專利名稱：一種載有抗腫瘤藥物微粒的制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物制劑，特別是涉及一種載有抗腫瘤藥物微粒的制劑，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的靶向治療一直是國內(nèi)外醫(yī)藥工作者共同關(guān)注的熱點。間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)是具有多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，除了具有造血支持、免疫調(diào)節(jié)和多向分化的特性外，還具有特異性地遷移到損傷部位和腫瘤組織的特性。 近年來的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒后卻不改變間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此以間充質(zhì)干細(xì)胞為細(xì)胞載體的靶向腫瘤的基因治療，可以特異性地遷移到腫瘤的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶，傳遞和表達(dá)多種抗腫瘤因子，提高治療效果。同時， 抗腫瘤因子可以在腫瘤局部表達(dá)上調(diào)而避免全身的藥物分布，減少全身用藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離和體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)后仍可用于移植，因此，無免疫排斥和無倫理道德問題。間充質(zhì)干細(xì)胞可以體外擴增50代以上，并且保持其原有的表型和分化潛能。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為新的抗腫瘤治療的新策略。然而，對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究僅局限在作為靶向腫瘤基因治療的載體。由于抗腫瘤化學(xué)藥物的細(xì)胞毒性作用，使得將具有良好靶向作用的間充質(zhì)干細(xì)胞作為抗腫瘤化學(xué)藥物細(xì)胞載體成為十分棘手的難題。MDRl基因編碼的P-糖蛋白又稱P-gp (p-glycoprotein)，P-170，是一種分子量為 170 KD的糖蛋白。P-gp是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員之一，具有ATP依賴的外排泵功能， 一旦與藥物結(jié)合，就可通過ATP分解提供能量，將藥物泵出細(xì)胞外，藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度不斷下降，對腫瘤細(xì)胞而言將導(dǎo)致耐藥。對正常細(xì)胞而言則可以避免藥物對細(xì)胞的損害。P-gp對藥物的特異性很小，因此多藥耐藥細(xì)胞能對許多結(jié)構(gòu)和作用機制不同的藥物產(chǎn)生耐藥。P-gp產(chǎn)生多藥耐藥相關(guān)的化療藥物主要有(1)烷化劑類，如環(huán)磷酰胺；(2) 抗腫瘤抗生素類，如柔紅霉素；C3)植物堿類抗腫瘤藥，如長春新堿、紫杉醇等；(4)蒽環(huán)類化療藥，如阿霉素；( 激素類，如孕激素、三苯氧胺等。中國學(xué)者已率先采用MDRl基因轉(zhuǎn)染的方法，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得了耐藥性 (葉明珠，韓麗英，岳鑫，李荷蓮，中國實驗診斷學(xué)，2007，11(1)，10-12;葉明珠，韓麗英，李荷蓮，張海英，中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，23 (3)，181-183 ；陳慧玲，白海，中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17 (3)，690-694)。但這一技術(shù)的目的是對惡性腫瘤患者進行化療保護，即增強了間充質(zhì)干細(xì)胞耐受多種化療藥物的能力，在降低腫瘤化療副反應(yīng)的同時增強大劑量化療對腫瘤細(xì)胞的殺傷性，提高腫瘤化療的臨床治療效果。目前仍然沒有有效技術(shù)解決抗腫瘤藥物蓄積導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞壞死并實現(xiàn)抗腫瘤藥物微粒運輸至惡性腫瘤并在局部緩釋藥物的問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷、提供一種載有抗腫瘤藥物微粒的制劑，該制劑能夠靶向至惡性腫瘤局部并且緩釋藥物，從而提高療效、降低毒副作用。本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種載有抗腫瘤藥物微粒的制劑及其制備方法，所述制劑以多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞作為抗腫瘤藥物微粒的載體。上述制劑，所述多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞為表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞；所述表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞是通過以病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒)為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞而獲得。上述制劑，所述抗腫瘤藥物微粒粒徑為10ηπΓ500 μ m，并由以下重量百分比的組分構(gòu)成
抗腫瘤藥物0. 0Γ30% ；
輔料余量；
其中，所述抗腫瘤藥藥物選自鹽酸阿霉素、鹽酸平陽霉素、鹽酸表柔比星、鹽酸吡柔比星、鹽酸柔紅霉素、高三尖杉酯堿、長春新堿、羥基喜樹堿、硫酸長春地辛、硫酸長春堿、重酒石酸長春瑞賓、紫杉醇、長春質(zhì)堿、長春瑞賓堿、多烯紫杉醇、秋水仙堿、9-氨基喜樹堿、 7-乙基喜樹堿、米托蒽醌或環(huán)磷酰胺中一種或多種；
所述輔料選自聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸聚合物(PLGA)中的一種或兩種。上述制劑，所述抗腫瘤藥物微粒粒徑為20ηπΓ200μπι;所述抗腫瘤藥物用量優(yōu)選為 ο. Γ10%。上述制劑，所述輔料為聚乳酸與乳酸-羥基乙酸聚合物的混合物，其重量比為 0. 1/100^100/0. 1，優(yōu)選重量比為 40/60^60/40O上述制劑，所述乳酸-羥基乙酸聚合物中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為99/廣1/99， 優(yōu)選摩爾比為85/15、75/25或50/50。一種制備上述載有抗腫瘤藥物微粒的制劑的方法，它按如下步驟進行
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將抗腫瘤藥物和 PLA或PLGA溶于DMS0、二氯甲烷、氯仿、丙酮、醇類或醚類、以及上述溶劑組成的混合溶劑中，形成有機相。將上述有機相在含有表面活性劑的PH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮發(fā)，制備抗腫瘤藥物微粒。b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒) 為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV, PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C,5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染 MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞(MDR-MSCs)細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含0.