專利名稱：粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合在治療性處理中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及粘液瘤病毒與雷帕霉素在治療上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前用于治療各種癌癥的治療方法經(jīng)常通過毒害或殺死癌細(xì)胞而起作用。不幸的是，對癌細(xì)胞具有毒性的治療方法一般對健康細(xì)胞也具有毒性。此外，有效治療癌癥尚不清楚的主要原因之一是腫瘤的異源性。目前的主流療法(如化學(xué)療法和放射療法)傾向于在狹窄的毒力治療范圍內(nèi)使用。由于腫瘤細(xì)胞類型各異以及這些治療方法可以應(yīng)用的范圍有限，據(jù)認(rèn)為這些類型的治療方法并不是有力的工具，其適用性有限。目前正在開發(fā)的現(xiàn)代抗癌療法試圖選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞，同時對健康細(xì)胞具有更低毒性，據(jù)此使健康細(xì)胞更有可能不受到影響。溶瘤病毒療法是旨在利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間的細(xì)胞差異的一種方法。這種方法使用有復(fù)制能力、對腫瘤具有選擇性的病毒載體作為抗癌劑。溶瘤病毒要么特異地靶向癌細(xì)胞而進(jìn)行感染，要么與在健康細(xì)胞中復(fù)制相比，更適合在癌細(xì)胞中進(jìn)行有效復(fù)制。這些有復(fù)制能力的溶瘤病毒是天然存在的，或者是經(jīng)過基因工程改造而成為靶向異源腫瘤群的高選擇性和高效性的工具。由于具有復(fù)制選擇性的溶瘤病毒在正常細(xì)胞中不進(jìn)行有效復(fù)制，所以特別是相對于傳統(tǒng)療法如放射療法或化學(xué)療法而言，其對患者的毒性較小。大量研究已報道了各種病毒株的溶瘤活性，最具前景的溶瘤病毒是天然存在的或經(jīng)基因修飾形式的腺病毒、單純皰疹病毒1( "HSV 1”)、呼腸孤病毒、痘苗病毒、水泡性口炎病毒(“VSV”)或脊髓灰質(zhì)炎病毒。目前正在研究的作為抗癌劑的經(jīng)修飾的溶瘤病毒包括 HSV、腺病毒、新城疫病毒(“NDV”)、呼腸孤病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、VSV和脊髓灰質(zhì)炎病毒。各種溶瘤病毒處于臨床試驗的第一和第二階段，其中一些病毒顯示出了穩(wěn)定的功效。但是，不知道哪些病毒最符合持續(xù)復(fù)制、具有特異性和強(qiáng)溶解活性的溶瘤目的。完全有效的溶瘤病毒候選載體應(yīng)該生命周期短、形成成熟病毒體快、能夠在細(xì)胞間進(jìn)行有效傳播并且具有便于插入的較大的基因組。同時，有證據(jù)表明，抑制早期先天性免疫應(yīng)答和延緩Thl應(yīng)答的發(fā)展對溶瘤療法的效力至關(guān)重要。對于打算用于開發(fā)溶瘤病毒的許多病毒來說，從正常群體中所觀測到的高水平的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答來測量，人類病毒顯然是具有高度免疫原性的。臨床工作表明，目前的溶瘤病毒確實是安全的，但作為單一療法的療效還不足以具有完全的臨床效果。由于經(jīng)常觀察到腫瘤細(xì)胞沒有充分或有效地受到感染，目前的動向是通過對候選病毒進(jìn)行基因工程改造，以使其表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因，從而提高它們的效力。同時還正在結(jié)合其它常見的溶瘤療法來對大部分以上提到的溶瘤病毒進(jìn)行測試。腺病毒可以容易地進(jìn)行基因操作，并且具有眾所周知的與病毒蛋白相關(guān)的功能。另外，它與相當(dāng)輕微的疾病有關(guān)。0NYX-015人類腺病毒(Onyx制藥公司(Onyx Pharmaceuticals he.))是受試最廣泛的針對臨床應(yīng)用進(jìn)行了優(yōu)化的溶瘤病毒之一。據(jù)信它優(yōu)選在P53陰性腫瘤中復(fù)制，并且在頭頸癌癥患者的臨床試驗中展現(xiàn)出潛力。但是，有報道表明，ONYX-015只在14%的治療患者中產(chǎn)生了客觀性臨床反應(yīng)(Nemunaitis J,Khuri F、Ganly I、Arseneau J、Posner M、Vokes E、Kuhn J、McCarty T、Landers S、Blackburn A,Romel L,Randlev B,Kaye S,Kirn D。臨床腫瘤學(xué)報(J. Clin. Oncol.) 2001 年 1 月 15 日；19 (2) 289 298)。W096/03997和W097/26904描述了可以抑制腫瘤細(xì)胞生長并對神經(jīng)元細(xì)胞具有特異性的突變的溶瘤HSV。所述HSV的其它優(yōu)點是其可以輕而易舉地進(jìn)行基因修飾，而且存在可以關(guān)閉任何不需要的病毒復(fù)制的藥物。但是，這種共同的人類病原體的應(yīng)用有限，這是因為很可能普通人群已經(jīng)接觸過該病毒，并獲得了針對該病毒的免疫應(yīng)答，這將削弱所述病毒的溶解效果。HSV還會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用或潛在的致命疾病。III型呼腸孤病毒與相對輕微的疾病有關(guān)，并且它的病毒基因功能也已了解得相當(dāng)清楚。溶瘤生物技術(shù)公司(Oncolytic Biotech)目前正在開發(fā)III型呼腸孤病毒作為癌癥治療劑，該病毒在表達(dá)突變體ras癌基因的細(xì)胞中具有增強(qiáng)的復(fù)制特性，而且優(yōu)先在 PKR-/-細(xì)胞中生長(Strong J. Ε.和 P. W. Lee。病毒學(xué)報(J. Virology)，1996，70 :612 616)。但是，難以對呼腸孤病毒進(jìn)行基因操作，而且其病毒復(fù)制不易關(guān)閉。VSV與相對輕微疾病有關(guān)，并且病毒基因功能也很清楚。W099/04(^6披露了 VSV 在基因療法中作為載體的應(yīng)用，以表達(dá)治療各種障礙的很多藥物。但是，VSV存在與呼腸孤病毒同樣的問題難以進(jìn)行基因操作，并且病毒復(fù)制不易關(guān)閉。痘苗病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒是本領(lǐng)域描述的其它候選的溶瘤病毒，但與嚴(yán)重的或潛在致命的疾病有關(guān)。US 4，806，347披露了干擾素γ和IFNY片段對抗人類腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用。 W099/18799披露了在哺乳動物中治療疾病的方法，在所述的哺乳動物中，病細(xì)胞具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷，所述方法包括對所述哺乳動物施用治療有效量的干擾素敏感的有復(fù)制能力的克隆病毒。其具體披露了在干擾素存在的情況下，VSV病毒顆粒對腫瘤細(xì)胞具有毒性，但是VSV在正常細(xì)胞中的細(xì)胞毒性會出現(xiàn)下降。W099/18799還披露，用干擾素處理腫瘤細(xì)胞，觀察到了 NDV誘導(dǎo)的敏感性，而將干擾素加到正常細(xì)胞，會使這些細(xì)胞抗NDV。 這種方法的目的是通過用干擾素敏感病毒來感染細(xì)胞，使該細(xì)胞對干擾素敏感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)包括不表達(dá)功能性M135R蛋白的新型粘液瘤病毒在內(nèi)的兔粘液瘤病毒，能夠選擇性地感染包括人類腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷，并包括對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，而且利用藥物雷帕霉素來治療該細(xì)胞會增強(qiáng)所述感染。在該上下文中使用的術(shù)語“先天性”描述了非抗原特異性免疫應(yīng)答。由于粘液瘤病毒在人類正常細(xì)胞中不進(jìn)行有效復(fù)制，所以所述病毒可用作各種病癥和不適的治療藥物，例如，作為癌癥的溶瘤治療藥物，所述病癥和不適的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。所述病毒還可以用于鑒定具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，以及用于體內(nèi)顯示這些細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對所述細(xì)胞施用有效量的粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合。另一方面，本發(fā)明提供治療一種疾病狀態(tài)的方法，該疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，所述方法包括對需要的患者施用有效量的粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合在抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的應(yīng)用，以及在制備用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明又進(jìn)一步提供有效量的粘液病毒與雷帕霉素的組合在治療患者的疾病狀態(tài)中的應(yīng)用，其中，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，以及在制備用于治療患者的所述疾病狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有粘液瘤病毒和雷帕霉素。該藥物組合物可用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，或用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。又一方面，本發(fā)明提供包含粘液瘤病毒、雷帕霉素和說明書的試劑盒，該試劑盒用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，或用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述疾病狀態(tài)包括癌癥和慢性病毒感染。本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞群與粘液瘤病毒和雷帕霉素的組合接觸；使所述病毒感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞；以及確定所述細(xì)胞群中的任何細(xì)胞受到的所述粘液瘤病毒的感染。本發(fā)明進(jìn)一步基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)兔粘液瘤病毒蛋白M135R參與引發(fā)兔子的免疫應(yīng)答，并且不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒株可殺死體外細(xì)胞，但不會使動物患上粘液瘤病。該病毒株可用于處理具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括用于處理對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，并包括用于聯(lián)合藥物雷帕霉素而提供的治療，而不必加強(qiáng)對病毒的防范，由此可改善安全性。一方面，本發(fā)明提供抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對所述細(xì)胞施用有效量的不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒和選擇性組合的有效量的雷
