專利名稱：一種用于防治奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以預(yù)防和治療奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑，具有抗菌、無毒、無副作用、無殘留、易于生殖道定植的特點，還可提高母畜產(chǎn)雌性家畜的幾率，可廣泛應(yīng)用于防治奶牛生殖道感染。
背景技術(shù)：
在臨床上，由于奶牛陰道的生理性和病理性損害，而導(dǎo)致的奶牛生殖道感染，以及繼發(fā)性的生殖道病變，是非常普遍的現(xiàn)象。預(yù)防和治療生殖道疾病，現(xiàn)今國內(nèi)獸藥市場，均使用化學(xué)合成類藥物，治療效果雖然顯著，但導(dǎo)致了動物機體產(chǎn)生了耐藥性，畜產(chǎn)品內(nèi)有藥物殘留，對人體的健康造成了嚴(yán)重的威脅。寄生于正常奶牛陰道內(nèi)的微生物群有真菌、原蟲和病毒等，主要棲居在陰道的黏膜及皺褶處，乳酸菌是陰道正常菌群中數(shù)量較多、最重要的常住菌群，在維持陰道微生態(tài)平衡中起重要作用。張維軍等(健 康奶牛產(chǎn)道內(nèi)正常菌群的研究，家畜生態(tài)學(xué)報，第27卷第4期，2006)從奶牛產(chǎn)道分離細(xì)菌150株，其中乳酸桿菌46株，表皮葡萄球菌39株，無乳鏈球菌21株，大腸桿菌23株，芽孢桿菌8株，棒狀桿菌5株，念珠菌8株；鄧洪宇等(奶牛陰道嗜酸乳桿菌的分離鑒定，現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2009年第7期)從奶牛陰道中篩選出一株產(chǎn)酸革蘭氏陽性桿菌。雖然對奶牛陰道菌群組成有了一定的認(rèn)識，但關(guān)于其在防治奶牛生殖道感染的應(yīng)用研究還未見報導(dǎo)。本發(fā)明利用以菌治菌的原理，將健康奶牛陰道內(nèi)最具有優(yōu)勢的乳酸菌分離出來，再回歸到患有疾病的動物體內(nèi)，既利于菌株的定植，又有抑制病原菌的作用，并且克服了化學(xué)藥物對機體的損害，解決了藥物在機體內(nèi)的殘留問題，而且利于奶牛產(chǎn)母畜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種可以預(yù)防和治療奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑，與抗生素類藥物相比，具有抗菌、無毒、無副作用、無殘留、易于生殖道定植的特點，還可提高母畜產(chǎn)雌性家畜的幾率，可廣泛應(yīng)用于防治奶牛生殖道感染的藥物。本發(fā)明使用鑒別性培養(yǎng)基和經(jīng)典的微生物學(xué)分離鑒定方法以及分子生物學(xué)鑒定方法，將健康奶牛陰道內(nèi)最具有優(yōu)勢的乳酸菌分離、鑒定出來，此舉主要便于乳酸菌對奶牛生殖道系統(tǒng)的回歸定植，然后選擇最佳的兩種乳酸菌，通過小鼠的安全性檢測，檢測其無毒，在將其進(jìn)行對病原菌拮抗性的檢測，結(jié)果顯示拮抗效果明顯，而后摸索出此兩菌種的工藝過程及制劑劑型，最后用于動物體，用以預(yù)防和治療奶牛生殖道的感染。為了方便公眾獲得，該兩株乳酸菌可以通過國內(nèi)商業(yè)渠道購買，分別為雙奇公司的SQ00048和SQ00054乳酸菌。本發(fā)明的優(yōu)點在于:此兩株乳酸菌性能優(yōu)良，發(fā)酵用時短，產(chǎn)酸量大，凍干穩(wěn)定性較好，活菌數(shù)較多，且無毒、拮抗效果明顯。尤其SQ00048菌株具有產(chǎn)過氧化氫的特點；此菌株所作的微生態(tài)制劑，無毒、無副作用、拮抗效果明顯，用于動物體無殘留，且增加母畜的產(chǎn)雌性幾率，具有良好的預(yù)防治療效果；制備方法實用性強、操作簡單、周期短、步驟簡便合理，具有成本低、產(chǎn)率高、適宜規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點。本發(fā)明的一個目的是提供一種用于防治奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑的制備方法，具體步驟為:將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，制成片劑、膠囊及散劑。其中，SQ00048的菌粉的制備過程為:SQ00048的最佳發(fā)酵時間為8h，發(fā)酵溫度為40°C，厭氧培養(yǎng)；將所得發(fā)酵液15000g離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌泥，加入保護(hù)劑，攪拌均勻，傾注進(jìn)凍干機中凍干，得到白色粉末狀菌粉；其中，SQ00048的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基:1.2%乳糖，0.8%牛肉膏，0.4%檸檬酸三胺，0.4%乙酸鉀，0.04%硫酸鎂，0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.08%吐溫-80。其中，SQ00054的菌粉的制備過程為:SQ00054的最佳發(fā)酵時間為8h，發(fā)酵溫度為40°C，厭氧培養(yǎng)；將所得發(fā)酵液15000g離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌泥，加入保護(hù)劑，攪拌均勻，傾注進(jìn)凍干機中凍干，得到白色粉末狀菌粉；其中，SQ00054的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基^^蔗糖^^^牛肉膏，。.25%磷酸氫二鈉，0.25 %磷酸二氫鉀，0.01 %硫酸鎂，0.05 % L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.1 %吐溫-80。