專利名稱：一種水溶性酞菁二氧化硅納米粒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于具有光動力活性的光敏劑技術領域，涉及一種水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，以及制得的酞菁二氧化硅納米粒及其在制備光動力藥物靜脈注射劑中的應用。
背景技術：
目前治療各種腫瘤的技術(如化療、放射性治療和手術等)在治療癌癥晚期和由于年齡、體質等原因不適合使用傳統(tǒng)治療技術的病人上尚存在很大的治療難度。光動力療法 (PDT)作為一種近年來發(fā)展起來的新型腫瘤臨床療法，具有特異性殺傷腫瘤細胞、對健康組織損傷小、毒副作用低、手術后并發(fā)癥少、以及經(jīng)濟方便等獨特的優(yōu)點，尤其是適合治療癌癥晚期和由于年齡、體質等原因不適合使用傳統(tǒng)治療技術的病人，因此該治療方法被公認為是臨床上除手術、放療、化療之外的第四種治療癌癥的方法，成為倍受重視的研究領域。光動力學療法的基本治療過程是先將光敏劑導入活體或腫瘤組織中，并讓它在組織間分布，當光敏劑在靶體和非靶體中的濃度比達到最大值時，用與光敏劑吸收光譜相匹配的光照射靶體組織，通過一系列光物理、光化學和分子生物學過程，產(chǎn)生對靶體細胞有害的活性中間體，破壞靶體組織直至其死亡，從而顯示其治療作用。由于光療中同時需要光敏劑和光的參與，可獲得雙重選擇性，這是光動力學療法的顯著特點?？梢娫撝委熓侄问枪饷魟┮环N間接作用的結果，并不需要光敏劑與癌細胞存在接觸。目前，隨著激光技術和光導纖維技術的發(fā)展和應用，光動力治療腫瘤過程中所必需的三要素(光敏劑、氧和光源與光傳導)中的光源與光傳導的問題得到了很好的解決，因此尋求理想的光療藥物成為PDT中一個至關重要的問題。與其它類型光敏劑相比，作為第二代光敏劑的典型代表-酞菁類化合物，由于具有結構單一、良好的光熱穩(wěn)定性、合適的光物理參數(shù)、較佳的吸收波長和較高的摩爾消光系數(shù)等優(yōu)點，因此被公認為是一種極有應用前景的光療藥物。但到目前為止，研究工作者們?nèi)匀粵]有能很好地解決酞菁類光敏劑存在的兩個問題脂水溶性平衡問題(即光療藥物在血液中的聚集和低的腫瘤組織吸收率)和靶向問題(即腫瘤組織對光療藥物的選擇性吸附或潴留)。因此開展酞菁類化合物臨床前期的應用基礎研究，針對光動力療法的特點，解決其脂水溶性平衡和靶向性等問題，是推動其在光動力療法領域中臨床應用進程的關鍵。目前研究者主要通過如下兩個途徑來克服酞菁類化合物脂水溶性的平衡問題和靶向問題
(1)結構修飾。對于中心金屬一定的酞菁化合物而言，周邊取代基的改變對其單體的光敏性能影響很小，但卻能顯著地影響到其脂水溶性和選擇性，因此研究人員希望通過結構修飾在酞菁類化合物分子結構中引入新的功能基團來改善其脂水溶性平衡和選擇性，同時降低其在生理環(huán)境中的堆積度。目前研究的酞菁類衍生物包括水溶性酞菁類衍生物(主要是在酞菁分子結構中引入羧基、磺酸基、磷酸酯基、胺基和葡萄糖基等水溶性基團)、脂溶性酞菁類衍生物(主要是在酞菁分子結構中引入烷基、芳基等)、兩親性酞菁類衍生物和選擇酞菁類衍生物(即第三代光療藥物)(Dyes and Pigments, 2008, 77，537-544)。在此過程中，我們也研究了一些具有應用前景的酞菁衍生物，如四(5-磺酸萘氧基)水溶性鋅酞菁衍生物、磷胺和酪氨酸取代的兩親性鋅酞菁衍生物等(Dyes and Pigments, 2003, 56， 1-6)。通過對結構修飾獲得的酞菁類衍生物的研究發(fā)現(xiàn)水溶性酞菁類衍生物存在不易被腫瘤細胞吸收和在體內(nèi)易發(fā)生聚集的現(xiàn)象；脂溶性酞菁類衍生物在體內(nèi)運轉困難，嚴重影響了它們在臨床應用研究中進一步開展；兩親性酞菁類衍生物和選擇酞菁類衍生物雖然可以在一定程度上解決了上述兩個問題，但是由于存在合成難度較大等問題，使其仍然難于得到實際應用。因此，結構修飾并不是使酞菁類光敏劑在光動力療法領域中獲得實際應用的最佳途徑。(2)構建給藥體系。具有核殼結構的納米二氧化硅顆粒是一種新型的藥物載體，特別適合應用來包裹光動力療法領域中的光敏劑(J. Am. Chem. Soc., 2003， 125:7860-7865)。當納米粒子被癌細胞有效的攝取后，照射包埋在納米粒子中的光敏劑可以產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧可以有效的破壞癌細胞。