廣20. Omg抗腫瘤藥物的比例，在37°C、5%C02全濕條件下共同孵育廣8小時，離心，收集包覆抗腫瘤藥物微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得發(fā)明產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的間充質(zhì)干細(xì)胞由骨髓血、外周血、脂肪、羊膜、羊水、胎盤、臍血或臍帶等體液或組織中分離而得。分離可采用密度梯度離心法、貼壁篩選法或流式細(xì)胞儀分選法，使用這些分離方法可以實現(xiàn)很好的分離。本發(fā)明所述的多藥耐藥基因MDR1，位于人類第7號染色的長臂上(7q21)，基因組序列長度為209 1Λ，其編碼的P-gp蛋白包含了 1280個氨基酸片斷(Bodor M, Kelly EJ, Ho RJ, Characterization of the human MDRl gene, AAPS J, 2005, 7(1):El-5 )。本發(fā)明所述的間充質(zhì)干細(xì)胞具有特異性地遷移到損傷部位和腫瘤組織的特性，而表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞又能夠避免抗腫瘤藥物的毒性，能夠很好的實現(xiàn)承載抗腫瘤藥物并靶向指至腫瘤部位而本身不失去生物活性?？鼓[瘤藥物微粒具有緩釋作用，可長時間釋放藥物。本發(fā)明采用表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)與微粒技術(shù)相結(jié)合，很好地解決了抗腫瘤藥物蓄積導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞壞死的問題，能夠?qū)⒖鼓[瘤藥物微粒運輸至惡性腫瘤并在局部緩釋藥物，實現(xiàn)腫瘤的靶向治療，從而提高療效，降低毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞承載阿霉素微粒組 (DOX-NPs-MDR-MSCs)對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用曲線圖。圖2是表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞承載紫杉醇微粒組 (PTX-NPs-MDR-MSCs)對荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。一、制備載有抗腫瘤藥物微粒的制劑及方法實施例1 承載鹽酸阿霉素微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將鹽酸阿霉素和 PLA溶于DMSO中，形成有機相。將上述有機相在含有PVA205的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑120nm、含藥量為 2. 5%的鹽酸阿霉素PLA微粒。b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用。制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV, PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C,5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染 MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒，以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1. 5mg鹽酸阿霉素的比例，在 37°C、5%C02全濕條件下共同孵育3小時，離心，收集包覆鹽酸阿霉素微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例2 承載紫杉醇微粒的制劑a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將紫杉醇和PLA 溶于二氯甲烷中，形成有機相。將上述有機相在含有吐溫80的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑95nm、含藥量為 4. 1%的紫杉醇PLA微粒
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以慢病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞， 制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C,5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒，以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1. Img紫杉醇的比例，在 37°C、5%C02全濕條件下共同孵育3小時，離心，收集包覆紫杉醇微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例3 承載多烯紫杉醇微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將多烯紫杉醇和 PLGA溶于丙酮中，形成有機相。將上述有機相在含有泊洛沙姆188的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑80nm、含藥量為0. 01%的多烯紫杉醇PLGA微粒，其中PLGA中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為1/99 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；
制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB 共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C、5%0)2全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1. Img多烯紫杉醇的比例，在 37°C、5%C02全濕條件下共同孵育1小時，離心，收集包覆多烯紫杉醇微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例4 承載羥基喜樹堿微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將羥基喜樹堿和 PLGA溶于丙酮一乙醇組成的混合溶劑中，形成有機相。將上述有機相在含有泊洛沙姆188 的PH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑500 μ m、含藥量為3%的羥基喜樹堿PLGA微粒，其中PLGA中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為99/1 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以慢病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞， 制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C、5%0)2全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1. 5mg羥基喜樹堿的比例，在37°C、5%ω2全濕條件下共同孵育4小時，離心，收集包覆羥基喜樹堿微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例5 承載鹽酸吡柔比星微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將鹽酸吡柔比星和PLGA溶于丙酮一乙醇組成的混合溶劑中，形成有機相。