在本發(fā)明一個具體技術(shù)方案中，保護(hù)劑成分及添加比例為:在300ml體系中加入20ml 50%脫脂奶粉，5ml 5%蔗糖。在本發(fā)明的一個具體技術(shù)方案中，將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混·合，用壓片機壓制成兩面扁平的片劑，平均片重0.4g，片劑Ig重活菌數(shù)為200億左右，成年奶牛的用量為I日2片，7日為I療程。在本發(fā)明的一個具體技術(shù)方案中，將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，裝在以明膠為主要原料制成的圓筒狀膠殼中的膠囊中，膠囊體積為0.48ml，I膠囊體積活菌數(shù)為200億左右，成年奶牛的用量為I日2粒，7日為I療程。在本發(fā)明的一個具體技術(shù)方案中，將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例均勻充分混合，烘干、過篩，制成的干燥粉末狀散劑，成年奶牛的用量為I日lg，7日為I療程。本發(fā)明的另一個目的是提供一種前述方法制備出來的防治奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑。以上概括的描述了本發(fā)明，可通過參照本文提供的某些具體實施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發(fā)明。


圖1:SQ0048和大腸桿菌混合培養(yǎng)圖，橫軸代表培養(yǎng)時間，縱軸代表活菌數(shù)，乳酸菌和病原菌混合培養(yǎng)時的培養(yǎng)比例設(shè)定為1:1和10: I ;A-SQ0048空白對照；B-與SQ0054以1:1比例混合培養(yǎng)；C-與大腸桿菌以1:1比例混合培養(yǎng)；D-與SQ0054以10: I比例混合培養(yǎng)；E-與大腸桿菌以10: I比例混合培養(yǎng)；F-大腸桿菌空白對照。圖2:SQ0048和金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)圖，橫軸代表培養(yǎng)時間，縱軸代表活菌數(shù)，乳酸菌和病原菌混合培養(yǎng)時的培養(yǎng)比例設(shè)定為1:1和10:1 ；A-SQ0048空白對照；B-與SQ0054以1:1比例混合培養(yǎng)；C-與金黃色葡萄球菌以1:1比例混合培養(yǎng)；D-與SQ0054以10:1比例混合培養(yǎng)；E-與金黃色葡萄球菌以10: I比例混合培養(yǎng)；F-金黃色葡萄球菌空白對照。圖3:SQ0054和大腸桿菌混合培養(yǎng)圖，橫軸代表培養(yǎng)時間，縱軸代表活菌數(shù)，乳酸菌和病原菌混合培養(yǎng)時的培養(yǎng)比例設(shè)定為1:1和10: I ;A-SQ0054空白對照；B-與SQ0048以1:1比例混合培養(yǎng)；C-與大腸桿菌以1:1比例混合培養(yǎng)；D-與SQ0048以10: I比例混合培養(yǎng)；E-與大腸桿菌以10: I比例混合培養(yǎng)；F-大腸桿菌空白對照。圖4:SQ0054和金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)圖，橫軸代表培養(yǎng)時間，縱軸代表活菌數(shù)，乳酸菌和病原菌混合培養(yǎng)時的培養(yǎng)比例設(shè)定為1:1和10: I ;A-SQ0054空白對照；B-與SQ0048以1:1比例混合培養(yǎng)；C-與金黃色葡萄球菌以1:1比例混合培養(yǎng)；D-與SQ0048以10:1比例混合培養(yǎng)；E-與金黃色葡萄球菌以10: I比例混合培養(yǎng)；F-金黃色葡萄球菌空白對照。圖5:SQ0048、SQ0054和大腸桿菌混合培養(yǎng)圖，橫軸代表培養(yǎng)時間，縱軸代表活菌數(shù)，乳酸菌和病原菌混合培養(yǎng)時的培養(yǎng)比例設(shè)定為1:1和10:1 ;A-SQ0048和SQ0054總體空白對照；B-SQ0048和SQ0054以1:1比例混合培養(yǎng)；C_與大腸桿菌以1:1比例混合培養(yǎng)；D-SQ0048和SQ0054以10:1比例混合培養(yǎng)；E_與大腸桿菌以10: I比例混合培養(yǎng)；F-大腸桿菌空白對照。圖6:SQ0048、SQ0054和金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)圖，橫軸代表培養(yǎng)時間，縱軸代表活菌數(shù)，乳酸菌和病原菌混合培養(yǎng)時的培養(yǎng)比例設(shè)定為1:1和10: 1;A-SQ0048和SQ0054總體空白對照；B-SQ0048和SQ0054以1:1比例混合培養(yǎng)；C_與金黃色葡萄球菌以1:1比例混合培養(yǎng)；D-SQ0048和SQ0054以10:1比例混合培養(yǎng)；E_與金黃色葡萄球菌以10: I比例混合培養(yǎng)；F-金黃色葡萄球菌空白對照。
具體實施方式
