專利名稱：兩株游動放線菌及其在抗細(xì)菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及兩株游動放線菌及其在抗細(xì)菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
最近的一項調(diào)查表明在47家美國醫(yī)院院內(nèi)細(xì)菌感染中，65%的是由革蘭氏陽性細(xì)菌所引起的，其中最主要的是金黃色葡萄球菌和腸球菌。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，葡萄球菌屬尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢出率和耐藥率有逐年増加的趨勢。上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)的糖肽類抗生素萬古霉素由于其獨特的作用而被用作治療多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的首選藥物，并曾一度被譽為“人類對付頑固性多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的最后一道防線”。但自1986年萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)菌株在英國倫敦Dulwich醫(yī) 院被首次發(fā)現(xiàn)并隨著該耐藥菌株又相繼在其它許多國家被發(fā)現(xiàn)后，這最后一道防線也面臨著崩潰的危險。因此，尋找新的作用靶點，研發(fā)新型抗細(xì)菌，包括耐藥菌的藥物已成為本世紀(jì)全球關(guān)注的研究熱點之一。微生物作為“綠色合成”中的重要資源，其代謝產(chǎn)物是創(chuàng)新藥物主要資源之一，據(jù)不完全統(tǒng)計，已分離和鑒定的微生物產(chǎn)物約50000個，其中具有各種生物活性的高達(dá)22000個，直接作為臨床藥物和農(nóng)牧業(yè)用藥實體多達(dá)200多個，微生物藥物是臨床用藥中比例最大的藥物，也是近年來發(fā)展最為迅速的醫(yī)藥產(chǎn)品，在醫(yī)藥產(chǎn)品所占比例逐年上升。至2002年，已發(fā)現(xiàn)的由細(xì)菌、放線菌和真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中，平均不到100個新化合物中就有一個可以成藥或成先導(dǎo)化合物。微生物來源的天然產(chǎn)物還具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多祥性的特點，其結(jié)構(gòu)有別于來源于動物、植物和海洋的天然產(chǎn)物，是自然界中天然產(chǎn)物庫的重要組成部分。微生物藥物是近年來發(fā)展最為迅速的醫(yī)藥產(chǎn)品，在醫(yī)藥產(chǎn)品所占比例逐年上升。2005年我國生物藥品銷售總額達(dá)到了 157. 4億元，利潤總額為38. 7億元，預(yù)計2015年總產(chǎn)值可達(dá)1100億到1300億元，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，由微生物發(fā)酵而來到生物藥品的經(jīng)濟效益越來越大。在我國作為微生物藥物代表的抗生素仍將占據(jù)藥品市場的主要地位，2005年我國抗生素產(chǎn)業(yè)達(dá)到300億美元，抗生素產(chǎn)業(yè)規(guī)模已經(jīng)成為世界第一，銷售額達(dá)到640億元，占全國藥品銷售總額的30%之多，并連續(xù)多年以超過17%的平均增長率增長，預(yù)計在今后較長時期內(nèi)，該類藥物的市場需求仍將保持強勁的增長勢頭。但由于醫(yī)藥エ業(yè)生產(chǎn)的藥品約97%是仿制外國的品種，雖然我國可稱為醫(yī)藥生產(chǎn)的大國，但在醫(yī)藥科技上還是ー個弱國，使得醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)總體經(jīng)濟效益偏低。因此，研究開發(fā)創(chuàng)新微生物藥物具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供兩株游動放線菌Actinoplanessp. PDF-I 和 PDF-2 菌株。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了兩株游動放線菌。其中，所述的游動放線菌Actinoplanes sp. F1DF-I,已經(jīng)于2011年3月17日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，郵政編碼為100101，保藏號為CGMCC No. 4692。其具有以下微生物學(xué)特性。好氧菌，革蘭氏陽性，無可溶性色素。孢囊呈亞球形至球形，直徑6 μ m孢囊孢子偏圓形?；z豐富，無氣絲。在ISP2等大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，基絲呈黃色至橙黃色。細(xì)胞壁含有meso-DAP，全細(xì)胞水解液含阿拉伯糖和木糖，DNA的G+Cmol%含量為71. 0%。硝酸鹽還原陰性，淀粉水解明性，明膠液化陽性，七葉苷分解陽性，尿素分解陽性，利用甘露糖、西蒙氏枸櫞酸鹽，不利用纖維ニ糖、丙ニ酸鹽、蜜ニ糖、酒石酸鹽、糊精、棉子糖、肌醇、苯丙氨酸、水楊素、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、醋酸鹽作為碳源生長。不能降解酪氨酸、彈性蛋白、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。其中，所述的游動放線菌Actinoplanes sp. PDF-2已經(jīng)于2011年3月17日保藏·在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，郵政編碼為100101，保藏號為CGMCC No. 4693。其具有以下微生物學(xué)特性。好氧菌，革蘭氏陽性，無可溶性色素。孢囊球形，直徑5 μ m,著生在孢囊梗上，孢囊孢子圓形，表面光滑，鞭毛周生。基絲豐富，無氣絲。在ISP2等大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，基絲呈黃色至橙紅色。細(xì)胞壁含有meso-DAP，全細(xì)胞水解液含阿拉伯糖和木糖，DNA的G+Cmol %含量為70. 4%。淀粉水解陽性，明膠液化陽性，硝酸鹽還原陽性，七葉苷分解陽性，尿素分解陽性，利用丙ニ酸鹽做碳源生長，不利用酒石酸鹽，甘露糖，糊精，苯丙氨酸，棉子糖，水楊素，麥芽糖，乳糖，鼠李糖，肌醇，葡萄糖，醋酸鹽作為碳源生長。不能降解弾性蛋白、酪氨酸、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。