帕霉素。另一方面，本發(fā)明提供一種治療疾病狀態(tài)的方法，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，所述方法包括對需要的患者施用有效量的不表達(dá)功能性 M135R的粘液瘤病毒和選擇性組合的有效量的雷帕霉素。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒和選擇性組合的有效量的雷帕霉素在抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的應(yīng)用，以及在制備用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒和選擇性組合的
于粘液瘤病毒在人類正常細(xì)胞中不進(jìn)有效量的雷帕霉素在治療患者的疾病狀態(tài)中的應(yīng)用以及在制備用于治療患者的所述疾病狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用，其中，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒。另一方面，本發(fā)明提供含有不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒的藥物組合物。所述藥物組合物可用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，或用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述藥物組合物還可包含雷帕霉素。又一方面，本發(fā)明提供一種包含不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒和說明書的試劑盒，該試劑盒用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞或用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述試劑盒還可包含雷帕霉素。所述疾病狀態(tài)包括癌癥和慢性病毒感染。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞群與不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒和可選的雷帕霉素的組合接觸；使所述病毒感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞；以及確定所述細(xì)胞群中的任何細(xì)胞受到的所述粘液瘤病毒的感染。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，通過閱讀以下對本發(fā)明具體實施方式
的描述，并結(jié)合附圖，應(yīng)該明了本發(fā)明的其它方面和特征。但應(yīng)理解，說明本發(fā)明優(yōu)選實施方式時的詳細(xì)描述和具體實施例只為闡明而提供，原因在于從這些詳細(xì)描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明了本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。


闡明本發(fā)明的實施方式的附圖只是用于舉例目的，圖1是病毒感染細(xì)胞后誘導(dǎo)的干擾素介導(dǎo)的抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的示意圖；圖2是非允許的WT鼠胚胎成纖維細(xì)胞(“MEF”)在接觸粘液瘤病毒后的相差顯微照片，該照片顯示在用中和抗體抑制干擾素α/β后MEF變得允許；圖3是顯示在粘液瘤病毒感染后STATl和STAT2的磷酸化狀態(tài)(激活)的Wfestern 印跡，該Wfestern印跡顯示MEF細(xì)胞的非允許感染與STATl和STAT2的激活相關(guān)聯(lián)；圖4是顯示在粘液瘤病毒感染后STAT3、STA1M、STAT5和STAT6的磷酸化狀態(tài)(非激活)的Western印跡，該Wfestern印跡顯示MEF細(xì)胞的非允許感染不會激活這些類型中的任何一種；圖5是在粘液瘤病毒感染后，IFN α/β R-/-MEF和STAT1-/-MEF以及IFN α / β R-/-MEF和STAT1-/-MEF的相差顯微照片，該照片顯示IFN/STAT/JAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的失活使得允許粘液瘤病毒對細(xì)胞的感染；圖6是顯示在粘液瘤病毒感染后在非允許野生型MEF中PKR的磷酸化狀態(tài)的 Western印跡，該Wfestern印跡顯示I3KR未被粘液瘤病毒感染所激活；圖7是顯示PKR在模擬感染的或用粘液瘤病毒預(yù)感染的野生型MEF中的磷酸化狀態(tài)的Wfestern印跡，該Wfestern印跡顯示粘液瘤病毒阻斷了 MEF細(xì)胞中的PKR激活；圖8是顯示在粘液瘤病毒感染后PERK在野生型MEF中的磷酸化狀態(tài)的Western 印跡，該Wfestern印跡顯示粘液瘤病毒阻斷了 MEF細(xì)胞中的PERK激活；
圖9是顯示在接觸粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L-/-和Mxl-/-三重敲除的相差顯微照片，該照片顯示在MEF細(xì)胞中通過不同途徑介導(dǎo)抗病毒狀態(tài)；圖10是在接觸粘液瘤病毒后H(R-/-、RNase L-/-和Mxl-/-三重敲除的相差顯微照片；圖11是用抗IFNa/β的中和抗體處理并接觸粘液瘤病毒后H(R-/-、RNase L-/-和Mxl-/-三重敲除的相差顯微照片；圖12是顯示用抗IFNa / β的中和抗體處理并接觸粘液瘤病毒后，eIF2 α和PKR 在非允許MEF中的磷酸化水平的Wfestern印跡，該^festern印跡顯示eIF2 α在非應(yīng)答細(xì)胞中的磷酸化由獨立于PKR的途徑進(jìn)行催化；圖13是顯示粘液瘤病毒感染后STATl在H(R-/-、RNase L-/-和Mxl-/-三重敲除中的磷酸化狀態(tài)的Astern印跡，該狗計吐！!印跡顯示正常的IFN誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答；圖14是闡明感染后12小時，酪氨酸磷酸化的STATl在非允許的H(R-/-+RNase L-/-+Mxl-/-細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的相差顯微照片，該照片表明，正如由正常IFN/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答所預(yù)測的那樣，激活的STAT定位于細(xì)胞核；圖15是模擬感染的或用表達(dá)GFP的死粘液瘤病毒或活粘液瘤病毒感染的患有顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠大腦的熒光圖片，該圖片顯示粘液瘤病毒靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；圖16是用表達(dá)GFP的粘液瘤病毒感染的鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的薄切片的熒光圖像和照片，該圖像和照片顯示粘液瘤病毒只在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制；圖17是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的HD9人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示在人類細(xì)胞中非允許感染的一個例子；圖18是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的H0P92人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類細(xì)胞的允許感染的一個例子；圖19是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的0VCAR4人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類細(xì)胞的允許感染的一個例子；圖20是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的SK-MEL3人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類細(xì)胞的允許感染的一個例子；圖21是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的SK-MEU8人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類腫瘤細(xì)胞的半允許感染的一個例子；圖22是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色后的BGMK細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示作為對照的典型的允許感染；圖23是用濃度逐步升高的表達(dá)LacZ蛋白的粘液瘤病毒感染后，用X-Gal染色的陽性對照BGMK細(xì)胞和人類腫瘤細(xì)胞系U87、A172和U373的相差顯微照片，該照片顯示這些人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對粘液瘤病毒復(fù)制都是允許的；圖M是顯示用病毒濃度逐步升高的粘液瘤病毒感染72小時后的BGMK、U87、A172 和U373細(xì)胞的存活率的圖，該圖顯示粘液瘤病毒殺死所有這些細(xì)胞的能力；圖25是用MV GFP感染的SF041585星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的相差顯微照片和熒光顯微照片，該相差顯微照片和熒光顯微照片顯示了在原發(fā)性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的感染；圖沈是用表達(dá)LacZ蛋白的粘液瘤病毒感染并經(jīng)X-Gal染色的U373神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該相差顯微照片顯示了這些人類腫瘤細(xì)胞的感染；