由于二氧化硅納米粒子固有的親水性， 良好的熱穩(wěn)定性，化學穩(wěn)定性和生物兼容性，它們不像其它的載體一樣，會被免疫系統(tǒng)快速的清除，同時不具細胞毒性，所以，二氧化硅納米粒子可作為藥物傳輸體系的良好載體。藥物分子被“裝入”到納米粒子中，二氧化硅殼層為包埋的分子提供了一個很好的保護，表面修飾有分子識別功能后，納米粒子可以到特定的部位。到達理想的位置后，納米粒子可以以精確的速率釋放所負載的藥物，這可以通過制備不同內(nèi)部結構的納米粒子來達到想要的藥物釋放率。與先前的藥物載體相比，該載體具有制備方法簡單，對環(huán)境和溫度要求低，水溶液中穩(wěn)定、生理相容性好及表面修飾容易等優(yōu)點(Photochemistry and Photobiology, 2003, 78 (6)，587-591)。與此同時，由于納米二氧化硅具有硬性的核殼結構，這使得被注射到人體內(nèi)的光敏劑始終只能存在其殼內(nèi)，不會被釋放出來，因此利用該類藥物載體構建的給藥體系可以有效地避免所包埋的光敏劑被釋放，完全符合光動力療法的要求。目前，具有核殼結構的納米二氧化硅在光動力療法領域中的應用尚處于起始階段，還未系統(tǒng)化，因此系統(tǒng)地研究酞菁納米二氧化硅給藥體系在光動力療法領域中臨床前期基礎的科學技術問題，對于推動酞菁類光敏劑的實用化進程具有十分重要的科學意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在于克服酞菁由于水溶性差而不便于制成藥劑的缺點，同時依據(jù)光動力療法臨床治療過程中對光療藥物的要求，將具有核殼結構的納米二氧化硅引入到酞菁的應用研究中，制備出具有臨床應用前景的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。即本發(fā)明的目的在于提供一種水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，該方法制備的納米?？梢赃_到使酞菁在血液中有效傳輸和增強光動力活性的目的。本發(fā)明的另一目的還在于提供所制得的水溶性酞菁二氧化硅納米粒及其在制備光動力藥物靜脈注射劑中的應用。本發(fā)明通過多種硅烷類化合物水解產(chǎn)生的具有核殼結構的納米二氧化硅，在表面活性劑存在的情況下對酞菁進行包封，制備出粒徑小于IOOnm的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術方案是一種水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于兩種以上硅烷類化合物水解產(chǎn)生的具有核殼結構的納米二氧化硅，在表面活性劑存在的情況下對酞菁進行包封，制備出粒徑小于100 nm的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。以上所述的過程是在一個反應體系中完成的，表現(xiàn)為一個操作步驟，實際上包括兩個在宏觀上無法分別的兩個步驟。即本發(fā)明的方法包括以下步驟
(1)兩種以上硅烷類化合物水解產(chǎn)生具有核殼結構的納米二氧化硅；
(2)在表面活性劑存在的情況下對酞菁進行包封，制備出粒徑小于100nm的水溶性酞
菁二氧化硅納米粒。所述的核殼結構的納米二氧化硅采用微乳液法制備(Indrajit Roy, Tymish Y. Ohulchanskyy, Haridas Ε. Pudavar, Earl J. Bergey, Allan R. Oseroff, Janet Morgan, Thomas J.Dougherty, and Paras N. Prasad. Ceramic-based nanoparticles entrapping water-insoIubIe photosensitizing anticancer durgs: a novel drug-carrier system for photodynamic therapy. JACS. 2003 (125)，7860-7865),可按照現(xiàn)有技術中的方法，由兩種以上硅烷類化合物水解生成。具體地說，本發(fā)明的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，包括以下步驟
1)向含有表面活性劑和助表面活性劑的混合水溶液中加入酞菁溶液，攪拌至澄清，加入兩種以上硅烷類化合物，攪拌，水解反應產(chǎn)生具有核殼結構的納米二氧化硅，同時產(chǎn)生的納米二氧化硅對酞菁進行包封；
