的水平和(b)將上述樣品的miRNA水平與閾值進(jìn)行比較， 其中與閾值比較的miRNA水平與上述患者生存反相關(guān)聯(lián)，這其中至少一個(gè)miRNA是 hsa-miR-103，hsa-miR-107，或hsa-miR-2;3b或他們相應(yīng)的同源物。有時(shí)候，至少一個(gè)miRNA 是hsa-miR-103。有時(shí)候，至少一個(gè)miRNA是has-miR-107。有時(shí)候，至少一個(gè)miRNA是 has-miR-23b.這里敘述的miRNA水平也有可能反映了 miRNA基因水平的變化(如這里描述的 miRNA)。有時(shí)候，這為患有食管癌的患者提供了一個(gè)預(yù)后的方法，包括分析至少一種miRNA 基因的水平(如與hsa-miR-103，hsa-miR-107，和hsa_miR-2;3b相應(yīng)的或其同源物的miRNA 基因)，其中與對(duì)照樣品比較基因水平的改變暗示著高或低生存率。例如，有時(shí)候，這為患有食管癌的患者提供了一個(gè)預(yù)后的方法，包括分析至少一種與hsa-miR-103，hsa-miR-107，和 hsa-miR-23b相應(yīng)的擴(kuò)增的miRNA基因，其中相對(duì)對(duì)照miRNA基因而言，擴(kuò)增的miRNA基因與低生存率相關(guān)聯(lián)。有時(shí)候，這為患有食管癌的患者提供了一個(gè)預(yù)后的方法，包括確定至少一種與hsa-miR-103，hsa-miR-107，和hsa_miR-23b相應(yīng)的miRNA基因的拷貝數(shù)，其中拷貝數(shù)多于2的暗示低生存率。另外還提供了一種方法，即利用能夠檢測(cè)miRNA(或其相應(yīng)的基因)水平的探針或含有一種或多種探針的系統(tǒng)來(lái)預(yù)后。例如，有時(shí)候，利用一種或多種探針(或含有一種或多種探針的系統(tǒng))來(lái)確定食管癌患者的生存幾率，其中的探針能夠檢測(cè)樣品中的miRNA，與閾值相比其miRNA水平與上述患者的生存幾率相關(guān)聯(lián)或反相關(guān)聯(lián)。有時(shí)候，這提供了一種或多種用來(lái)為食管癌患者預(yù)后的探針，與閾值相比miRNA水平與上述患者的生存幾率呈反相關(guān)聯(lián),其中至少一種miRNA是hsa-miR-103，hsa-miR-107，或hsa_miR-2;3b或他們相應(yīng)的同源物。這里為試劑(或系統(tǒng))的制造提供了一種或多種探針，此試劑(或系統(tǒng))可以用來(lái)為患有食管癌的患者預(yù)后，這些探針可以檢測(cè)樣品中的miRNA水平，與閾值相比其miRNA 水平與上述患者的生存幾率相關(guān)聯(lián)或反相關(guān)聯(lián)。有時(shí)候，這里提供了一種或多種探針，可以用來(lái)為患有食管癌的患者預(yù)后，與閾值相比其miRNA水平與上述患者的生存幾率反相關(guān)聯(lián)，其中至少一種miRNA是hsa-miR-103，hsa-miR-107,或hsa_miR-2;3b或他們相應(yīng)的同源物。此發(fā)明也為患有食管癌的人改善生存狀態(tài)提供了方法。具體的說(shuō)，包括給患者服用有效劑量的藥物來(lái)減低miRNA水平，與閾值相比，此miRNA的水平與上述患者的生存幾率呈反相關(guān)。這里為藥劑制造商提供了一種藥劑，使用此藥劑可以降低miRNA水平從而改善患有食管癌的患者的生存狀況，與閾值相比，此miRNA水平與上述患者的生存幾率呈反相關(guān)聯(lián)。這為患有食管癌的患者改善生活狀況提供了一個(gè)方法，包括給患者服用有效劑量的藥物來(lái)減低miRNA水平，此miRNA選自于包括hsa-miR-103，hsa-miR-107,或 hsa-miR-23b或他們相應(yīng)的同源物的一組miRNA。這里為藥劑制造商提供了一種改善患有食管癌的患者的生存狀況的藥劑，此藥劑可以降低上述miRNA的水平。在此敘述的方法可能首先考慮為患者預(yù)后(例如用此處提到的方法)，再考慮藥劑的給予。有時(shí)候，多于一個(gè)miRNA的水平有下降。這可以通過(guò)利用例如減低兩種或多種 miRNA水平的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。也可以使用兩種或多種藥劑來(lái)減低兩種或多種miRNA的水平。 例如，有時(shí)候，這為患有食管癌的患者改善生活狀況提供了一個(gè)方法，包括給患者服用有效劑量的一種或多種藥物來(lái)減低至少兩種miRNA水平，這些miRNA選自于包括hsa-miR-103， hsa-miR-107，或hsa-miR-2;3b或他們相應(yīng)的同源物的一組miRNA。有時(shí)候，這里為藥劑制造商提供了一種或多種改善患有食管癌的患者的生存狀況的藥劑，此藥劑可以降低至少兩種 miRNA 的水平，這些 miRNA 選自于包括 hsa-miR-103，hsa-miR-107，或 hsa_miR-23b 或他們相應(yīng)的同源物的一組miRNA。有時(shí)候，這為患有食管癌的患者改善生活狀況提供了一個(gè)方法，包括給患者服用有效劑量的一種或多種藥物來(lái)減低hsa-miR-103，hsa-miR-107,或 hSa-miR-2;3b的水平。有時(shí)候，這里為藥劑制造商提供了一種或多種改善患有食管癌的患者的生存狀況的藥劑，此藥劑可以降低hsa-miR-103，hsa-miR-107，或hsa-miR-23b的水平。這里提供了一種降低miRNA水平的藥物組分和一種藥劑學(xué)上可以接受的載體，其中至少一種 miRNA 為 hsa-miR-103，hsa-miR-107，或 hsa-miR-23b。有時(shí)候，至少一種 miRNA 為hsa-miR-103。有時(shí)候，至少一種miRNA為hsa-miR-107。