圖27是描述用MV GFP感染后48小時，SF041585細(xì)胞的存活率的圖，該圖顯示了這些受感染的人類腫瘤細(xì)胞被殺死的情況；圖28是用表達(dá)GFP的粘液瘤病毒感染的Daoy和D384髓母細(xì)胞瘤系的熒光顯微照片，該照片顯示了這些人類腫瘤細(xì)胞的感染；圖四是使用所示的野生型病毒vMyxLac和敲除M_T5的病毒vMyxI^KO，在下列各細(xì)胞系中利用雷帕霉素進(jìn)行預(yù)處理或不利用雷帕霉素進(jìn)行預(yù)處理的病毒生成率的圖示 BGMK (靈長類的對照細(xì)胞系)；RK-13和RL15 (兔的對照細(xì)胞系)；4T1和B16F10 (小鼠的癌細(xì)胞系)汨05、？03、786-0、!10116、六(服、]\07-7、]\114和0)11)205(人類癌細(xì)胞系)；圖30是用vMyxLac或vMyXLaCT5-感染的病毒感染細(xì)胞系的照片；圖 31 是各細(xì)胞系(BGMK ；A9 ；MCF-7 ；MDA-MB-435 ；M14 和 C0L0205)經(jīng)利用雷帕霉素進(jìn)行預(yù)處理或不利用雷帕霉素進(jìn)行預(yù)處理的病毒生成率的圖示；圖32㈧是粘液瘤病毒蛋白M135R和痘苗病毒蛋白B18R的示意性對比圖，圖 32⑶是M135R與B18R的前179個氨基酸之間的氨基酸序列對比；圖33 (A)是在用粘液瘤病毒Lausanne (vMyxLau)感染的BGMK細(xì)胞中表達(dá)的M135R m^festern印跡，而圖33(B)是在用vMyxLau感染并用araC、衣霉素或莫能菌素處理的BGMK 細(xì)胞中表達(dá)的M135R的Western印跡；圖34 (A)是模擬感染的或用粘液瘤病毒感染的并對M135R染色的BGMK細(xì)胞的熒光顯微照片，而圖34(B)是利用抗M135R抗體進(jìn)行的針對用野生型粘液瘤病毒(vMyxgfp) 或M135R敲除株(vMyxl3^(0)感染的細(xì)胞的免疫沉淀反應(yīng)產(chǎn)物或細(xì)胞溶解物的flfestern印跡；圖35(A)是制備vMyxl35K0的克隆策略的示意圖，圖35(B)是PCR插入產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠，而圖35(C)是用野生型和M135R敲除的粘液瘤病毒感染的細(xì)胞的Western印跡；圖36是用vMyxgfp或vMyxl3^(0感染的BGMK細(xì)胞中的病毒灶(viral foci)的生長曲線；圖37是用vMyxgfp或vMyxl35K0感染的兔胚胎成纖維細(xì)胞的光顯微照片和熒光顯微照片；圖38是用vMyxgfp或vMyxl35K0感染的兔HIG82成纖維細(xì)胞的光顯微照片和熒光顯微照片；圖39是用vMyxgfp或vMyxl35K0感染的人類原發(fā)性成纖維細(xì)胞的光顯微照片和熒光顯微照片；圖40是用vMyxLau或vMyxl35K0感染的兔子的體溫曲線圖；圖41是模擬感染的或用vMyxgfp或vMyxl35K0感染的并用125I標(biāo)記的兔干擾素 α/β處理的細(xì)胞的125I發(fā)射圖；圖42是通過用vMyxgfp或vMyxl35K0感染RKl3或BGMK而形成的病灶的圖，其中， 細(xì)胞未用兔干擾素α/β處理或者在感染前24小時用兔干擾素α/β進(jìn)行處理；和圖43是使用來自用20ηΜ雷帕霉素(R)或者載體對照⑶進(jìn)行預(yù)處理的786_0人類癌細(xì)胞的細(xì)胞溶解物，并利用直接抗所標(biāo)明的蛋白的抗體進(jìn)行檢測而得到的Western印跡的照片。
具體實施例方式正如申請PCT/CA2004/000341中所描述的(此處通過參考全部引入)，本發(fā)明人在過去已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通常感染兔子的野生型粘液瘤病毒能夠選擇性地感染和殺死具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞(包括人類細(xì)胞)，例如，對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。粘液瘤病毒在人類正常細(xì)胞中不能進(jìn)行有效復(fù)制。因為諸如癌癥等很多疾病或不適的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，所以粘液瘤病毒可以用于治療包括癌癥在內(nèi)的所述疾病和不適，并且對正常的健康細(xì)胞毒性低。粘液瘤病毒還可用于治療慢性感染的細(xì)胞，因為這些細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。例如，很多病毒編碼具有抑制細(xì)胞的抗病毒性干擾素應(yīng)答的基因產(chǎn)物；粘液瘤病毒可以選擇性地感染這些細(xì)胞。粘液瘤病毒(“MV”)是在兔子中引起粘液瘤病的致病媒介物。MV屬于痘病毒科 (Poxviridae，最大的DNA病毒)的野兔痘病毒(L印oripoxvirus)屬。MV在其天然宿主美洲棉尾兔(Sylvilagus rabbit)中引起良性疾病。但是，它是烈性的且宿主特異性痘病毒，在歐洲兔中引起致命疾病，其特征是出現(xiàn)全身性病變，尤其是在粘膜區(qū)域的附近(Cameron C， Hota-Mitchell S、Chen L、Barrett J、Cao JX>Macaulay C、Wilier D、Evans D、McFadden G，病毒學(xué)(Virology), 1999,264(2) :298 318 ；Kerr P McFadden G，病毒免疫學(xué)(Viral Immunology)，2002，15(2) 229 246)。MV病毒是一種具有1631Λ的雙鏈DNA基因組的大病毒，該基因組在受感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制(B. N. Fields,D. Μ. Knipe，P. Μ. Howley 編，病毒學(xué)，Lippincott Raven 出版社，紐約，第二版，1996)。已知MV編碼各種與細(xì)胞有關(guān)的分泌蛋白，該蛋白參與宿主免疫和炎性反應(yīng)的下調(diào)以及對病毒感染細(xì)胞凋亡的抑制。MV可以被所有的人類體細(xì)胞吸收。但是，除了正常的兔體細(xì)胞外，如果所述細(xì)胞具有正常先天性抗病毒應(yīng)答，所述病毒就不能有效感染所述細(xì)胞，這意味著所述病毒不能復(fù)制和導(dǎo)致細(xì)胞死亡。干擾素(“IFN”)是為應(yīng)答各種刺激而分泌的細(xì)胞因子家族。干擾素結(jié)合到細(xì)胞表面受體，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)導(dǎo)致眾多的細(xì)胞應(yīng)答，包括抗病毒應(yīng)答和生長抑制和/或凋亡信號的誘導(dǎo)。干擾素分為I型或II型。I型干擾素包括α干擾素、β 干擾素、τ干擾素和ω干擾素，所有的都是單體；II型IFN只有IFNy —種，為二聚體。 IFN-α的12種不同亞型由14個基因產(chǎn)生，但所有其它的IFN都是單基因性的(Arduini 等，1999)。IFN通過調(diào)節(jié)癌基因表達(dá)來發(fā)揮直接的抗腫瘤活性。生長刺激性癌基因的過表達(dá)或腫瘤抑制物癌基因的喪失會導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。p53、Rb、PC、NFl、WTl和DCC是參與癌癥發(fā)生的一些致癌基因。粘液瘤病毒和其它溶瘤病毒如呼腸孤病毒和VSV—樣，都需要穿過正常健康細(xì)胞中所存在的抗病毒防護(hù)，才能在細(xì)胞中復(fù)制。MV和其它溶瘤病毒誘導(dǎo)干擾素的生成，一般對 IFN途徑的抗病毒作用敏感。由IFN抗病毒應(yīng)答誘導(dǎo)的相關(guān)蛋白和主要影響病毒增殖的相關(guān)蛋白包括H(R、OAS合成酶和RNase L核酸酶。PKR激活eIF2 α，導(dǎo)致抑制翻譯和誘導(dǎo)凋亡。在圖1中描述的是IFN應(yīng)答途徑的示意圖。在正常細(xì)胞中，MV受到PKR和eIF2 α的直接影響。在癌細(xì)胞中，抗病毒應(yīng)答途徑經(jīng)常受到破壞。例如，對IFN的減弱或無效應(yīng)答是在轉(zhuǎn)化過程中和腫瘤發(fā)展中經(jīng)常出現(xiàn)的遺傳性缺陷。超過80%的腫瘤細(xì)胞系對干擾素不產(chǎn)生應(yīng)答或應(yīng)答受損Gtojdl等，癌細(xì)胞(Cancer Cell), (2003) 4 :263 275和其中所引用的參考文獻(xiàn)；Wong等，生物化學(xué)學(xué)報(J.Biol Chem) (1997)272(45) :28779 28785 ；Sun 等，血液(blood)，(1998)91 (2) :570 576 ；Matin 等，癌癥研究(Cancer Res.) (2001)61(5) :2261 2266 ;Balachandran 等，癌細(xì)胞(2004)5(1) :51 65)。正如先前在 PCT/CA2004/000341中披露的，MV能夠感染和殺死癌細(xì)胞，包括人類腫瘤細(xì)胞，并且不受到任何特定理論的限制，據(jù)信MV能夠感染這些細(xì)胞是因為這些細(xì)胞存在先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。有證據(jù)表明，抑制早期先天性免疫應(yīng)答和延緩Thl應(yīng)答的發(fā)展對溶瘤治療的效率是重要的。雖然粘液瘤病毒是一種烈性病毒，但是它具有宿主特異性，并且具有非常窄的宿主范圍；它不感染人或鼠。不受任何具體理論的限制，據(jù)信因為粘液瘤病毒是非人類病毒， 在人類中它應(yīng)該沒有遇到預(yù)先存在的免疫識別。因此，它作為溶瘤病毒的潛力將受到較少的損害；對允許性腫瘤細(xì)胞，粘液瘤病毒將提供比天然的人類病毒更有效的感染，據(jù)此可以為癌癥提供有效的溶瘤治療。在粘液瘤病毒感染許多人類腫瘤細(xì)胞系時粘液瘤病毒宿主范圍基因M-T5看起來似乎扮演著重要的角色(Sypula等，(2004) Gene Ther. Mol. Biol. 8 103)。M-T5基因編碼在兔淋巴細(xì)胞中進(jìn)行粘液瘤復(fù)制所需的錨蛋白重復(fù)蛋白，切掉MT-5基因的粘液瘤病毒不能導(dǎo)致易感兔子感染粘液瘤(Mossman等，(1996) J. Virol. 70 :4394)?，F(xiàn)有證據(jù)表明，受到感染的人類腫瘤細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異對于辨別可允許粘液瘤病毒感染和有效復(fù)制的人類腫瘤細(xì)胞是至關(guān)重要的(Johnston等，Q003)J. Virol. 77 :5877)。此外，粘液瘤病毒具有蛋白M135R，該蛋白顯示了與干擾素α/β受體(“IFNa/ β-R”)的氨基末端部分的同源性。有人提出，M135R模擬宿主IFNa/β-R從而防止IFNa/ β-R 引發(fā)宿主的抗病毒應(yīng)答(Barrett 等，Seminars in Immunology (2001) 13 :73-84) 所述預(yù)測基于與來自痘苗病毒B18R的病毒IFN α / β -R同源的序列，并且已經(jīng)證明，痘苗病毒 (“W”)采用該免疫逃避策略。但是，M135R僅具有VV B18R和所有其他來自測序過的痘病毒的IFNa/β-R同系物的一半大小，并在所有的情況中僅與所述同系物的氨基末端這部分對齊(align)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即使免疫熒光結(jié)果表明M135R定位于細(xì)胞表面，但嘗試證明 M135R具有與IFNa/β-R相互作用的能力卻是否定的。盡管得到這些結(jié)果，本發(fā)明人仍然發(fā)現(xiàn)，切除M135R會嚴(yán)重削弱粘液瘤病毒導(dǎo)致宿主動物致病的能力，雖然實施了該切除的粘液瘤病毒在感染并殺死體外細(xì)胞方面與野生型MV同樣有效。