將上述有機相在含有吐溫80的 PH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑200 μ m、含藥量為1%的鹽酸吡柔比星PLGA微粒，其中PLGA中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為85/15 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C、5%0)2全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1. Img的鹽酸吡柔比星的比例， 在37°C、5%0)2全濕條件下共同孵育1小時，離心，收集包覆鹽酸吡柔比星微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例6 承載環(huán)磷酰胺微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將環(huán)磷酰胺和 PLGA溶于丙酮一乙醇組成的混合溶劑中，形成有機相。將上述有機相在含有泊洛沙姆188 的PH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑lOOnm、含藥量為的環(huán)磷酰胺PLA-PLGA微粒，其中PLA與PLGA的重量比為 0. 1/100，PLGA中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為75/25 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以慢病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞， 制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C、5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含0. ^ig環(huán)磷酰胺的比例，在37°C、 5%C02全濕條件下共同孵育2小時，離心，收集包覆環(huán)磷酰胺微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞， 即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例7 承載長春瑞賓堿微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將長春瑞賓堿和PLA及PLGA溶于二氯甲烷中，形成有機相。將上述有機相在含有吐溫80的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑400 μ m、 含藥量為25%的長春瑞賓堿PLA-PLGA微粒，其中PLA與PLGA的重量比為100/0. 1，PLGA 中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為50/50 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；
制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB 共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C、5%0)2全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含l.Omg長春瑞賓堿的比例，在 37°C、5%C02全濕條件下共同孵育7小時，離心，收集包覆長春瑞賓堿微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例8 承載米托蒽醌微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將米托蒽醌和PLA 及PLGA溶于二氯甲烷中，形成有機相。將上述有機相在含有PVA205的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑50nm、含藥量為8%的米托蒽醌PLA-PLGA微粒，其中PLA與PLGA的重量比為40/60，PLGA中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為50/50;
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以慢病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞， 制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C,5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1. Img米托蒽醌的比例，在37°C、 5%C02全濕條件下共同孵育1小時，離心，收集包覆米托蒽醌微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞， 即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例9 承載秋水仙堿微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將秋水仙堿和 PLA及PLGA溶于二氯甲烷中，形成有機相。將上述有機相在含有泊洛沙姆188的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑 300nm、含藥量為5%的秋水仙堿PLA-PLGA微粒，其中PLA與PLGA的重量比為60/40，PLGA 中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為75/25 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C、5%0)2全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含1.2mg秋水仙堿的比例，在37°C、 5%C02全濕條件下共同孵育1小時，離心，收集包覆秋水仙堿微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞， 即得本發(fā)明產(chǎn)品。實施例10承載長春新堿微粒的制劑
a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備。制備過程為將長春新堿和 PLGA溶于丙酮中，形成有機相。將上述有機相在含有吐溫80的pH 7.4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備平均粒徑300 μ m、含藥量為 10%的長春新堿PLGA微粒，其中PLGA中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為75/25 ；
b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以慢病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCIPGB共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞， 制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的MSCs接種于培養(yǎng)板，37°C,5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染MSCs，在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的MDR-MSCs細(xì)胞。c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含0. 3mg長春新堿的比例，在37°C、 5%C02全濕條件下共同孵育4小時，離心，收集包覆長春新堿微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞， 即得本發(fā)明產(chǎn)品。二、本發(fā)明制劑對肺癌皮下移植瘤治療效果試驗實施例A
以實施例1所得制劑進行如下實驗