有時(shí)候，至少一種miRNA為 hsa-miR-23b。有時(shí)候，此藥劑是雙鏈RNA(例如短的或小干擾RNA或“siRNA”)，反義核酸鏈，或具有酶活性的RNA分子如核酶。改善生活狀況的方法將在下文詳述。這里所說(shuō)的生存狀況可以是無(wú)疾病的生存狀況或者是全面的生存狀況。在此，“無(wú)病生存狀況”是指不出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和/或擴(kuò)散以及診斷后個(gè)體的命運(yùn)，例如，某個(gè)人從此以后腫瘤不復(fù)發(fā)。“總生存狀況”是指患者診斷后的命運(yùn)，無(wú)論腫瘤復(fù)發(fā)與否。生存預(yù)后一些為生存者預(yù)后的方法及在此描述的方法是基于相對(duì)閾值的miRNA水平的基礎(chǔ)上的。閾值可以通過(guò)多種方法來(lái)決定，假設(shè)閾值可以提供一條界線，應(yīng)該存在一組miRNA 水平高于閾值的病人生存率與另一組miRNA水平低于閾值的病人生存率不同。閾值可以通過(guò)非癌的食管癌組織樣品中的miRNA水平來(lái)確定。也可以通過(guò)分析患有食管癌的人群的miRNA水平來(lái)決定。這可以通過(guò)柱狀圖分析來(lái)完善，圖中將一群被檢測(cè)的人的數(shù)據(jù)展示出來(lái)，其中一條軸表示miRNA水平，另一條表示個(gè)體的存活率。兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的群體可以通過(guò)相同或不同miRNA水平分為不同亞群來(lái)確定。例如，在某些情況下，閾值可以基于一群高存活率的人和一群低存活率的人的miRNA的平均水平的基礎(chǔ)之上。閾值也可以代表兩種或多種miRNA。這可以通過(guò)每種miRNA水平的比率來(lái)體現(xiàn)。閾值可以是一個(gè)單個(gè)數(shù)字，可以運(yùn)用于每一個(gè)食管癌患者，或根據(jù)具體的亞群不同而不同。例如，上了年紀(jì)的男人可能與年輕男人的閾值不同，女人可能與男人的閾值不同。更進(jìn)一步，一個(gè)閾值可以是為一個(gè)人確定的。例如，閾值可能是一個(gè)確定的比率，即同一個(gè)人中食管癌組織相對(duì)非癌組織的miRNA水平的比率。閾值能將低于閾值和高于閾值的食管癌病人生存概率區(qū)分開，這可以通過(guò)單變量或多變量分析來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些方法確定一個(gè)或多個(gè)變量與給定的結(jié)果之間的可能關(guān)系。在特殊情況下，這些方法可以確定一個(gè)miRNA水平與癌癥患者無(wú)疾病或全面的生存狀況之間的可能聯(lián)系。任何在這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)為人們所熟知的可以用來(lái)進(jìn)行此類分析的方法都可以利用。單變量分析的例子如 Kaplan-Meir 法或 the Cox proportional-hazards regression model ο例如通過(guò)柱狀圖來(lái)確定基于人群的閾值，可以用一群足夠數(shù)量的病人來(lái)確定兩組或多組獨(dú)立的具有不同水平miRNA的病人。典型的，這樣一群人包括至少25個(gè)病人，包括至少50，75，100，125，150，或200個(gè)。類似地，確認(rèn)閾值可以包括至少25個(gè)病人，包括至少 50,75,100，125，150，或 200 個(gè)。更進(jìn)一步，一個(gè)閾值可以分離兩組病人，可能存在多個(gè)閾值可以分離大量病人。例如，兩個(gè)閾值可以首先分離一組高水平miRNA的病人，然后分離一組中等水平的病人，剩下一組低水平的病人。一定數(shù)量的不同閾值可以描述一條曲線，例如一條連續(xù)的線，可以描述病人無(wú)疾病的或全面的生存狀況的可能性。這種曲線構(gòu)成一個(gè)“連續(xù)”的miRNA水平，病人無(wú)疾病生存或全面生存狀況的可能性與其體內(nèi)miRNA水平成比例。兩種或多種miRNA水平可以由此曲線來(lái)展現(xiàn)。在某些情況下，在此項(xiàng)為癌癥病人預(yù)后的發(fā)明中miRNA之間可能相互組合。兩種或多種miRNA的組合為預(yù)后決定起了更重要的作用。miRNA水平也可以用來(lái)與其他變量相結(jié)合，此變量可能是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要意義，暗示食管癌病人的無(wú)疾病或全面的生存狀況的可能性，例如病理暗示(例如年齡，腫瘤大小，腫瘤組織學(xué)，臨床階段，家族史等等)。例如，癌癥的臨床階段在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有暗示無(wú)疾病或全面生存的重要意義，在此閾值可能根據(jù)在不同的臨床階段而不同。因此，miRNA的閾值可能根據(jù)另一個(gè)指示參數(shù)的不同而不同。在一個(gè)模范方法中，Kaplan-Meier分析用來(lái)確定生存率與miRNA水平之間的關(guān)系。在某些情況下，此方法包括(a)檢測(cè)個(gè)體中食管癌組織中至少一種miRNA的水平，(b)將個(gè)體分成第一組和第二組，其中第一組具有低水平的miRNA和更大的生存可能，第二組具有高水平的miRNA和較小的生存可能，在此至少一種miRNA為hsa-miR-103， hsa-miR-107, hsa-miR-23b.確定一種或多種miRNA的水平并與閾值進(jìn)行比較后，就可以將病人分到相應(yīng)的無(wú)疾病或全面生存可能性的組。然后此病人無(wú)疾病或全面生存的可能性就有哪一組人無(wú)疾病或全面生存的可能性來(lái)確定。例如，一個(gè)樣品可以被認(rèn)為具有低水平的miRNA。