因此，一方面，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即，不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒可用于治療具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括用于溶瘤研究，這是因為，由于對于正在進(jìn)行治療的患者來說，不需要任何非常規(guī)的抑制策略(containment strategy)，所以該病毒可提供更為安全的用于溶瘤療法的替代療法。另一方面，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，S卩，抗癌劑雷帕霉素可提高粘液瘤病毒對允許粘液瘤病毒感染的人類腫瘤細(xì)胞的感染率水平，和該雷帕霉素允許某些粘液瘤病毒株在人類腫瘤細(xì)胞(如果沒有雷帕霉素，則其會限制那些粘液瘤病毒株的復(fù)制)中進(jìn)行復(fù)制。允許粘液瘤病毒感染的細(xì)胞是所述病毒能夠進(jìn)入并在其中進(jìn)行有效復(fù)制的細(xì)胞。允許性細(xì)胞在涉及蛋白PTEN、PDK、AKT、GSK、Raf、mT0R或P70S6K的一個或更多個途徑中可能具有缺陷或突變。限制性細(xì)胞是僅在某些條件下對粘液瘤病毒具有允許性，但是在其他條件下則不允許有效感染的細(xì)胞。例如，限制性細(xì)胞對野生型的病毒株是允許的，但是不允許某些突變型粘液瘤病毒株，如已敲除MT-5基因的病毒株進(jìn)行有效復(fù)制。在另一個實例中，對粘液瘤病毒具有限制性的細(xì)胞可能不允許單獨的粘液瘤病毒進(jìn)行有效感染，但是用雷帕霉素處理后，同樣的粘液瘤病毒則能夠有效地感染該細(xì)胞。發(fā)育不全的細(xì)胞系對粘液瘤病毒感染是非允許的，這意味著該病毒能夠進(jìn)入該細(xì)胞，卻不能有效地感染該細(xì)胞。因此，當(dāng)雷帕霉素與粘液瘤病毒組合使用時，其可提高粘液瘤病毒對具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的感染率。本發(fā)明涉及雷帕霉素與粘液瘤病毒的組合在處理具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的應(yīng)用。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯，它是由土壤細(xì)菌吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)純化得到的顯示出抗真菌活性的化合物。此處使用的雷帕霉素是指能夠與FKBP12絡(luò)合并抑制mTOR的雷帕霉素(也稱為西羅莫司)及其類似物或衍生物，包括類似物CCI-779 (也稱為細(xì)胞周期抑制劑-779或雷帕霉素-42，2，2-聯(lián)(羥基甲基)_丙酸) 和RADOOl (也稱為依維莫司或40-0-(2-羥基乙基)-雷帕霉素)。雷帕霉素、CCI-779和 RAD001都可商購獲得，并且雷帕霉素可由Wyeth-Ayerst提供，其名為RapamuneTM。術(shù)語雷帕霉素還包括雷帕霉素的藥物上可接受的鹽類和酯類、其水合物、溶劑化物、多晶型物、類似物或衍生物，以及在使用時，例如施用于患者時可代謝或轉(zhuǎn)化為雷帕霉素或其類似物或衍生物的前藥或前體。作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的雷帕霉素具有高度的特異性它進(jìn)入細(xì)胞并與稱為 FKBP12的細(xì)胞蛋白結(jié)合。然后，雷帕霉素/FKBP12復(fù)合物與特異的細(xì)胞靶mT0R(哺乳動物的雷帕霉素標(biāo)靶)結(jié)合。已經(jīng)表明許多癌癥都是由于諸如P13K等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的過度活性，或者腫瘤抑制基因PTEN的缺失而產(chǎn)生的。這些分子均位于mTOR的上游。已經(jīng)表明mTOR 是細(xì)胞增殖、生長、分化、遷移和存活的重要調(diào)節(jié)劑，因而是在遏制癌細(xì)胞的無控生長中的理想靶。對雷帕霉素敏感的癌細(xì)胞系一般是通過mTOR激活途徑而產(chǎn)生的那些細(xì)胞系。在移植患者中，雷帕霉素主要用作環(huán)孢霉素治療的替代性治療或補(bǔ)充治療。在移植患者中，雷帕霉素治療通常具有比環(huán)孢霉素A或H(S06更小的副作用。另外，回顧性研究表明，接受雷帕霉素治療的患者通常較少地患上癌癥，并且其CMV(巨細(xì)胞病毒皰疹病毒)感染的發(fā)生率也較低。因此，特別是根據(jù)推測雷帕霉素應(yīng)該可以減少CMV的復(fù)制的研究(Ponticelli 的綜述“The pleiotropic effects of mTOR inhibitors，，, J Nephrology 2004 ；17 :762)，令人驚訝的是雷帕霉素治療可增加粘液瘤病毒對癌細(xì)胞的感染。不受任何特定理論的限制，通過與這些細(xì)胞的腫瘤表型有關(guān)的mTOR途徑，粘液瘤病毒可利用不正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因而，利用mTOR抑制劑控制該途徑會對所述病毒具有選擇性優(yōu)勢。因此，本發(fā)明提供對具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞進(jìn)行抑制的方法，該方法包括對所述細(xì)胞施用有效量的粘液瘤病毒。在另一個實施方式中，所述病毒與有效量的雷帕霉素組合施用。粘液瘤病毒可以是屬于有復(fù)制能力的痘病毒的野兔病毒種的任何病毒。所述粘液瘤病毒可以是粘液瘤病毒的野生型病毒株，或粘液瘤病毒的基因修飾病毒株，包括敲除了 MT-5的粘液瘤病毒株。粘液瘤病毒可以是在兔子中具有減毒作用因而可降低患病風(fēng)險的病毒株，包括下述的不表達(dá)功能性M135蛋白的病毒株。在一個具體的實施方式中，所述粘液瘤病毒是不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病
不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒包括具有部分或全部的編碼被刪除的、替代的或中斷的M135R的開放閱讀框架的粘液瘤病毒，從而使該病毒不表達(dá)基因產(chǎn)物、不表達(dá)穩(wěn)定的基因產(chǎn)物或不表達(dá)功能性基因產(chǎn)物。所述病毒還包括具有部分或全部被刪除的、替代的或中斷的M135R基因調(diào)節(jié)區(qū)的粘液瘤病毒，從而使得編碼M135R的基因無法表達(dá)蛋白。功能性M135R蛋白是可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、翻譯后修飾和定位的M135R，并且其可允許粘液瘤病毒導(dǎo)致被感染的宿主患上粘液瘤病。如果M135R蛋白在細(xì)胞內(nèi)不能，或不適當(dāng)?shù)鼗虿怀浞值剡M(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、翻譯后修飾或定位，以致被感染的宿主未患上粘液瘤病，則細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)功能性M135R蛋白。在另一個實施方式中，所述細(xì)胞是對干擾素非應(yīng)答的。在具體的實施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動物癌細(xì)胞。在一個實施方式中，所述細(xì)胞是人類癌細(xì)胞，包括人類實體腫瘤細(xì)胞。在另一個實施方式中，所述細(xì)胞受到病毒的慢性感染。施用的雷帕霉素與粘液瘤病毒的“組合”可以一起配制在同一劑型中，或者可以配制在分開的劑型中，所述分開的劑型可以是相同的形式或不同的形式，通過相同的施用方式或不同的施用方式施用。此外，施用沒有配制在同一劑型中的雷帕霉素與粘液瘤病毒的組合是指雷帕霉素與粘液瘤病毒共施用于被治療的哺乳動物，并且可以同時施用，或者依照任意順序或在不同的時間點依次施用。因此，雷帕霉素與粘液瘤病毒可分開地但時間上應(yīng)足夠接近地施用，以提供所需的治療效果。在這里使用的術(shù)語“有效量”的意思是以一定的劑量在一定時期內(nèi)能有效地獲得所需結(jié)果所必需的量。在這里使用的術(shù)語“具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞”是指這樣的細(xì)胞當(dāng)接觸病毒或被病毒侵入后，該細(xì)胞不誘導(dǎo)抗病毒防御機(jī)制(包括抑制病毒復(fù)制、生成干擾素、 誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答途徑和由或不由干擾素介導(dǎo)的凋亡)，并且因此可以受到MV病毒(單獨的或者組合雷帕霉素處理)的感染。所述術(shù)語包括，相對于正常細(xì)胞(如沒有受到感染的細(xì)胞或非癌細(xì)胞)，當(dāng)與病毒接觸或受病毒感染時具有減弱的或無效的先天性抗病毒應(yīng)答的細(xì)胞。這個術(shù)語包括對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，和具有減弱或無效的凋亡應(yīng)答或誘導(dǎo)凋亡途徑的細(xì)胞。所述缺陷可能由多種原因引起，包括感染、遺傳缺陷或環(huán)境影響。但應(yīng)理解，當(dāng)缺陷是由預(yù)先存在的感染引起時，可能會排斥MV重疊感染，技術(shù)人員能夠容易地鑒別這種情況。技術(shù)人員無需進(jìn)行不適當(dāng)?shù)膶嶒灳湍軌蛉菀椎卮_定任何給定的細(xì)胞類型是否具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷因而能夠被粘液瘤病毒(或者單獨的或者與雷帕霉素處理組合)所感染。例如，VSV經(jīng)常被用于檢測細(xì)胞的抗病毒應(yīng)答。為了評估給定的細(xì)胞類型(如給定的癌細(xì)胞類型)是否具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷，技術(shù)人員可以獲取外植塊，使其一些細(xì)胞在體外生長，并確定被VSV或作為另外一種選擇的粘液瘤病毒(包括與雷帕霉素組合的粘液瘤病毒)感染的感染性。在整個說明書中所使用的術(shù)語“對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞”意思是指這樣的細(xì)胞，該細(xì)胞對干擾素活性如干擾素的抗病毒或抗腫瘤活性不產(chǎn)生應(yīng)答，或者，該細(xì)胞不具有正常的干擾素應(yīng)答，例如，減弱的或無效的干擾素應(yīng)答，或者，該細(xì)胞具有如用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如轉(zhuǎn)錄因子(例如STAT1)的磷酸化或激活所檢測到的不正常的干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如包括但不限于，沒有經(jīng)受增殖抑制的細(xì)胞，或當(dāng)接觸干擾素(其水平在可以對干擾素產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)胞中足以引起所述應(yīng)答)而沒有被殺死的細(xì)胞。對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞可能在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或在應(yīng)答細(xì)胞中被正常激活的途徑中存在缺陷。