實施例1.奶牛陰道內(nèi)優(yōu)勢乳酸菌的分離鑒定首先經(jīng)過的物料采集，菌落計數(shù)，菌體分離及數(shù)據(jù)分析，初步確定了健康及病變情況下奶牛牛陰道內(nèi)菌體的分布情況。通過鑒別性培養(yǎng)基分離出55株乳酸菌，將分離的乳酸菌再次經(jīng)過篩選，選出更為優(yōu)良的8株乳酸菌進(jìn)行了生理生化及分子生物學(xué)鑒定，這些乳酸菌在牛陰道內(nèi)為優(yōu)勢種群，從中選擇最佳的兩株乳酸菌，這兩株乳酸菌的生物學(xué)鑒定結(jié)果如下。為了方便公眾獲得，該兩株乳酸菌可以通過國內(nèi)商業(yè)渠道購買，分別為雙奇公司的SQ00048和SQ00054乳酸菌。(I)乳酸菌I (雙奇公司SQ00048菌株)的生物學(xué)鑒定a、菌株的鑒定生理生化鑒定:菌落呈規(guī)則圓形，邊緣不整齊，突起，表面光滑濕潤有光澤，菌落顏色初期為淡黃色，后期為灰白色，大小約為2_左右；革蘭氏陽性桿菌，菌體較細(xì)、較短。長:2.97-5.38um寬:1.20-1.39um ;菌體無芽孢，不運動，觸媒呈陰性，產(chǎn)過氧化氫；兼性厭氧；液體發(fā)酵呈均勻混濁狀，底部菌體沉淀呈淡黃色；糖發(fā)酵結(jié)果附后。糖發(fā)酵結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于防治奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑的制備方法，具體步驟為:將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，制成片劑、膠囊及散劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其中SQ00048的菌粉的制備過程為: SQ00048的最佳發(fā)酵時間為8h，發(fā)酵溫度為40°C，厭氧培養(yǎng)；將所得發(fā)酵液15000g離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌泥，加入保護(hù)劑，攪拌均勻，傾注進(jìn)凍干機中凍干，得到白色粉末狀菌粉；其中，SQ00048的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基:1.2%乳糖，0.8%牛肉膏，0.4%檸檬酸三胺，0.4%乙酸鉀，0.04%硫酸鎂，0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.08%吐溫-80。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其中SQ00054的菌粉的制備過程為: SQ00054的最佳發(fā)酵時間為8h，發(fā)酵溫度為40°C，厭氧培養(yǎng)；將所得發(fā)酵液15000g離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌泥，加入保護(hù)劑，攪拌均勻，傾注進(jìn)凍干機中凍干，得到白色粉末狀菌粉；其中 ，SQ00054的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基^^蔗糖^^^牛肉膏，。.25%磷酸氫二鈉，0.25 %磷酸二氫鉀，0.01 %硫酸鎂，0.05 % L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.1 %吐溫-80。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其中保護(hù)劑成分及添加比例為:在300ml體系中加入20ml 50%脫脂奶粉，5ml 5%蔗糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于，將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，用壓片機壓制成兩面扁平的片劑，平均片重0.4g，片劑Ig重活菌數(shù)為200億左右，成年奶牛的用量為I日2片，7日為I療程。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于，將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，裝在以明膠為主要原料制成的圓筒狀膠殼中的膠囊中，膠囊體積為0.48ml, I膠囊體積活菌數(shù)為200億左右，成年奶牛的用量為I日2粒，7日為I療程。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于，將SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和輔料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例均勻充分混合，烘干、過篩，制成的干燥粉末狀散劑，成年奶牛的用量為I日lg，7日為I療程。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述方法制備出來的防治奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑。
全文摘要
本發(fā)明的一個目的在于提供一種可以預(yù)防和治療奶牛生殖道感染的微生態(tài)制劑。通過將健康奶牛陰道內(nèi)最具有優(yōu)勢的乳酸菌分離出來并進(jìn)行鑒定，然后選擇最佳的兩種乳酸菌，通過小鼠的安全性檢測，檢測其無毒，在將其進(jìn)行對病原菌拮抗性的檢測，結(jié)果顯示拮抗效果明顯。采用這兩株菌種為原料，將其發(fā)酵制備成菌粉后混合，再回歸到患有疾病的動物體內(nèi)，既利于菌株的定植，又有抑制病原菌的作用，并且克服了化學(xué)藥物對機體的損害，解決了藥物在機體內(nèi)的殘留問題，而且利于奶牛產(chǎn)母畜。
文檔編號A61P31/00GK103070890SQ201110231919
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者黃少磊, 劉彥民, 龔虹, 付艷茹, 劉斌, 馮謙, 夏少明, 張春霞, 邰海歐 申請人:內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司