這個(gè)病人則被分到低水平miRNA 的病人組。因?yàn)橐呀?jīng)確定高水平miRNA的病人具有更高的無(wú)疾病或全面的生存狀況的可能性，所以特定的病人可能會(huì)被認(rèn)為具有更高的無(wú)疾病或全面的生存狀況的可能性。在此描述的方法可以進(jìn)一步為個(gè)人確定合適的治療過(guò)程。此領(lǐng)域內(nèi)其中一個(gè)常用的方法就是為癌癥病人預(yù)后，癌癥早期和癌癥晚期患者不一樣。例如，為I階段的癌癥患者預(yù)后可能傾向于癌癥繼續(xù)生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，而對(duì)IV階段的癌癥患者則可能傾向于有效的癌癥治療方法。合適的治療方式的確定會(huì)考慮這些變數(shù)。改善生存狀態(tài)的方法與措施這里還提供改善癌癥患者生存狀況的方法，這通過(guò)使用減少特定miRNA水平的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如圖3所示的miRNA。任何可以減少miRNA水平的藥劑都可以用于此發(fā)明的方法。合適的抑制miRNA基因表達(dá)的藥劑包括雙鏈RNA (例如短的或小干擾RNA或稱“siRNA”)，反義核酸，具有酶活性的RNA分子如核酶，小分子復(fù)合物和蛋白質(zhì)。這些藥物可以單獨(dú)使用也可以結(jié)合使用(例如這里提到的其他藥物)。這些藥物可以直接(如抑制miRNA的表達(dá)或功能)或間接(如通過(guò)影響miRNA基因的水平)地降低miRNA的水平。例如，一個(gè)給定的miRNA的表達(dá)可以通過(guò)雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)的RNA干擾抑制， 此雙鏈RNA分子與miRNA基因產(chǎn)物有至少70 %，包括至少75 %，80 %，85 %，90 %，95 %， 98 %，99 %，或100 %的序列同源性。在某些情況下，雙鏈RNA就是“短的或小干擾RNA”或稱 “siRNA”。在當(dāng)前的方法中使用的siRNA由10_30bp的雙鏈RNA組成，包括例如12_28， 14-26，16-24，或18-22任意一種。siRNA包含一條有義RNA鏈和一條反向互補(bǔ)的RNA鏈，二者通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)原則結(jié)合在一起。有義鏈包含一段與目標(biāo)miRNA中的核酸序列互補(bǔ)的序列。siRNA的有義和反義鏈可以包含兩條互補(bǔ)的、單鏈RNA分子，或只包含一個(gè)單一的分子，它的互補(bǔ)部分有一條鏈通過(guò)堿基配對(duì)合共價(jià)連接形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)而形成。通過(guò)單個(gè)或多個(gè)堿基的插入、缺失、替換、變異等，siRNA與天然的RNA不同。這種變異包括非核苷物質(zhì)的插入，例如在siRNA的末端或者是一、兩個(gè)核苷內(nèi)，或是的siRNA抵制核酶消化的修飾。在某些情況下，siRNA的一條或兩條鏈也包含3 ‘突出末端。siRNA可以通過(guò)化學(xué)合成或生物合成得到，或者通過(guò)重組質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)得到，這將在下文詳述。給定miRNA的表達(dá)可以被反義核酸抑制。此處的“反義核酸”指的是通過(guò)RNA-RNA 或RNA-DNA相互作用，與目標(biāo)RNA結(jié)合的核酸分子，這樣就改變了目標(biāo)RNA的活性。適用于目前的方法的反義核酸是與miRNA毗鄰的序列互補(bǔ)的單鏈核酸(例如，RNA, DNA, RNA-DNA嵌合體，PNA，和LNA)。在某些情況下，反義核酸是至少有70%，75%，80%，85%，90%，95%， 或100%與miRNA的毗鄰序列互補(bǔ)的核酸序列。在某些情況下，反義核酸有10-30個(gè)核苷， 包括例如12-28，14-26，16-24，或18-22個(gè)核苷。反義核酸也可以在核酸骨架或糖或堿基上有特定的修飾來(lái)增強(qiáng)靶標(biāo)特異性、核酶抵抗力、運(yùn)輸或其他與效率相關(guān)的特征。這些修飾包括膽固醇、相互作用如吖啶或包含一個(gè)或多個(gè)核酶抵制組。反義核酸可以通過(guò)化學(xué)方法或生物方法產(chǎn)生，或者也可以從重組質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)得到。這將在下文詳述。給定miRNA的基因表達(dá)也可以被具有酶活性的核酸抑制。這里的“具有酶活性的核酸”指的是包含底物結(jié)合區(qū)域的核酸，此區(qū)域與miRNA毗鄰的核酸序列互補(bǔ)，特異性地裂解miRNA。在某些情況下，酶活性的核酸的結(jié)合區(qū)域與miRNA毗鄰區(qū)域50-100%互補(bǔ)，包括如75-100%或95-100%互補(bǔ)。酶活性的核酸也可以在堿基、糖基、或磷酸基包含有修飾。一個(gè)典型的用于當(dāng)前方法的具有酶活性的核酸就是核酶。具有酶活性的核酸可以通過(guò)化學(xué)方法或生物方法產(chǎn)生，或者也可以從重組質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)得到。這將在下文詳述。將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞，包括癌細(xì)胞，的方法在此領(lǐng)域內(nèi)有很多。這些方法包括顯微注射，電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，微粒轟擊，膠質(zhì)散射系統(tǒng)傳遞(例如大分子復(fù)合物，珠子，水中的油乳液，膠束，混合膠束和脂質(zhì)體)，以及與抗體結(jié)合，gramacidinS，人造病毒顆?