一般地，對VSV感染的易感性表明對干擾素的非應(yīng)答性，技術(shù)人員可以容易確定特定細(xì)胞是有能力還是沒有能力對干擾素產(chǎn)生應(yīng)答，以在干擾素存在下抑制VSV感染，或者用本領(lǐng)域已知的其它干擾素活性標(biāo)記， 例如，IFN刺激基因(如PKR、STAT、OAS、MX)的表達(dá)水平。在整個說明書中所使用的術(shù)語“有復(fù)制能力”是指病毒能夠在特定宿主細(xì)胞中感染和復(fù)制。這包括病毒單獨存在于特定的宿主細(xì)胞中時其復(fù)制受到抑制，但是用雷帕霉素處理宿主細(xì)胞后該病毒可有效地感染所述細(xì)胞。在這里使用的術(shù)語“細(xì)胞”包括單細(xì)胞，也包括多細(xì)胞或細(xì)胞群。對細(xì)胞施用藥劑包括體外施用和體內(nèi)施用。在這里使用的術(shù)語“動物”包括動物界的所有成員，特別是包括哺乳動物，尤其是人類。術(shù)語“抑制”具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞除了包括使細(xì)胞不能生長或分裂或者減少或延遲細(xì)胞的生長或分裂之外，還包括通過溶解或凋亡引起或者其他細(xì)胞死亡機(jī)制引起的細(xì)胞死亡。使用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，例如Sambrook等“2001)分子克隆 實驗室手冊(Molecular Cloning :a Laboratory Manual)，第三版，冷泉港實驗室出版社 (Cold Spring Harbour Laboratory Press))中所述的技術(shù),可以容易地對粘液瘤病毒基因組進(jìn)行修飾以表達(dá)一種或更多種的治療性轉(zhuǎn)基因。技術(shù)人員能夠容易地確定粘液瘤病毒基因組的哪些部分可以刪除，使得該病毒仍然可以進(jìn)行有效感染。例如，將已公布的病毒基因組序列與其它已被充分表征的病毒基因組進(jìn)行比較，可以推測出病毒基因組可切除的非必要部分(例如參見 C. Cameron，S. Hota-Mitchel 1，L.Chen，J. Barrett, J.-X. Cao， C. Macau lay, D. Wilier, D. Evans 和 G. McFadden，病毒學(xué)(1999064 :298 318)。在這里使用的術(shù)語“治療性基因”或“治療性轉(zhuǎn)基因”意欲廣泛地描述其表達(dá)可以影響所需的結(jié)果，例如，抗癌效果的任何基因。例如，可以對病毒進(jìn)行修飾，使其攜帶可以提高用該病毒治療的抗癌效果的基因。這種基因可以是參與引發(fā)凋亡的基因，或參與靶向受感染細(xì)胞以進(jìn)行免疫破壞的基因，如修復(fù)干擾素應(yīng)答缺陷的基因，或結(jié)果導(dǎo)致表達(dá)刺激抗體應(yīng)答的細(xì)胞表面標(biāo)記(例如細(xì)菌細(xì)胞表面抗原)的基因。所述病毒還可以被修飾，以表達(dá)參與關(guān)閉成瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖和生長，據(jù)此阻止所述細(xì)胞的分裂的基因。同時，所述病毒還可以被修飾以包括治療性基因，如參與化學(xué)治療劑合成的基因，或者，所述病毒可以被修飾以在特定類型細(xì)胞如人類細(xì)胞中具有增強(qiáng)的復(fù)制水平，從所述類型細(xì)胞中衍生出欲抑制或殺死的細(xì)胞?？杀徊迦胝骋毫霾《局幸蕴岣咂淇拱┬Ч幕虻木唧w例子包括編碼 TRAIL蛋白的人類基因或編碼E4或f4多肽的腺病毒基因，兩類所述蛋白都參與殺死人類腫瘤細(xì)胞。應(yīng)該理解，粘液瘤病毒(包括與雷帕霉素組合使用時)的治療效果可以通過病毒對細(xì)胞的溶解或通過病毒輸送治療性產(chǎn)物來獲得。與粘液瘤病毒組合時所包含的雷帕霉素可以增強(qiáng)單獨的粘液瘤病毒的效果。即，與雷帕霉素組合施用的粘液瘤病毒能夠有效地感染比單獨的粘液瘤病毒更多的靶細(xì)胞，或者能夠有效地感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的靶細(xì)胞，而在雷帕霉素不存在時粘液瘤病毒對所述細(xì)胞的有效感染是受到抑制的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備病毒。例如，病毒可以用欲使用的粘液瘤病毒株感染所培養(yǎng)的兔細(xì)胞，使感染繼續(xù)發(fā)展以使所述病毒在所培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制來制備， 并可用本領(lǐng)域已知的破壞細(xì)胞表面的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行釋放，從而釋放用于采集的病毒顆粒。 一旦采集之后，即可通過感染兔細(xì)胞的匯合坪并進(jìn)行噬菌斑檢驗來測定病毒的滴度(見 Mossman 等(1996)，病毒學(xué) 215 17 30)。本發(fā)明還提供了在需要治療的患者中治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)的方法，該方法包括對所述患者施用有效量的粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素。所述患者可以是任何動物，包括哺乳動物，其中包括人類。在這里使用的“特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)”是指任何與具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的存在有關(guān)的、涉及該細(xì)胞的存在的或以存在該細(xì)胞為特征的疾病、障礙或不適，并且可以通過殺死這些細(xì)胞而治療所述疾病、障礙、不適或者其癥狀。例如，所述疾病狀態(tài)可以是癌癥。所述疾病狀態(tài)也可以包括慢性病毒感染?！爸委煛奔膊顟B(tài)是指用于獲得有益的或所需的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有益的或所需的臨床結(jié)果可以包括但不限于，減輕或改善一種或更多種癥狀或不適、減小病癥程度、穩(wěn)定疾病狀態(tài)、防止疾病發(fā)展、防止疾病傳播、推遲或減緩疾病進(jìn)程、推遲或減緩疾病的發(fā)作、改善或減輕疾病狀態(tài)、以及(部分或完全)恢復(fù)?！爸委煛边€可以指延長患者的生存時間，該生存時間長于所預(yù)測的不經(jīng)治療的生存時間。“治療”還可以指抑制疾病進(jìn)程、暫時減緩疾病進(jìn)程，不過更為優(yōu)選的是包括持久地中止疾病進(jìn)程。在一個實施方式中，所述疾病狀態(tài)是癌癥。所述癌癥可以是任何類型的癌癥，其中，盡管不必是全部細(xì)胞，但至少有一些細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。在一個實施方式中，所述癌癥可以是其中至少有一些細(xì)胞是對干擾素非應(yīng)答的癌癥。在這里使用的術(shù)語“腫瘤”、“腫瘤細(xì)胞”、“癌癥”和“癌細(xì)胞”(可以互換使用)是指表現(xiàn)出不正常生長的細(xì)胞(其特征為細(xì)胞增殖明顯失去控制)或已經(jīng)被無限增殖化的細(xì)胞。術(shù)語“癌癥”或“腫瘤”包括轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌癥或腫瘤。在這里使用的“成瘤的”或“瘤”泛指以不具有正常生長抑制機(jī)制增殖的一個細(xì)胞或多個細(xì)胞，因此除了癌細(xì)胞以及發(fā)育異常細(xì)胞或增生細(xì)胞之外， 還包括良性腫瘤。癌癥，包括惡性腫瘤的存在，可以用本領(lǐng)域普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的癌癥類型包括但不限于，包括白血病和淋巴瘤在內(nèi)的造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎臟癌(kidney cancer)、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、 口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤和其它任何腫瘤。實體瘤如肉瘤和癌包括但不限于，纖維肉瘤、粘液肉瘤、 脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴樣惡性腫瘤、胰癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、 鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳突樣腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎臟細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、膀胱癌和CNS(中樞神經(jīng)系統(tǒng))腫瘤(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤 (craniopharyogioma)、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、 髓膜瘤(menangioma)、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。
在另一個實施方式中，所述疾病狀態(tài)是慢性病毒感染。所述慢性感染病毒可以是在動物細(xì)胞中以持續(xù)方式長期進(jìn)行感染和復(fù)制從而導(dǎo)致病理狀態(tài)的任何病毒。所述慢性感染病毒可以是與癌的發(fā)展有關(guān)或相關(guān)的病毒。病毒慢性感染可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行診斷。例如，慢性病毒感染可以通過患者中抗病毒抗體的存在來檢測，或者通過對患者細(xì)胞中病毒RNA或DNA的存在測試呈陽性來檢測。當(dāng)給患者施用時，粘液瘤病毒，以及可選的粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合的有效量是以一定的劑量在足夠長的期間內(nèi)，對于病毒減輕、改善、緩和、改進(jìn)、穩(wěn)定、防止傳播、延緩或推遲進(jìn)程或治愈疾病來說所需要的量。例如，有效量可以是足以獲得以下效果的量降低癌細(xì)胞或成瘤細(xì)胞的數(shù)目或?qū)⑵淦茐?；或者降低病毒慢性感染?xì)胞的數(shù)目或?qū)⑵淦茐模?或者抑制所述細(xì)胞的生長和/或增殖。對患者施用的有效量可以根據(jù)許多因素而變化，所述因素例如粘液瘤病毒與可選的雷帕霉素的藥效特性；給藥方式；患者的年齡、健康狀況和體重；疾病狀態(tài)的性質(zhì)和程度、治療的頻度、同時進(jìn)行的治療的類型(如果有的話)，以及病毒的毒力和滴度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于上述因素決定粘液瘤病毒的適當(dāng)施用量。根據(jù)患者的臨床反應(yīng)，病毒最初施用的適當(dāng)量可以按需進(jìn)行調(diào)整。可以根據(jù)安全施用的最大病毒量和產(chǎn)生所需結(jié)果的最小病毒量，憑借經(jīng)驗決定病毒的有效量?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的給藥方法對患者施用粘液瘤病毒。在一個實施方式中，病毒的施用是全身給藥。在另外一個實施方式中，通過在患處注射來施用病毒。