以C57小鼠為實驗動物，建立Lewis肺癌皮下移植瘤模型，并將動物分為空白對照組、阿霉素溶液組、阿霉素微粒組、多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞承載阿霉素微粒組 (DOX-NPs-MDR-MSCs)，空白對照組血管注射等量生理鹽水，其余各組血管注射的阿霉素含量相等。采用小鼠尾靜脈、按5mg/kg阿霉素給藥。在不同時間點，測量腫瘤體積，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，比較上述各組的體內(nèi)藥效。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11. 0軟件處理，采用單因素方差分析比較組間差異，檢驗水平為0.05。結(jié)果顯示DOX-NPs-MDR-MSCs組與其他各組見有顯著性差異(P<0. 05)，說明表達(dá) P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞承載阿霉素微粒制劑對Lewis肺癌皮下移植瘤有較好治療效果。見附圖1。實施例B
以實施例2所得制劑進行如下實驗
以C57小鼠為實驗動物，建立Lewis肺癌皮下移植瘤模型，并將動物分為空白對照組、紫杉醇(PTX)溶液組、紫杉醇微粒組、多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞承載紫杉醇微粒組 (PTX-NPs-MDR-MSCs),空白對照組血管注射等量生理鹽水，其余各組血管注射的紫杉醇含量相等。采用小鼠尾靜脈、按5mg/kg阿霉素給藥。在不同時間點，測量腫瘤體積，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，比較上述各組的體內(nèi)藥效。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11. 0軟件處理，采用單因素方差分析比較組間差異，檢驗水平為0. 05。結(jié)果顯示DOX-NPs-MDR-MSCs組與其他各組見有顯著性差異(P<0. 05)，說明表達(dá) P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞承載紫杉醇微粒制劑對Lewis肺癌皮下移植瘤有較好治療效果。見附圖2。顯然，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案可以組合出很多實施例，而本發(fā)明的實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對發(fā)明實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種載有抗腫瘤藥物微粒的制劑，其特征在于，所述制劑以多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞作為抗腫瘤藥物微粒的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞為表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制劑，其特征在于，所述抗腫瘤藥物微粒粒徑為 10ηπΓ500 μ m，它由以下重量百分比的組分構(gòu)成抗腫瘤藥物0. 0Γ30% ；輔料余量；其中，所述抗腫瘤藥藥物選自鹽酸阿霉素、鹽酸平陽霉素、鹽酸表柔比星、鹽酸吡柔比星、鹽酸柔紅霉素、高三尖杉酯堿、長春新堿、羥基喜樹堿、硫酸長春地辛、硫酸長春堿、重酒石酸長春瑞賓、紫杉醇、長春質(zhì)堿、長春瑞賓堿、多烯紫杉醇、秋水仙堿、9-氨基喜樹堿、 7-乙基喜樹堿、米托蒽醌或環(huán)磷酰胺中一種或多種；所述輔料選自聚乳酸或乳酸-羥基乙酸聚合物中的一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制劑，其特征在于，所述抗腫瘤藥物微粒粒徑為 20ηπΓ200 μ m ；所述抗腫瘤藥物用量為0.廣10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其特征在于，所述輔料為聚乳酸與乳酸-羥基乙酸聚合物的混合物，其重量比為0. 1/100^100/0. 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制劑，其特征在于，所述聚乳酸與乳酸-羥基乙酸聚合物重量比為 40/60 60/40。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制劑，其特征在于，所述乳酸-羥基乙酸聚合物中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為99/廣1/99。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制劑，其特征在于，所述乳酸-羥基乙酸聚合物中丙內(nèi)酯與乙內(nèi)酯的摩爾比為85/15,75/25或50/50。
9.一種制備如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述制劑的方法，其特征在于，它按如下步驟進行a.制備抗腫瘤藥物微粒采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備，制備過程為將抗腫瘤藥物和 PLA或PLGA溶于DMS0、二氯甲烷、氯仿、丙酮、醇類或醚類、以及上述溶劑組成的混合溶劑中，形成有機相；將上述有機相在含有表面活性劑的PH 7. 4磷酸鹽緩沖液中采用超聲進行乳化，有機溶劑采用減壓干燥的方式快速揮走，制備抗腫瘤藥物微粒；b.制備表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞以病毒為載體，將多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，備用；所述病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒；制備過程如下采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMX-mdrl-GFP與外膜蛋白質(zhì)粒PCI VSV、PCI PGB 共同導(dǎo)入包裝細(xì)胞，制備病毒上清液并測定病毒滴度；將待轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，37°C、5%C02全濕條件下培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，加入逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染間充質(zhì)干細(xì)胞在無菌條件下用流式細(xì)胞儀分選，得到的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞；c.制備制劑將b中所得表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞與a中所得抗腫瘤藥物微粒以每IO6個多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞比相當(dāng)于含0.廣20. Omg抗腫瘤藥物的比例，在 37°C、5%C02全濕條件下共同孵育廣8小時，離心，收集包覆抗腫瘤藥物微粒的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞，即得發(fā)明產(chǎn)物。
全文摘要
一種載有抗腫瘤藥物微粒的制劑及其制備方法，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。所述制劑以多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞作為抗腫瘤藥物微粒的載體，所述多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞為表達(dá)P-糖蛋白的多藥耐藥間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明很好的解決了抗腫瘤藥物蓄積導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞壞死的問題，能夠?qū)⒖鼓[瘤藥物微粒運輸至惡性腫瘤并在局部緩釋藥物，實現(xiàn)腫瘤的靶向治療，從而提高療效，降低毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K9/14GK102225054SQ20111016503
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者劉磊, 吳韶梅, 姚軍, 孫勇軍, 張麗男, 張莉, 李碩, 楊恩蕓, 申寧, 胡潔, 謝英花, 高子彬 申請人:河北科技大學(xué)