；蚱渌d體如TAT。利用合適的載體也可以在活體內(nèi)或活體外將核酸藥物導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。合適的載體包括病毒載體和非病毒載體如質(zhì)粒載體。這種載體對(duì)提供治療劑量的藥劑如反義 RNA或siRNA很有用處。基于病毒的系統(tǒng)具有一個(gè)優(yōu)勢(shì)能夠?qū)⑾鄬?duì)高水平的異質(zhì)核酸導(dǎo)入到不同的細(xì)胞中。介導(dǎo)核酸的合適的病毒載體包括，例如皰疹單純病毒載體，牛痘病毒載體，細(xì)胞巨化病毒載體，鼠白血病病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。 病毒載體的定向運(yùn)動(dòng)也可以通過(guò)對(duì)載體用其他病毒的包膜蛋白或表面抗原來(lái)修飾。例如， AAV載體可以被狂犬病泡狀病毒(VSV)、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白修飾。此發(fā)明中的核酸或載體可以含有任意的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，從而可以通過(guò)添加刺激或分子控制反義RNA或siRNA的表達(dá)。這種可誘導(dǎo)系統(tǒng)包括例如四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，重金屬誘導(dǎo)的金屬硫蛋白，蛻皮激素誘導(dǎo)的昆蟲類固醇激素或相關(guān)類固醇如幕黎甾酮， 類固醇如糖皮質(zhì)激素和雌激素誘導(dǎo)的鼠乳腺瘤病毒(MMTV)以及溫度改變誘導(dǎo)的熱激啟動(dòng)子。一種藥劑能夠降低miRNA水平的劑量即為有效劑量。在某些情況下，藥劑可以降低miRNA水平與閾值之間差異的10%，20%，30%，40%，或50%。藥物(如核酸藥物)典型的劑量包括 0. l-3000mg/kg 體重，10-2000mg/kg 體重，50-1000mg/kg 體重，100-500mg/kg 體重，但并不局限于這個(gè)范圍。在某些情況下，藥物(如任意的核酸藥物)的劑量大約為 10-500mg/g 腫瘤，例如 20-300mg/g 腫瘤，50_200mg/g 腫瘤，和 100_150mg/g 腫瘤.此領(lǐng)域內(nèi)有一種常用的技術(shù)可以很容易地確定一個(gè)人治療使用的合適劑量。藥劑的經(jīng)典頻率包括至少每三周一次，每?jī)芍芤淮?，每周一次，每周兩次，每周三次，每周四次?每周五次，每周六次或每天一次，但并不局限于這些。在某些情況下，每次用藥的時(shí)間間隔少于一個(gè)星期，包括6，5，4，3，2，1天。在某些情況下，每次用藥時(shí)間間隔是不變的。例如， 可以是每天，每?jī)商欤咳?，每四天，每五天，或每周。在某些情況下，可以是每天兩次，每天三次或更多。用藥時(shí)間可以很長(zhǎng)，如從一個(gè)月到三年。例如，劑量給藥可以延長(zhǎng)到2，3，4，5，6，7， 8,9,10，11，12，18，24，30，和36個(gè)月。在某些情況下，給藥安排不能停。在某些情況下，用藥的間隔不能長(zhǎng)于一星期。再次描述的合成物可以通過(guò)常規(guī)途徑給藥，包括但不局限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過(guò)皮膚，通過(guò)胸膜，局部的，吸入，通過(guò)粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。這里還提供藥物復(fù)合物，包含一種減低miRNA水平的成分和制藥學(xué)上可以接受的載體。在某些情況下，以上miRNA選自于hsa-miR-103，hsa-miR-107, hsa_miR-23b或他們的同源物。在某些情況下，至少一種是hsa-miR-103。在某些情況下，至少一種是 hsa-miR-107 ο在某些情況下，至少一種是hsa_miR-23b。在某些情況下，此成分是siRNA。 在某些情況下，此成分是反義RNA。在某些情況下，此成分是核酶。在某些情況下，藥物成分是無(wú)菌的。在某些情況下，藥物成分是無(wú)熱源的。合適的制藥學(xué)上可以接受的載體有水，水緩沖液，常規(guī)的鹽，0.4%的鹽，0.3%的鹽和透明質(zhì)酸。藥物成分還可能包括傳統(tǒng)的藥物學(xué)賦形劑，和/或添加劑。合適的藥物學(xué)賦形劑包括穩(wěn)定劑，抗氧化劑，滲透度調(diào)節(jié)劑，緩沖液，PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括生理學(xué)生物合適的緩沖液，附加螯合掩蔽劑(如DTPA或DTPA雙酰胺)或鈣螯合復(fù)合物(如DTPA， CaNaDTPA雙酰胺)或鈣或鈉鹽(氯化鈣，抗壞血酸鈣，葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)。此發(fā)明的藥物成分可以用液體形式包裝或凍干。此發(fā)明的固體藥物成分，可以用傳統(tǒng)的制藥學(xué)上可接受的無(wú)毒載體，例如，制藥等級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等等。miRNA水平檢測(cè)系統(tǒng)和/或miRNA基因水平檢測(cè)系統(tǒng)此發(fā)明為檢測(cè)食管癌病人中有特征性改變的miRNA水平提供了多種系統(tǒng)，還提供了確定miRNA基因狀況的系統(tǒng)。如上所述，這些系統(tǒng)可以用于多種目的，包括食管癌診斷， 食管癌病人分類，和為食管癌病人預(yù)后。此處描述的系統(tǒng)包括檢測(cè)miRNA和/或miRNA基因狀態(tài)的探針。