在一個特定實施方式中，所述疾病狀態(tài)是實體瘤，并且通過在腫瘤部位注射而施用病毒。在許多實施方式中，病毒的施用可以通過口服或胃腸外給藥進(jìn)行，或者采用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。當(dāng)對病毒進(jìn)行全身給藥時，為了使其臨床效果與在患處注射病毒所獲得的臨床效果相同，需要施用明顯更多的病毒量。但是，適當(dāng)?shù)膭┝克綉?yīng)該是能夠獲得所需效果的最小量。待施用的病毒的濃度決定于欲施用的具體的粘液瘤病毒株的毒力和靶向細(xì)胞的性質(zhì)。在一個實施方式中，對人類患者施用低于約IO9個空斑形成單位(“pfu”)的劑量。 在各種實施方式中，可以以單劑量施用約IO2Pfu 約lOYfu、約K^pfu 約l(fpfu、約 103pfu 約 IO6Pfu 或約 IO4Pfu 約 l(^pfu。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以利用上述因素決定對患者施用的雷帕霉素的適宜量?？梢愿鶕?jù)欲施用的病毒量和病毒株、可安全施用的雷帕霉素的最大量和為提高粘液瘤病毒感染率所施用的雷帕霉素的最小量，憑借經(jīng)驗決定雷帕霉素的有效量?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的給藥方法對患者施用雷帕霉素。在一個實施方式中，雷帕霉素的施用是全身施用。在另外一個實施方式中，通過在患處注射來施用雷帕霉素。在一個特定實施方式中，所述疾病狀態(tài)是實體瘤，并且通過在腫瘤部位注射而施用雷帕霉素。在許多實施方式中，雷帕霉素的施用是通過口服或胃腸外給藥進(jìn)行，或者采用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。可在一天或數(shù)天的時間內(nèi)以單劑量或多劑量施用全量的雷帕霉素。劑量施用的頻度和持續(xù)時間可以容易地確定。給藥安排取決于施用粘液瘤病毒時間的長短。例如，雷帕霉素可一次性施用于患者，也可以每天施用2 4次。
在各種實施方式中，雷帕霉素的劑量可為約0. Olmg/每天/每千克體重 約 250mg/每天/每千克體重、約0. Olmg/每天/每千克體重 50mg/每天/每千克體重、約 0. 05mg/每天/每千克體重 IOmg/每天/每千克體重或約0. Img/每天/每千克體重 7. 5mg/每天/每千克體重。根據(jù)最初治療方案的效果，可以重復(fù)提供有效量的粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合。一般是周期性給藥，同時監(jiān)視所產(chǎn)生的任何反應(yīng)。應(yīng)該認(rèn)識到，技術(shù)人員可以根據(jù)給藥的時間表和所選擇的給藥途徑來施用低于或高于如上所示的劑量。粘液瘤病毒和可選的組合雷帕霉素可以作為單獨療法給藥，或者可以結(jié)合其它治療方法(包括化學(xué)療法、放射療法或其它抗病毒療法)進(jìn)行給藥。例如，可以在外科手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤之前或之后，或者在實施放射療法或施用傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物之前或同時或之后施用粘液瘤病毒和可選的組合雷帕霉素。在一個實施方式中，粘液瘤病毒和可選的組合雷帕霉素可以與其它溶瘤病毒聯(lián)合施用或順次施用，所述其它溶瘤病毒可以針對不同的腫瘤細(xì)胞類型顯示出特異性。為了有助于給藥，可以將粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素制成藥物組合物中的組分。因此，在另外的一個實施方式中，提供了含有粘液瘤病毒、可選的雷帕霉素和藥學(xué)上可接受的稀釋劑的藥物組合物。因此，本發(fā)明一方面還包括所述藥物組合物，該藥物組合物用于抑制具有先天性抗病應(yīng)答缺陷的細(xì)胞或治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述組合物通常含有藥學(xué)上可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑和各種可兼容的載體。對于所有形式的輸送，可以將所述重組的粘液瘤病毒制備成生理鹽溶液。所述藥物組合物還可以含有其它治療劑，如其他的抗癌劑。在一個實施方式中，所述組合物包含化學(xué)治療劑。例如，所述化學(xué)治療劑實質(zhì)上可以是任何藥劑，只要該藥劑針對患者的癌細(xì)胞或成瘤細(xì)胞表現(xiàn)出溶瘤效果并且不抑制或不降低粘液瘤病毒的腫瘤殺死效果即可。例如，所述化學(xué)治療劑可以是但不限于，蒽環(huán)類抗生素、烷化劑、烷基磺酸鹽、吖丙啶、氮丙啶、甲基蜜胺(methylmelamine)、氮芥、亞硝基脲、抗生素、抗代謝物、葉酸類似物、 嘌呤類似物、嘧啶類似物、酶、鬼白毒素、含鉬劑或細(xì)胞因子。優(yōu)選的是，所述化學(xué)治療劑是已知可以有效對抗特定類型的癌細(xì)胞或成瘤細(xì)胞的化學(xué)治療劑。藥學(xué)上可接受稀釋劑的比例和種類可根據(jù)所選擇的給藥途徑、與活病毒的相容性、與雷帕霉素的化學(xué)穩(wěn)定性的可適用的相容性和標(biāo)準(zhǔn)的制藥實踐來確定。一般地，藥物組合物可以采用不顯著損害所述粘液瘤活病毒的生物特性，或不導(dǎo)致選擇性包含的雷帕霉素的降解或穩(wěn)定性或功效降低的組分進(jìn)行配制。藥物組合物可以通過已知制備方法進(jìn)行制備，該已知制備方法用于制備適合給患者施用的藥學(xué)上可接受的組合物，使得可以將有效量的一種或多種活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體組合成混合物。適合的載體，例如，在Remington的制藥科學(xué)中進(jìn)行了描述(Remington’ s Pharmaceutical Sciences， Mack Publishing Company, Easton， Pa.， USA1985)。基于此，所述組合物包括但不限于，與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合并含在具有適當(dāng)PH且與生理液體等滲的緩沖液中的粘液瘤病毒和可選的雷帕霉素的溶液。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，根據(jù)所選擇的給藥途徑，所述藥物組合物可以以各種形式對患者施用。本發(fā)明的組合物可以通過口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、透上皮、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、鞘內(nèi)、直腸和局部方式給藥?？梢酝ㄟ^在選定的一段時間內(nèi)連續(xù)輸注進(jìn)行胃腸外給藥。所述藥物組合物可以與例如惰性稀釋劑或與可同化的載體一起口服施用，或者， 其可以被包裹在硬的或軟的殼狀明膠膠囊中施用，或者壓成片劑施用。對于口服治療給藥， 粘液瘤病毒與可選的雷帕霉素可以與賦形劑混合，并以可吸收片劑、含服片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑和薄片劑(wafer)等形式使用。粘液瘤病毒與可選的雷帕霉素的溶液可以在生理學(xué)上適宜的緩沖液中制備。在普通的貯藏和使用條件下，這些制備物含有防腐劑，以防止微生物的生長，但所述防腐劑不能使所述活病毒失活。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道如何制備適當(dāng)?shù)闹苿?。選擇并制備適當(dāng)制劑的傳統(tǒng)工藝和組分在例如以下文獻(xiàn)中有描述=Remington的制藥科學(xué)和1999年出版的美國藥典國家處方集(The United States Pharmacopeia :The National Formulary, USP 24NF19)。在不同實施方式中，所述組合物通過在諸如腫瘤部位等患處直接注射(皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等)進(jìn)行施用，或者口服施用，作為選擇，可以經(jīng)皮施用。所述藥物組合物的適合注射使用的劑型包括無菌水性溶液或分散液和用于臨時制備無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉劑，其中，術(shù)語無菌不延及欲施用的活粘液瘤病毒本身。在所有的情況下，所述劑型必須是無菌的，并且流動性必須達(dá)到使其容易注射的程度。欲使用的藥物組合物的劑量取決于被治療的具體疾病、疾病的嚴(yán)重性、患者的個體參數(shù)(包括年齡、身體條件、身高和體重)、治療的持續(xù)時間、同時進(jìn)行的療法的特性(如果有的話)、具體的給藥途徑，以及在保健人員的知識和專業(yè)技能范圍內(nèi)的其它類似因素。 這些因素對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且可以通過少量常規(guī)實驗來解決。粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素，或含有粘液瘤病毒與雷帕霉素(不管是在同一制劑中還是在不同的制劑中)的藥物組合物也可以包裝成試劑盒，該試劑盒包含粘液瘤病毒與雷帕霉素的使用說明書，所述的使用包括，使用粘液瘤病毒，或使用粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合來抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，或者，在需要的患者中，使用粘液瘤病毒，或使用粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合來治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述疾病狀態(tài)可以是癌癥，或者可以是慢性病毒感染。本發(fā)明還考慮到了粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素在抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的應(yīng)用。在一個實施方式中，所述細(xì)胞對干擾素是非應(yīng)答的。本發(fā)明還提供粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素在治療需要的患者中的、特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)中的應(yīng)用。在一個實施方式中，所述疾病狀態(tài)是癌癥。 本發(fā)明還提供粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞或用于治療需要的患者中的、特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。MV可選擇性感染除MV的天然宿主以外的動物中的或來自該動物的細(xì)胞群中的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。MV的這種能力提供了 MV在從培養(yǎng)物或動物的細(xì)胞群中檢測出具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的應(yīng)用，所述細(xì)胞包括對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。