2)透析除去產(chǎn)物中的表面活性劑和助表面活性劑，即可得到所述的酞菁二氧化硅納米粒。本發(fā)明中所涉及的酞菁包括但不限于四(4-叔丁基)酞菁、四(3-甲基苯氧基)酞菁、四(4-叔丁基苯氧基)酞菁、四(4-壬基苯氧基)酞菁、四(3-三氟甲基苯氧基)酞菁等各種油溶性酞菁。本發(fā)明中所涉及的硅烷類化合物包括烷烴類的硅烷及氨基取代的硅烷衍生物等。 烷烴類的硅烷包括乙烯基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷、三乙氧基硅烷或三甲氧基硅烷，氨基取代的硅烷衍生物包括3-氨丙基三乙氧基硅烷、Y-氨丙基三甲氧基硅烷、苯氨基甲基三乙氧基硅烷、苯氨基甲基三甲氧基硅烷、N -β (氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅烷、N -β (氨乙基)-Y-氨丙基三乙氧基硅烷、N -β (氨乙基)-Y-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N -β (氨乙基)-Y-氨丙基甲基二乙氧基硅烷等。所述的方法中，硅烷類化合物優(yōu)選兩種，兩種硅烷的比例關系介于1 :0. 01到1 100(體積比)。本發(fā)明中所涉及的表面活性劑包括吐溫系列、司盤系列、曲拉通系列、琥珀酸二 O-乙基己基)酯磺酸鈉(AOT )、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB )等。本發(fā)明中所涉及的助表面活性劑包括正丁醇、正戊醇或正己醇等。本發(fā)明中所涉及的酞菁溶液為N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMS0)、丙酮、甲醇、乙醇或三氯甲烷等的溶液。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)上述方法制得的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。通過微乳液法將油溶性的四(4-叔丁基)酞菁，四(3-甲基苯氧基)酞菁、四(4-叔丁基苯氧基)酞菁、四 (4-壬基苯氧基)酞菁、四(3-三氟甲基苯氧基)酞菁等各種油溶性酞菁包裹在疏水環(huán)境中，從而得到一種新型的水溶性酞菁納米粒。所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒粒徑小于100 nm，粒徑均勻且單分散性良好， 具有良好的水溶性，適用于光動力藥物酞菁類注射劑的制備。因此，完成本發(fā)明第三項發(fā)明任務的技術方案是所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒在制備光動力藥物靜脈注射劑中的應用。同樣，上述水溶性酞菁二氧化硅納米粒在制備光動力藥物靜脈注射劑中的應用中，所涉及的酞菁包括四(4-叔丁基)酞菁、四(3-甲基苯氧基)酞菁、四(4-叔丁基苯氧基) 酞菁、四(4-壬基苯氧基)酞菁或四(3-三氟甲基苯氧基)酞菁等各種油溶性酞菁。本發(fā)明的方法及所制得的水溶性酞菁二氧化硅納米粒具有如下的優(yōu)點
1.本發(fā)明的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法簡單、易操作、穩(wěn)定性高及重現(xiàn)性好，同時制得的納米粒水溶性良好，其直徑小于100 nm,粒徑均勻且單分散性質良好，有利于酞菁類注射劑的制備和保存。2.與單獨存在的酞菁類化合物相比，該納米粒不但水溶性高和分散性好，而且在體內(nèi)不會釋放酞菁，因此可以促進酞菁在血液中的有效傳輸。3.該納米粒光敏產(chǎn)生單重態(tài)氧(1O2)的能力得到了一定程度的增強，從而有效的提高了酞菁的光動力活性?？傊?，本發(fā)明對推動酞菁的實用化進程具有理論和實用雙重意義。