以下的討論集中在能夠檢測(cè)miRNA的系統(tǒng)，具有此領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)的人很容易理解此處描述的特定方面也適用于包含可以檢測(cè)基因缺失，擴(kuò)增或miRNA基因拷貝數(shù)改變的探針的系統(tǒng)。例如，在某些情況下，這里提供了一個(gè)包含多數(shù)探針的系統(tǒng)，每一個(gè)探針可以檢測(cè)樣品內(nèi)不同的 miRNA，其中至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%， 或95%)的探針可以檢測(cè)圖1，表2或圖3中的miRNA或其同源物。在某些情況下，此系統(tǒng)包含至少2，5，10，20，30，40，或50種探針，其中每種探針可以檢測(cè)圖1，表2或圖3中的一種miRNA或其相應(yīng)同源物。在某些情況下，這里提供了一個(gè)包括多數(shù)探針的系統(tǒng)，其中每個(gè)探針可以檢測(cè)樣品中的一個(gè) miRNA，其中至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95%)的探針可以檢測(cè)圖1中的miRNA或其同源物。在某些情況下，此系統(tǒng)包含至少2，5， 10，20，30，40，或50種探針，其中每種探針可以檢測(cè)圖1中的一種miRNA或其相應(yīng)同源物。應(yīng)用中，提供有多種探針組成的體系，其中每個(gè)探針能檢測(cè)樣品中一個(gè)不同的 miRNA,至少 15 % (包括至少 0 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，或 95 % )的探針能檢測(cè)表2 (包括圖2a，2b，和2c中的任何miRNA)中的一個(gè)miRNA。應(yīng)用中，該體系至少有2，5，10，20，30，或40個(gè)探針組成，其中每個(gè)探針能檢測(cè)表2中的miRNA或他們的同源物 (包括圖2a，2b，和2c中的任何miRNA)。實(shí)際應(yīng)用中，提供有多種探針組成的體系，其中每個(gè)探針能檢測(cè)樣品中一個(gè)不同的 miRNA，至少 15% (包括至少 0%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探針能檢測(cè)圖3中的一個(gè)miRNA或他們的同源物。實(shí)際應(yīng)用中，該體系至少有1，2，3，6，9， 12，15，18，or 21個(gè)探針組成，其中每個(gè)探針能檢測(cè)圖3中的miRNA。這里描述的體系中用兩個(gè)以上的探針檢測(cè)相同miRNA。例如，在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)體系是芯片，探針以多種拷貝(如2，3，4，5，6，7或更多)存在。應(yīng)用中，體系中不同探針檢測(cè)相同siRNA。例如，這些探針結(jié)合到miRNA的不同區(qū)域(重疊或非重疊)。在一些例子中，探針是寡聚核苷酸。為了檢測(cè)miRNA，一定的序列變異是可以接受的。這樣，寡聚核苷酸的序列(或者他的互補(bǔ)序列)與miRNA可以存稍微的不同。專業(yè)技術(shù)人員知道，這種序列變異并不能顯著影響寡核苷酸確定miRNA水平的能力。例如，寡核苷酸的同源物和變異體用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)，確定相對(duì)高的序列相似性。發(fā)明中的寡核苷酸與miRNA序列至少有40% (包括50%，60%，70%，80%，90%，95%或更多)的相似性。應(yīng)用中，部分寡核苷酸用于檢測(cè)miRNA和其他蛋白，其他部分用于寡核苷酸與基質(zhì)結(jié)合。應(yīng)用中，其他部分由非特異序列(如PolyT)組成，增加互補(bǔ)序列部分與基質(zhì)表面的距離。系統(tǒng)中的寡聚核苷酸包括DNA，RNA, PNA, LNA,以上的結(jié)合體或者修飾形式。他們也包括采用修飾的寡聚核苷酸作為主體。在一些例子中，寡聚核苷酸至少由9，10，12，13， 14，15，16，17，18，19，20或更多的與miRNA互補(bǔ)或相同的寡聚核苷酸組成。單個(gè)的寡聚核苷酸由兩個(gè)以上的互補(bǔ)序列組成。在一些例子中，活性組分(如氨基)與寡聚核苷酸的5’或 3’端結(jié)合，使之能與基質(zhì)結(jié)合。在一些例子中，體系是布有探針的微陣列芯片。微陣列芯片和芯片，可以交換使用，其表面是個(gè)陣列，一個(gè)規(guī)則陣列，分布著性質(zhì)不確定的生化樣品的假定結(jié)合(雜交)位點(diǎn)。在一些實(shí)際應(yīng)用中，芯片是固定在基質(zhì)特定位置上的不同寡聚核苷酸的集合。例如，應(yīng)用中，提供由多種探針組成的芯片，其中每個(gè)探針能檢測(cè)樣品中一個(gè)不同的 miRNA，至少 15% (包括至少 0%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探針能檢測(cè)圖1，表2，或圖3中的一個(gè)miRNA以及他們的同源物。應(yīng)用中，提供由多種探針組成的芯片，其中每個(gè)探針能檢測(cè)樣品中一個(gè)不同的miRNA，至少15% (包括至少0%， 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或95% )的探針能檢測(cè)圖1中的一個(gè)miRNA以及他們的同源物。應(yīng)用中，提供由多種探針組成的芯片，其中每個(gè)探針能檢測(cè)樣品中一個(gè)不同的 miRNA，至少 15% (包括至少 0%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探針能檢測(cè)圖1，表2中的一個(gè)miRNA以及他們的同源物。