否則，這些細(xì)胞可能不容易被檢測到，例如，在動物中，還未發(fā)展成可觸知的腫瘤或還未引起可察覺病癥的某些癌細(xì)胞。因而，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了在患者中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對所述患者施用經(jīng)修飾而可以表達(dá)可檢測標(biāo)記的粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素；使所述病毒感染所述患者中具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞；和檢測所述患者中表達(dá)所述可檢測標(biāo)記的細(xì)胞?？梢允褂檬乖\斷圖像可視化的任何傳統(tǒng)方法來檢測被感染的細(xì)胞。所述檢測方法取決于所使用的具體的可檢測標(biāo)記。例如，可以使用熒光數(shù)字成像顯微鏡檢測被經(jīng)過基因修飾而表達(dá)熒光蛋白的粘液瘤病毒感染的細(xì)胞。其它方法包括計算機(jī)控制X線斷層攝影術(shù) (CT)、全身掃查如正電子發(fā)射X線斷層攝影術(shù)(PET)、磁共振成像(MRI)和超聲波檢查法。 熟練技術(shù)人員能夠決定用于檢測具體可檢測標(biāo)記的適當(dāng)方法?？蓹z測標(biāo)記包括但不限于如下的任何標(biāo)記，S卩，用于表達(dá)或合成該標(biāo)記的基因可以插入到粘液瘤病毒基因組中，以在被經(jīng)修飾的病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)或合成所述標(biāo)記。 例如，在一個實施方式中，可檢測標(biāo)記可以是熒光蛋白?？梢詫颊呤┯盟鲂揎棽《荆允共《靖腥救魏尉哂邢忍煨钥共《緫?yīng)答缺陷的細(xì)胞，并使可檢測標(biāo)記在所述細(xì)胞中以可檢測的水平表達(dá)，然后以適當(dāng)?shù)臅r間間隔檢測被感染的細(xì)胞。例如，可以在對患者施用經(jīng)基因修飾而表達(dá)熒光蛋白的病毒后2 20天之間的任何時候進(jìn)行檢測。檢測方法可以在患者中間斷性地重復(fù)進(jìn)行，以監(jiān)測所述患者中具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的存在。例如，用粘液瘤病毒檢測所述細(xì)胞的方法，如有必要，可以按6個月、1年或2年的間隔在患者中進(jìn)行，這取決于具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的特性和由所述細(xì)胞在患者中的存在所導(dǎo)致的任何疾病狀態(tài)的特性。重復(fù)所述方法一段時間，以監(jiān)測疾病狀態(tài)的發(fā)展或緩解，或疾病在患者體內(nèi)的擴(kuò)散。粘液瘤病毒能夠選擇性地感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，并且可以在細(xì)胞中用作所述缺陷的指示物。因此，用本發(fā)明的方法，可以對從患者中取出的細(xì)胞進(jìn)行先天性抗病毒應(yīng)答缺陷檢測。當(dāng)與其它指示物結(jié)合時，這種檢測可以指示患者可能患有特定的疾病狀態(tài)，例如癌癥。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了檢測樣品中具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括培養(yǎng)所述細(xì)胞；使所培養(yǎng)的細(xì)胞與粘液瘤病毒和選擇性組合的雷帕霉素接觸；以及檢測細(xì)胞受到粘液瘤病毒感染的感染性。所述細(xì)胞可以通過已知活組織檢查方法從包括人類受試對象在內(nèi)的受試對象中取出。所述活組織檢查方法決定于待檢細(xì)胞的位置和類型。按照已知培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞，并通過往培養(yǎng)基中加入活粘液瘤病毒和可選的雷帕霉素而使所述細(xì)胞與MV和可選的雷帕霉素接觸。在組合添加粘液瘤病毒與雷帕霉素時，所述病毒與雷帕霉素可同時加入或依次加入。使用已知接觸MV后會被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物作為陽性對照，可改變感染復(fù)數(shù)(“Μ0Ι”)，包括在雷帕霉素存在的情況下的感染復(fù)數(shù)，以確定對于給定細(xì)胞類型、密度和培養(yǎng)技術(shù)以及具體的雷帕霉素濃度的最佳Μ0Ι。雷帕霉素的量和在培養(yǎng)細(xì)胞中加入雷帕霉素與粘液瘤病毒的時機(jī)因細(xì)胞的類型、 培養(yǎng)方法和病毒株而異。通過使用常規(guī)方法的少量測試，可容易地測試并調(diào)整所述參數(shù)。所培養(yǎng)的細(xì)胞被MV感染的感染性(包括在雷帕霉素存在的情況下的感染性)可以通過技術(shù)人員已知的各種方法進(jìn)行檢測，包括對MV導(dǎo)致細(xì)胞死亡的能力進(jìn)行檢測。也可以包括將試劑加入所述細(xì)胞培養(yǎng)物，以完成其與病毒表達(dá)產(chǎn)物的酶促反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)。所述病毒表達(dá)產(chǎn)物可以由插入到MV基因組中的報告基因來表達(dá)。在一個實施方式中，可以對MV進(jìn)行修飾，以使對感染狀態(tài)的檢測變得容易。例如， 可以對MV進(jìn)行基因修飾以表達(dá)標(biāo)記，該標(biāo)記可通過相差顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)或放射性成像術(shù)而容易地進(jìn)行檢測。所述標(biāo)記可以是參與比色反應(yīng)或放射標(biāo)記反應(yīng)的所表達(dá)的熒光蛋白或所表達(dá)的酶。在另一個實施方式中，所述標(biāo)記是破壞或抑制受檢細(xì)胞特定功能的基因產(chǎn)物。通過下列非限制性實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實施例實施例1 粘液瘤病毒對小鼠和人類細(xì)胞系的感染病毒株所使用的病毒株包括野生型MV、經(jīng)修飾而表達(dá)綠色熒光蛋白(“GFP”)或β -半乳糖苷酶(“LacZ”)的MV，以及已被殺死(“死”)的MV。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對病毒進(jìn)行制備和滴定。細(xì)胞系利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(“MEF”)進(jìn)行小鼠試驗，所述小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來自野生型小鼠和經(jīng)以下敲除的小鼠IFNa/i3受體純合敲除、STATl純合敲除、PKR雜合敲除、RNase L雜合敲除、Mxl雜合敲除、PKR/RNase L/Mxl三重純合敲除。以BGMK對照細(xì)胞和人類腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行人類試驗，所述人類腫瘤細(xì)胞系為HD9、 H0P92、0VCAR4、0VCAR5、SK-MEL3、SK-MEL28、M14、SK0V3、PC3、DU145、CAKI_1、786_0、T47D、 MDAMB 4!35、SF04、U87、A172、U373、Daoy 和 D384 JnMojdl 等所述(癌細(xì)胞(Cancer Cell), (2003)4 263 275)。方法一般地，分析和試驗如 Lalani 等在 Virology ((1999) 256 :233 245)、 Johnston 等在 J Virology ((2003) 77 (13) :7682 7688)以及 Sypula 等在 Gen Ther Mol Biol ((2004) 8 103)中所述進(jìn)行。對于體內(nèi)小鼠研究，將人類顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87植入裸鼠。植入后15天，用活的或死的MV GFP對小鼠進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，滴度為5X106，或進(jìn)行模擬感染。感染后72小時， 殺死動物，取出大腦，埋入OCT(最佳切溫復(fù)合物)，切制冷凍切片。通過熒光顯微術(shù)可以看到整個大腦切片中的粘液瘤病毒-GFP。然后固定切片，并用H&E(蘇木精和曙紅)染色，使腫瘤可視化。對于人類腫瘤細(xì)胞分析，手術(shù)一結(jié)束即進(jìn)行腫瘤胰蛋白酶化(trypsonized)并鋪板，第二天，用病毒進(jìn)行感染，MOI為0. 1、1.0或10。在感染后M小時和48小時，分別用相位顯微術(shù)和熒光顯微術(shù)收集有關(guān)細(xì)胞毒性和病毒表達(dá)的數(shù)據(jù)。利用黃色四唑鹽MTT進(jìn)行檢測，以定量感染后48小時、72小時或96小時的細(xì)胞存活率％ (為模擬感染存活的細(xì)胞的百分比)。用10M. 0. I的粘液瘤病毒-GFP感染人類小兒髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Daoy和D384。感染后72小時，用MTT檢測細(xì)胞的生存能力。結(jié)果小鼠細(xì)胞系的感染
以前研究表明，用趨化因子受體轉(zhuǎn)染的某些小鼠3T3細(xì)胞克隆可以被粘液瘤病毒感染，而其它克隆則不能。為了研究粘液瘤病毒在其它小鼠細(xì)胞中的趨向性是否取決于任何特定受體，發(fā)明人研究來自野生型(WT)小鼠和各種基因敲除小鼠的原初小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)。因為IFN在建構(gòu)抗病毒應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，所以發(fā)明人假定，限制性表型與IFN介導(dǎo)的“抗病毒狀態(tài)”有關(guān)。用抗體中和循環(huán)的IFN，或者產(chǎn)生IFN受體陰性小鼠或胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因缺失了的小鼠，而破壞IFN系統(tǒng)的事件鏈，將嚴(yán)重?fù)p害宿主對粘液瘤病毒的抗性，所述粘液瘤病毒一般不感染正常小鼠細(xì)胞。為了檢驗這種假設(shè)，發(fā)明人需要證明粘液瘤病毒在非允許細(xì)胞中的非感染性是否是因為IFN的抗病毒作用。對敲除了一種或多種參與胞內(nèi)IFN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答的蛋白的各種 MEF細(xì)胞類型進(jìn)行檢驗，以了解MV感染對IFN途徑的影響。對原初MEF進(jìn)行的實驗證明，野生型(“WT”)MEF沒有被粘液瘤病毒感染。當(dāng)通過用抗IFNa /β的中和抗體阻斷IFN途徑時，完全可以用粘液瘤病毒感染MEF (圖2)。但是，與抗IFN γ中和抗體接觸的MEF仍然保持非允許。這在總體上說明了 IFNa/β，而不是 IFNy，在為粘液瘤病毒體外感染MEF創(chuàng)造允許環(huán)境中的重要性。在文獻(xiàn)中已經(jīng)確定了不同的IFNa/β和IFNY胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。