圖1為微乳液法制備的二氧化硅納米粒包裹酞菁后的紫外-吸收光譜比較圖，其中a為酞菁在有機溶劑DMSO中；b為微乳液法制備的二氧化硅納米粒包裹酞菁(PcSN);c為酞菁的水溶液。圖2為微乳液法制備的二氧化硅納米粒包裹酞菁后的熒光光譜比較圖；其中 a為微乳液法制備的二氧化硅納米粒包裹酞菁(PcSN) ；b為空二氧化硅納米粒吸附酞菁 (PcASN) ；c為酞菁的水溶液。圖3為制備方法中引入CTAB后制備的酞菁二氧化硅納米粒的透射電鏡圖。圖4為微乳液法制備的二氧化硅納米粒包裹酞菁后的單線態(tài)氧產(chǎn)量比較圖；其中 a為微乳液法制備的二氧化硅納米粒包裹酞菁；b為酞菁的水溶液。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述，所述的實施例有助于對本發(fā)明的理解和實施，并非構成對本發(fā)明的限制。實施本發(fā)明，除具體實施例中所涉及的物質外，本領域技術人員還可以采用功能上相同或相似的物質進行等同或等效的替換。本發(fā)明的保護范圍并不以具體實施方式
為限，而是由權利要求加以限定。實施例 1
復合硅烷引入表面活性劑CTAB制備酞菁二氧化硅納米粒，反應體系及條件如下 溶解0.36 g CTAB.800 μ L正丁醇至20 mL雙蒸水中，用磁力攪拌器攪拌至澄清，再向溶液中加入16 μ L四(4-叔丁基)酞菁的氯仿溶液(10 mmol/L)，磁力攪拌器攪拌至澄清， 加入200 μ L TEVS (乙烯基三乙氧基硅烷)攪拌一小時，然后加入10 μ L APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)，攪拌20小時。然后將該溶液對水用12-14 KD的纖維素透析袋透析48 小時以除去表面活性劑CTAB和正丁醇，即可得到酞菁二氧化硅納米粒。上述產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥等方法分離后，可制得水溶性酞菁二氧化硅納米粒的顆粒物。按照與上述過程基本相同的方法，在制備過程中不加入酞菁溶液，制得未包封酞菁的核殼結構的納米二氧化硅。酞菁二氧化硅納米粒表征
本發(fā)明實施例1制備的酞菁二氧化硅納米粒光化學性質、光動力性質以紫外光譜、熒光光譜表征；納米粒的形貌以透射電子顯微鏡觀測。(1)光譜測定結果
比較二氧化硅納米粒包裹酞菁與等濃度單獨存在的酞菁在水溶液的紫外吸收光譜可以發(fā)現(xiàn)，包裹后的酞菁的單體峰(679nm)明顯上升，聚集體幾乎沒有。這就預示著其單線態(tài)氧產(chǎn)量的增強。同時，包裹后酞菁的熒光發(fā)射峰的峰強有顯著的增強。這是由于當酞菁在水溶液中是，酞菁是處于一個極性溶劑中，酞菁分子與水分子之間的碰撞作用，以及酞菁分子之間發(fā)生的自聚集等作用會導致酞菁的熒光猝滅。而當二氧化硅納米粒包裹后的酞菁處于水溶液中時，由于此時酞菁分子是被包裹在二氧化硅納米粒中，沒有直接暴露在水環(huán)境中， 從而減少其熒光猝滅。以上現(xiàn)象表明酞菁的確被成功地包裹在硅質納米顆粒中。(2)酞菁二氧化硅納米粒的電鏡觀察
透射電鏡觀察酞菁二氧化硅納米粒大小及形貌，透射電鏡照片顯示通過微乳液法制備的酞菁二氧化硅納米粒的平均粒徑為30 nm。(3)單線態(tài)氧量子產(chǎn)率檢測結果
酞菁的單線態(tài)1O2量子產(chǎn)率的測定采用的是9，10-二苯基蒽丙酸鈉(ADPA)光氧化漂白法。由于酞菁化合物在378nm處無吸收峰或吸收很低，因此可以通過測量378nm處ADPA 吸收強度的降低程度，分析其單線態(tài)氧的量子產(chǎn)率。結果發(fā)現(xiàn)隨著光照時間的延長，ADPA 在PcSN水溶液中，其位于300-450nm范圍內(nèi)的三個特征吸收峰的吸收強度均發(fā)生明顯的降低，這說明酞菁在包裹之后光敏過程中有單線態(tài)氧的生成，而且酞菁在包裹之后產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力明顯增強。
實施例2，與實施例1基本相同，但所述的四(4-叔丁基)酞菁改用四(3-甲基苯氧基)酞菁。
實施例3，與實施例1基本相同，但所述的四(4-叔丁基)酞菁改用四(4-叔丁基苯氧基)酞菁。
實施例4，與實施例1基本相同，但所述的四(4-叔丁基)酞菁改用四(4-叔丁基)酞菁與四(4-壬基苯氧基)酞菁等摩爾比的混合物。
實施例5，與實施例1基本相同，但所述的四(4-叔丁基)酞菁改用四(3-三氟甲基苯氧基)酞菁。實施例6
復合硅烷引入表面活性劑吐溫-80制備酞菁二氧化硅納米粒，反應體系及條件如下
溶解1.30 g吐溫_80、800 μ L正戊醇至20 mL超純?nèi)ルx子水中，用磁力攪拌器攪拌至澄清，再向溶液中加入16 μ L四(4-叔丁基)酞菁的氯仿溶液(10 mmol/L)，磁力攪拌器攪拌至澄清，加入800 μ L四乙氧基硅烷攪拌一小時，然后加入10 μ L苯氨基甲基三乙氧基硅烷，攪拌20小時。然后將該溶液對水用12-14 KD的纖維素透析袋透析48小時以除去表面活性劑和正戊醇，即可得到酞菁二氧化硅納米粒。