應(yīng)用中，提供由多種探針組成的芯片，其中每個(gè)探針能檢測(cè)樣品中一個(gè)不同的miRNA，至少15 % (包括至少0 %，30 %，40 %， 50%，60%，70%，80%，90%，或95% )的探針能檢測(cè)圖3中的一個(gè)miRNA以及他們的同源物。提供了確定miRNAs基因狀態(tài)的微陣列芯片。微陣列芯片是確定基因狀態(tài)的經(jīng)典方法。例如，標(biāo)簽序列分子組成的系統(tǒng)用于確定基因狀態(tài)。芯片可以在多種材料的基質(zhì)上加工，如紙，玻璃，塑料(聚丙烯，尼龍，聚苯乙烯)， 聚丙烯酰胺，硝化纖維，硅，光纖或其他適合的固態(tài)或半固態(tài)支持物，形成平面構(gòu)象(如玻璃板，硅片)或者三維構(gòu)象(針型，纖維，珠子，顆粒，微孔板，毛細(xì)管)。在實(shí)際應(yīng)用中，探針是寡聚核苷酸，組成芯片的寡聚核苷酸可以通過(guò)多種方法與基質(zhì)結(jié)合，并不局限于，(1)采用光蝕刻技術(shù)的原位雜交(例如高密度寡聚核苷酸芯片)； (2)在玻璃，尼龍或硝酸膜上點(diǎn)或印中低密度芯片；C3)采用蔭蔽；(4)在尼龍或者硝酸素雜交膜上點(diǎn)印記。寡聚核苷酸利用雜交，磁珠，或者微孔盤或毛細(xì)管等流體相，通過(guò)非共價(jià)鍵的固定在基質(zhì)上。將核酸與固體基片(如玻璃板)結(jié)合的經(jīng)典技術(shù)。一種方法是結(jié)合修飾的堿基或類似物，它們的一部分能結(jié)合到固體基片，例如氨基，氨基衍生物或其他帶正電荷的基團(tuán)。 擴(kuò)增的產(chǎn)物與被醛基或其他反應(yīng)基團(tuán)包被固體基片接觸，如玻璃板，擴(kuò)增的產(chǎn)物與活性基團(tuán)形成共價(jià)鍵，并以共價(jià)的形式與玻片結(jié)合。使用Biodot (BioDot，Inc. Irvine, CA)點(diǎn)樣儀，將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)在醛基包被的玻板上，制作成芯片。按照發(fā)表的步驟，將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)在醛基玻片(Schena et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1995)93 :10614-10619).。芯片也可用機(jī)械手印在玻璃，尼龍(Ramsay, G.，Nature Biotechnol. (1998),16 :40-44)，聚丙烯 (Matson, et al.，Ahal Biochem. (1995), 224 (1) :110-6)，硅樹脂片上(Marshall, A. and Hodgson, J.，Nature Biotechnol. (1998),16 :27-31)。其它芯片裝備的方法包括電場(chǎng)中精細(xì)微穿刺(Marshall and Hodgson, supra)，和將多聚核苷酸直接點(diǎn)樣在正電荷包杯的平板上?！┓椒ㄒ彩浅Ｓ玫?，如 www. cmt. corning, com 禾口 http://cmRm. Stanford, edu/ EtamZ公開的，用氨基丙烷硅油進(jìn)行化學(xué)表面處理的方法。通過(guò)制備高密度核苷芯片來(lái)制備芯片。眾所周知，該技術(shù)采用多聚核苷酸的快速沉積(Blanchard et al. ,Biosensors & Bioelectronics，11 :687-690)。其他制備芯片的方法，如通過(guò)蔭蔽(Maskos and Southern, Nucleic. Acids. Res. (1992)，20 :1679-1684)。原則上，上面所提到的任何芯片，可以點(diǎn)印跡在尼龍雜交膜上使用。但是，專業(yè)技術(shù)人員經(jīng)常首選非常小的芯片，因?yàn)樗鼈冇休^小的雜交體積。試劑盒該專利為這里描述的多種方法提供了試劑盒。例如，在應(yīng)用中，提供了一個(gè)試劑盒，包括用于檢測(cè)miRNA水平的一個(gè)體系(如微陣列芯片)。在應(yīng)用中，試劑盒包括額外的進(jìn)行檢測(cè)的試劑，也提供說(shuō)明書或者用戶手冊(cè)，詳細(xì)介紹使用該發(fā)明的最優(yōu)方法，這些說(shuō)明指導(dǎo)也可以從因特網(wǎng)上得到。在應(yīng)用中，試劑盒提供了一個(gè)用于診斷食道癌的體系(芯片)。該試劑盒進(jìn)一步包括對(duì)照樣品用于確定參考水平，和/或獲得參考水平的信息。應(yīng)用中，試劑盒包括說(shuō)明書， 介紹如何使用它診斷食道癌。在應(yīng)用中，試劑盒提供了一個(gè)用于分類食道癌病人的體系(芯片)。該試劑盒進(jìn)一步包括對(duì)照樣品用于分類個(gè)體，和/或?qū)φ諛悠返男畔?。?yīng)用中，試劑盒包括說(shuō)明書，介紹如何使用它分類個(gè)體。應(yīng)用中，提供試劑盒用于確定一個(gè)食道癌病人生存的預(yù)后。例如，這個(gè)試劑盒由檢測(cè)miRNA(如圖3所示)的探針組成。應(yīng)用中，試劑盒進(jìn)一步包括對(duì)照樣品用于確定臨界水平或有關(guān)臨界水平的信息。應(yīng)用中，試劑盒還包括說(shuō)明書，指導(dǎo)使用試劑盒對(duì)病人生存預(yù)后。使用中，試劑盒還包括一些試劑用于降低miRNA水平或者藥物合成物用于提高生存率。