但是，與所培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞不同，IFN α / β和 IFNy均可能在被感染的宿主中起重要作用。發(fā)明人推測，在IFNa/β和/或IFN γ途徑中存在缺陷的人類腫瘤對粘液瘤病毒的體內(nèi)感染是易感性的。發(fā)明人測定了 STATl和STAT2在MV感染的非允許WT MEF中的活性。在圖3中顯示的結(jié)果表明，STATl和STAT2被激活。進(jìn)一步研究表明，STAT3、STAT4和STAT5沒有被激活(圖4)。為了確定IFN α / β胞內(nèi)途徑在保持MEF非允許狀態(tài)中的重要性，進(jìn)行基因缺失研究，以使IFN α / β受體和胞內(nèi)級聯(lián)受到破壞。進(jìn)行IFN受體或JAKl或STATl的基因缺失。 用 MV 感染 WT MEF、IFN α / β R-/-MEF 禾口 STAT1—/—MEF。 IFN α / β R-/-MEF 禾口 STAT1—/—MEF 對MV是允許的，證明IFN α / β和STATl的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)對MV感染是關(guān)鍵的(圖5)。蛋白激酶R(I3KR)是在眾多細(xì)胞中受到IFNa /β誘導(dǎo)的酶。這種激酶在dsRNA(雙鏈RNA)存在時，經(jīng)受自體磷酸化作用，然后磷酸化多個細(xì)胞蛋白，包括真核蛋白合成起始因子(eIF-2 a)，該真核蛋白合成起始因子的磷酸化可以誘導(dǎo)對蛋白翻譯的抑制和凋亡。 RNase L的激活中也指示H(R。發(fā)明人檢測了 MV感染后PKR在非允許MEF中的激活。在建立了良好的抗病毒狀態(tài)的非允許MEF中，PKR未被磷酸化(圖6)。而且，MV感染抑制了 PKR 的磷酸化(圖7)。另外，粘液瘤病毒感染后，PERK (與PKR類似，ER激酶)在原初WT MEF 中未被磷酸化(圖8)。用MV感染H(R、RNase L或Mxl單基因敲除了的MEF (圖9)。發(fā)現(xiàn)PKR、RNase L或 Mxl對保持粘液瘤病毒感染非允許性是非必需的。為了進(jìn)一步確認(rèn)H(R、RNase L或Mxl的非必需性，進(jìn)行 H(R-/-、RNase L-/-和 Mxl-/-的三重敲除。PKR-/">RNase L-/-和 Mxl-/-的三重敲除并未有助于粘液瘤病毒的感染(圖10)，但是，用抗干擾素α/β的中和抗體處理 PKR,RNase L和Mxl三重KO(三重敲除)的MEF，其對粘液瘤病毒感染變得允許(對比圖10 和圖11)。這些實驗證明，PKR、RNase L和Mxl對于介導(dǎo)MEF對MV的非允許性不是必需的。為了檢測MV感染后，eIF_2a和PKR在非允許的野生型MEF和允許的IFN a /β R-/-MEF和STAT1-/-MEF中的激活，進(jìn)行了進(jìn)一步的實驗。MV感染后，盡管PKR在允許的和非允許的MEF中均未被磷酸化，但eIF-2 α在兩種情況下均被磷酸化(圖12)。這證明沒有PKR和PERK的參與，抗病毒狀態(tài)由導(dǎo)致eIF2 α磷酸化的其它途徑介導(dǎo)。粘液瘤病毒感染非允許的H(R、RNase L和Mxl三重敲除后的MEF后，STATl同時發(fā)生絲氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化(圖13)。還顯示了粘液瘤病毒感染后，酪氨酸磷酸化的 STATl在非允許PKR-/-+RNase L-/-+Mxl-/_MEF中的亞細(xì)胞定位(圖14)。總之，這些結(jié)果表明，平行的H(R/PERK獨立的涉及IFN/STAT1的抗病毒途徑對痘病毒趨向性是關(guān)鍵的。而且，eIF2a磷酸化是IFN抗病毒作用最好的標(biāo)記。結(jié)果人類腫瘤研究發(fā)明人在體內(nèi)系統(tǒng)中研究了 MV感染人類腫瘤細(xì)胞的能力。用人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞注射裸鼠，隨后形成顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤?；畈《灸軌蚋腥具@些人類腫瘤細(xì)胞，但不感染周圍細(xì)胞(圖15)。在圖16中顯示來自GFP的熒光信號定位于腫瘤。假設(shè)許多人類腫瘤對干擾素是非應(yīng)答的，并且，與在正常人類細(xì)胞所發(fā)現(xiàn)的IFN 信號級聯(lián)相比，腫瘤細(xì)胞沒有正常的IFN信號級聯(lián)，發(fā)明人進(jìn)行了研究以探索粘液瘤病毒對人類腫瘤的影響。結(jié)果概括如下。最初，使用粘液瘤病毒來研究對各種對照和人類腫瘤細(xì)胞系BGMK、HT29、H0P92、 0VCAR4、SK-MEL3和SK-MEL28的感染性和胞溶作用。MV顯示出各種感染性和胞溶效果 Η ^9(圖 17)、Η0Ρ92(圖 18)、0VCAR4(圖 19)、SK_MEL3(圖 20)、SK_MEL28(圖 21)禾Π BGMK (圖 22)。對其它腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了檢驗，以下表1將所檢驗的各種腫瘤類型分為允許或非允許。表1粘液瘤病毒對人類腫瘤細(xì)胞的趨向性
權(quán)利要求
1.有效量的不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述藥物配制用于與有效量的雷帕霉素組合施用。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞對干擾素是非應(yīng)答的。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞顯示出不正常的干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞受到病毒的慢性感染。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞為人類癌細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述癌為實體瘤、造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎臟癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、 前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌或黑素瘤。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或星形細(xì)胞瘤細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述藥物通過注射到癌癥的部位來進(jìn)行施用。
10.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述藥物是全身施用。
11.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述粘液瘤病毒為野生型病毒。
12.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述粘液瘤病毒是經(jīng)過基因修飾的。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中，所述粘液瘤病毒經(jīng)過基因修飾而表達(dá)治療性基因。
14.有效量的不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于治療患者的疾病狀態(tài)，其中，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述藥物配制用于與有效量的雷帕霉素組合施用。
16.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述疾病狀態(tài)為癌癥。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥為實體瘤、造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、 腎臟癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌或黑素瘤。
18.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥為肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、腎臟癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤。
19.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述藥物施用通過注射到癌癥的部位來進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述藥物施用是全身施用。
21.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述疾病狀態(tài)為慢性病毒感染。
22.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述患者為人類。
23.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述粘液瘤病毒為野生型病毒。
24.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中，所述粘液瘤病毒是經(jīng)過基因修飾的。
25.如權(quán)利要求M所述的應(yīng)用，其中，所述粘液瘤病毒經(jīng)過基因修飾而表達(dá)治療性基因。
26.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒。
27.如權(quán)利要求沈所述的藥物組合物，該藥物組合物還含有雷帕霉素。
28.如權(quán)利要求沈所述的藥物組合物，該藥物組合物還含有其他治療劑。
29.如權(quán)利要求沈所述的藥物組合物，其中，所述其他治療劑為化學(xué)治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及粘液瘤病毒與雷帕霉素的組合在治療性處理中的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及粘液瘤病毒的組合(包括與雷帕霉素的組合)在治療中的應(yīng)用。采用雷帕霉素進(jìn)行的治療可增強(qiáng)粘液瘤病毒選擇性地感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞(包括對干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞)的能力。雷帕霉素與粘液瘤病毒的所述組合可以用于治療特征為存在所述細(xì)胞的疾病，包括癌癥。本發(fā)明還涉及不表達(dá)功能性M135R的粘液瘤病毒在治療中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102357104SQ20111030675
公開日2012年2月22日 申請日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者格蘭特·麥克法登, 瑪麗安·斯坦福, 約翰·巴雷特 申請人:羅巴斯研究機(jī)構(gòu)