實施例7
復合硅烷引入表面活性劑琥珀酸二 O-乙基己基)酯磺酸鈉(AOT)制備酞菁二氧化硅納米粒，反應體系及條件如下
溶解1. 0 g A0T、800 yL正己醇至20 mL超純?nèi)ルx子水中，用磁力攪拌器攪拌至澄清，再向溶液中加入16 μ L四(4-叔丁基)酞菁的氯仿溶液(10 mmol/L)，磁力攪拌器攪拌至澄清，加入10 PL TEVS攪拌一小時，然后加入200 μ L APTES，攪拌20小時。然后將該溶液對水用12-14 KD的纖維素透析袋透析48小時以除去表面活性劑和正己醇，即可得到酞菁二氧化硅納米粒。
權利要求
1.一種水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于兩種以上硅烷類化合物水解產(chǎn)生的具有核殼結構的納米二氧化硅，在表面活性劑存在的條件下對酞菁進行包封， 制備出粒徑小于100 nm的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。
2.根據(jù)權利要求1所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟1)向含有表面活性劑和助表面活性劑的混合水溶液中加入酞菁溶液，攪拌至澄清，加入兩種以上硅烷類化合物，攪拌，水解反應產(chǎn)生具有核殼結構的納米二氧化硅，同時產(chǎn)生的納米二氧化硅對酞菁進行包封；2)透析除去產(chǎn)物中的表面活性劑和助表面活性劑，即得到所述的酞菁二氧化硅納米粒。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述的硅烷類化合物為兩種，兩種硅烷的體積比為1 :0.01到1 :100。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述的酞菁包括四(4-叔丁基)酞菁、四(3-甲基苯氧基)酞菁、四(4-叔丁基苯氧基)酞菁、四 (4-壬基苯氧基)酞菁或四(3-三氟甲基苯氧基)酞菁。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述的硅烷類化合物包括烷烴類的硅烷及氨基取代的硅烷衍生物。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述的表面活性劑包括吐溫系列、司盤系列、曲拉通系列、琥珀酸二 O-乙基己基)酯磺酸鈉或十六烷基三甲基溴化銨。
7.根據(jù)權利要求2所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述的助表面活性劑包括正丁醇、正戊醇或正己醇。
8.根據(jù)權利要求2所述的水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于，所述酞菁溶液的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮、甲醇、乙醇或三氯甲烷。
9.根據(jù)權利要求1至8所述的任一方法制得的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。
10.根據(jù)權利要求1至8所述的任一方法制得的水溶性酞菁二氧化硅納米粒在制備光動力藥物靜脈注射劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水溶性酞菁二氧化硅納米粒的制備方法，其特征在于兩種以上硅烷類化合物水解產(chǎn)生的具有核殼結構的納米二氧化硅，在表面活性劑存在的條件下對酞菁進行包封，制備出粒徑小于100nm的水溶性酞菁二氧化硅納米粒。本發(fā)明還涉及所述方法制得的水溶性酞菁二氧化硅納米粒及其在制備光動力藥物靜脈注射劑中的應用。本發(fā)明制備方法簡單、易操作、穩(wěn)定性高及重現(xiàn)性好，所制得的酞菁二氧化硅納納米粒水溶性良好，直徑小于100nm，粒徑均勻且單分散性良好，適用于光動力藥物酞菁類注射劑的制備。
文檔編號A61K47/04GK102327231SQ201110311788
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權日2011年10月14日
發(fā)明者周家宏, 周林, 方克龍, 林云, 林睿, 魏少華 申請人:南京師范大學