該試劑盒進(jìn)一步包括一些實(shí)際，但不局限于這些，如基片，標(biāo)簽，引物，標(biāo)記miRNA 的試劑，抽提miRNA的試劑，用于雜交和檢測(cè)的陰性或陽(yáng)性對(duì)照，試管和/或其他附件，收集組織樣品的試劑，緩沖液，雜交盒，封口膜等，還包括軟件包，如用于miRNA水平分析和/或 miRNA水平特征改變的統(tǒng)計(jì)方法，任意選擇密碼和賬號(hào)，用于評(píng)估編輯的數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用中，試劑盒中包括一個(gè)藥物組合物，其成分能降低圖3中所示miRNA水平，以及如何使用組合物提高食道癌患者的生存率。在使用中，試劑盒包括載體或其他媒介用于運(yùn)輸組合物。使用中，試劑盒還有說(shuō)明書指導(dǎo)藥物組合物的使用。下面的例子用于闡明該發(fā)明，但并不僅限于此。實(shí)施例1該例子說(shuō)明分析miRNA水平的樣品制備。病人和樣品訓(xùn)練集中包括31對(duì)原發(fā)食道麟癌細(xì)胞和相應(yīng)的鄰近正常食道癌組織。這些樣品從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病人中采集，并獲得知情同意。所有組織樣品來(lái)自不曾治療過(guò)的病人，通過(guò)手術(shù)獲得，在液氮中迅速冷凍，_80°C儲(chǔ)存(少于6年)直到miRNA抽提。第二個(gè)獨(dú)立集中的新鮮組織的來(lái)自5對(duì)病例，作為獨(dú)立的有效性數(shù)據(jù)集，是2006年從相同醫(yī)院收集，儲(chǔ)存時(shí)間少于6個(gè)月。被切除食道癌的外圍部分用石蠟包被，切片，用常規(guī)H&E (蘇木精&曙紅)染色。病理學(xué)家評(píng)估腫瘤細(xì)胞濃度和確定腫瘤]組織學(xué)。追蹤資料來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院的追蹤數(shù)據(jù)庫(kù)。所有樣品的臨床病理學(xué)信息(年齡，性別，病理學(xué)，分化， 下匪分期，腫瘤階段，手術(shù)后生存時(shí)間)都是可以得到的。該研究被中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院的醫(yī)學(xué)道德委員會(huì)批準(zhǔn)。miRNA芯片的制備共有509個(gè)成熟的miRNA序列被裝配和集成到我們的miRNA芯片設(shè)計(jì)，其中435 個(gè)人源(包括從發(fā)表文獻(xiàn)中獲得的122個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA)，來(lái)自miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的196個(gè)大鼠和261個(gè)小鼠的成熟的miRNA。此外，設(shè)計(jì)了 8個(gè)短寡核苷酸，它們與已知的RNA序列不同源，采用Ambion miRNA探針構(gòu)建試劑盒(Cat. No. 1550，Austin, TX)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得這 8個(gè)短寡核苷酸相應(yīng)的合成miRNA.在分析之前，將不同數(shù)量的這些合成miRNA加入到人的 miRNA樣品中，作為內(nèi)標(biāo)。所有設(shè)計(jì)的miRNA探針序列與它們同源的全長(zhǎng)的成熟miRNA完全互補(bǔ)。為了將探針固定化到醛基修飾的玻片表面，這些探針序列連接起來(lái)長(zhǎng)度有40nt (3’端的miRNA探針加上5’端19mer的polyT)，并有C6 5’ -氨基修飾。寡核苷酸探針在MWG Biotech合成， 溶解在 EasyArray 點(diǎn)樣溶液中，濃度為 40 μ Μ。使用 SmartArray microarrayer (Capital Bio Corp.)每個(gè)探針重復(fù)點(diǎn)樣3次。靶標(biāo)RNA的標(biāo)記用TRIZOL 試劑抽提總 RNA，低分子量 RNA 用 Ambion，s miRNA Isolation Kit 抽提。按照Thomson，protocol (Thomson et al.，2004)使用T4RNA連接酶標(biāo)記技術(shù)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，4 μ g ^[氏分子量 RNA 被 500ng 的 5' -phosphate-cytidyl-uridyl-cy3-3' (Dharmacon, Lafayette, CO)在 T4RNA 連接酶(New England Biolabs,Bei jing, China)作用下標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)在4°C進(jìn)行2小時(shí)。標(biāo)記的RNA用0. 3M乙酸鈉和2. 5倍體積乙醇沉淀，再用乙醇洗滌，干燥后再懸浮在15μ 1雜交緩沖液中，含有3XSSC，0. 2% SDS and 15%甲酰胺。玻片雜交在LifterSlipTM(Erie，Portsmouth, NH)中進(jìn)行雜交，雜交盒法在 BioMixerTM(CapitalBio)，以便能不間斷的混合雜交緩沖液，使整個(gè)玻片的雜交更均衡，防止邊緣效應(yīng)，該方法的有效性在我們的全基因組mRNA表達(dá)芯片中得到證實(shí)。雜交在42°C水浴中過(guò)夜。芯片在42°C用洗滌溶液(0.2% SDS, 2 X SSC)連續(xù)洗滌5分鐘，用0. 2% SSC在室溫下洗滌5分鐘。芯片用共聚焦的LuxScanTM掃描儀掃描，用LuxScanTM 3. OTM軟件分析獲得圖像。計(jì)算分析每條miRNA的重復(fù)點(diǎn)的平均值除去背景，標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行進(jìn)一步分析。采用每個(gè)芯片中值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用中值矩陣。