酪素降解陽性。本發(fā)明的另一目的提供了所述菌株在抗細(xì)菌中的應(yīng)用，尤其是在抗革蘭氏陽性細(xì)菌中的應(yīng)用。所述的革蘭氏陽性細(xì)菌優(yōu)選耐藥的革蘭氏陽性細(xì)菌。其中耐藥的革蘭氏陽性細(xì)菌優(yōu)選為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌。PDF-I和PDF-2菌株具體的分離稱取土壤樣品Ig(取自北京門頭溝山區(qū)的草叢中)，懸浮于9ml生理鹽水中混勻，用生理鹽水稀釋至10_2和10_3，分別取200微升涂在分離培養(yǎng)基上(M4(g/L):腐殖酸1，植物蛋白O. 5，MOPS IOMm,甜菜堿I. 25，丙酮酸鈉I. 25，氯化鈉10，瓊脂12，pH 7. 2)。在28°C，培養(yǎng)10-20天，挑取單菌落至YM(ISP2，酵母膏4. 0g，麥芽汁10. 0g，葡萄糖4. 0g, I. 5% agar,H2O 1000ml, pH 7.0)斜面上。得到這兩株菌的純培養(yǎng)物。對這兩株游動放線菌Actinoplanes sp. PDF-I和PDF-2菌株研究結(jié)果表明它們的發(fā)酵液粗提物可抑制多種細(xì)菌包括多種耐藥細(xì)菌的生長。因此，本發(fā)明提供的游動放線菌Actinoplanes sp. PDF-I和H)F-2，在采用一定的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，它們的發(fā)酵液粗提物具有抗細(xì)菌尤其是抗耐藥細(xì)菌的作用。本發(fā)明提供的菌種為可再生性微生物資源，可通過短期發(fā)酵，得到具有抗耐藥菌活性的產(chǎn)物，該菌種可大規(guī)模用于エ業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，對環(huán)境污染相對化學(xué)合成較小。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I :菌株發(fā)酵產(chǎn)物的制備菌株的發(fā)酵產(chǎn)物制備過程如下分別將Actinoplanes sp. PDF-1和TOF-2純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基(酵母浸膏0.4%，麥芽浸膏1.0%，葡萄糖pH7. 3)上，28°C，培養(yǎng)10天。從斜面上挑取O. 5厘米見方的小塊培養(yǎng)物種入盛有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖0.5%，麥芽膏I %，棉子餅粉I %，可溶性淀粉2 %，酵母浸膏0.5%，K2HPO4O. 05 %，(NH4)2SO4O. 5%, NaClO. 1%, CaCO3O. 3%, ρΗ7· 2。)的 250ml 三角瓶中，28°C、190 轉(zhuǎn) / 分旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)4天。取50ml發(fā)酵液用50ml的丙酮抽提，揮干后，用5ml的DMSO溶解。實施例2 :抑菌活性的驗證瓊脂稀釋法測定發(fā)酵液丙酮粗提物的抗菌活性，所測菌株包括金黃色葡萄球菌的敏感菌株、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的敏感菌株、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌、糞腸球菌的敏感菌株、耐萬古霉素的糞腸球菌、屎腸球菌的敏感菌株、耐萬古霉素 的屎腸球菌、腸埃希氏菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌等20株菌。I、制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基使用Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基，按商品說明書進(jìn)行配制，pH7. 2 7. 4。2、檢定菌株的培養(yǎng)20株檢定菌株于37 °C過夜培養(yǎng)。3、含藥平板制備將Iml發(fā)酵液粗提物樣品分別加入14毫升溫度為45 50°C的MH瓊脂培養(yǎng)基中充分混勻后，全部傾倒入滅菌的平皿中。4、接種物制備與接種制備濃度相當(dāng)于O. 5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再I : 10稀釋，以多點接種器吸取制備好的菌液(約I 2 μ I)接種于各瓊脂平板表面，每點菌數(shù)約為IO4CFU,形成直徑為5 8_的菌斑。接種后置37°C孵育16 20h。5、結(jié)果判斷與生長對照比較，“ + ”表示有可見抗菌活性，表示無抗菌活性。表ニ菌株發(fā)酵液丙酮粗提物的抗菌譜測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.游動放線菌(Actinoplanessp. )H)F-1，其保藏號為 CGMCCNo. 4692。
2.游動放線菌(Actinoplanessp.) H)F-2，其保藏號為 CGMCCNo. 4693。
3.權(quán)利要求I或2所述菌株在抗細(xì)菌中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，所述的細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述的細(xì)菌為耐藥的革蘭氏陽性細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的耐藥的革蘭氏陽性細(xì)菌為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩株游動放線菌及其應(yīng)用，該游動放線菌Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2的保藏號分別為CGMCC No.4692和CGMCC No.4693。它們具有抗細(xì)菌尤其是抗耐藥細(xì)菌的作用。本發(fā)明提供的菌種為可再生性微生物資源，可通過短期發(fā)酵，得到具有抗耐藥菌活性的產(chǎn)物，該菌種可大規(guī)模用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，對環(huán)境污染相對化學(xué)合成較小。
文檔編號A61P31/04GK102851221SQ201110175099
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者余利巖, 張月琴, 董國霞, 李子強, 孫薇, 張玉琴, 李秋萍, 魏玉珍 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所