對(duì)于所有樣品中，從數(shù)據(jù)中除去表達(dá)信號(hào)低于800的基因。通過(guò)芯片顯著性分析(SAM) (www-stat. Stanford, edu/ tibs/SAM/index. html))確定不同表達(dá)的miRNAs。對(duì)于每個(gè)基因，SAM根據(jù)相對(duì)于所有測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差的表達(dá)變化情況，給出一個(gè)數(shù)值。根據(jù)平均連鎖和皮爾森相關(guān)性進(jìn)行分級(jí)聚類。支持向量機(jī)方法用于交叉驗(yàn)證和預(yù)測(cè)測(cè)試集。用4種公開可利用的算法分析最顯著的miRNA的靶標(biāo)，如MIRANDA (http //www. miRNA. org/)， TARGETSCAN(http//www. targetscan. org/)， PICTAR(http://pictar. bio. nyu. edu/) and miRBase (http: //miRNA. sanRer. ac. uk/sequences/)。為了減少假陽(yáng)性，所接受的假定靶標(biāo)基因至少要被3個(gè)程序預(yù)測(cè)到。Kaplan-Meier曲線用于確定miRNA表達(dá)與從診斷到治療結(jié)束時(shí)間的相關(guān)性。表1.實(shí)時(shí)PCR分析為了驗(yàn)證miRNA表達(dá)譜，提取全RNAs用microRNA特異性的引物進(jìn)行qRT_PCR。 反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)條件2. 5ng/ μ 1全RNA，25ηΜ根-環(huán)RT引物，1 XRT buffer,每種dNIPs 0. 25mM,200 U M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，0. 25U/ml RNase 抑制劑 Qnvitrogen)。7. 5ml 反應(yīng)體系在 MJ Research PTC-225 Thermocycler 中溫浴，在 16°C保持 30 分鐘，在 42°C C30 分鐘，在 85°C保持5分鐘，然后在4°C保存。所有逆轉(zhuǎn)錄，包括非模板的對(duì)照，都有一個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí) PCR 用 FastStart DNA Master SYBR green I 試劑盒和 LightCycler，按照操作手冊(cè)進(jìn)行。 10 μ 1 PCR體系包括Ιμ RT產(chǎn)物，IXPCR Master Mix，15nM上游引物和15nM下游引物。 反應(yīng)95°C保持10分鐘，接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95°C保持15秒，60°C保持35秒，72°C保持3 秒。所有qRT-PCR反應(yīng)，包括非模板的對(duì)照，都有一個(gè)重復(fù)。采用循環(huán)數(shù)的交叉點(diǎn)(CP)確定 miRNAs的相對(duì)表達(dá)比率。人TO的基因表達(dá)分析用做內(nèi)標(biāo)。結(jié)果用LightCycler software version 3. 5 (Roche Diagnostics)分析。用溶解曲線分析實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用凝膠電泳證實(shí)。表1列出了引物序列。表1.
權(quán)利要求
1.探針在確定食道癌病人生存預(yù)后的制劑中應(yīng)用，所述探針為分別與如下minRNA完全互補(bǔ)的探針hsa-miR-103 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA ； hsa-miR-107 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA。
2.試劑在制造提高食道癌患者生存的藥物制劑中的應(yīng)用，其特征是所述試劑為分別與如下minRNA完全互補(bǔ)的探針hsa-miR-103 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA ； hsa-miR-107 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA。
3.—種藥物組合物，其特征是，所述藥物組合物為分別與如下minRNA完全互補(bǔ)的探針hsa-miR-103 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA ； hsa-miR-107 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA。
全文摘要
本發(fā)明提供了根據(jù)特定miRNAs的水平或相應(yīng)的基因狀態(tài)，用于食道癌診斷、分型和預(yù)后的方法和組合物。本發(fā)明同時(shí)也提供了含有能夠降低miRNA水平組分的組合物，使用它因此而提高了食管癌病人生存率。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102399870SQ20111031654
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日
發(fā)明者凱斯·米切爾遜, 孟欣, 張亮, 程京, 赫捷, 郭永, 陳照麗 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所, 博奧生物有限公司, 清華大學(xué)