專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫原性組合物和疫苗，其包含Hib糖綴合物和至少一種額外的細(xì)菌糖綴合物，其與包括全細(xì)胞百日咳和/或乙型肝炎表面抗原的其他抗原組合，涉及制備此類免疫原性組合物和疫苗的方法，和使用所述免疫原性組合物和疫苗免疫的用途和方法。
背景技術(shù)：
已經(jīng)表明細(xì)菌多糖是用于疫苗的有效免疫原，尤其當(dāng)綴合到載體蛋白時(shí)?？梢缘玫娇筨型流感嗜血桿菌(Hibtiter Wyeth-Lederle)、肺炎球菌多糖(Prevnar -ffyeth-Lederle)和腦膜炎球菌多糖(Meningitec -Wyeth-Lederleand Menactra -Sanofi)的商業(yè)綴合疫苗。還描述了包含Hib綴合物、腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物、全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的免疫原性組合物和疫苗。例如，WO 02/00249公開了 7價(jià)免疫原性組合物，其包含白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、全細(xì)胞百日咳、乙型肝炎表面抗原、Hib綴合物、MenA綴合物和MenC綴合物。呈送的臨床試驗(yàn)結(jié)果使用5 μ g糖劑量的每種細(xì)菌糖綴合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及提供組合疫苗，其包含Hib綴合物、額外的細(xì)菌糖綴合物(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物)和其他抗原，包括全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原中的一種或兩種。使用的糖劑量允許產(chǎn)生抗Hib和額外的細(xì)菌糖以及抗百日咳組分和/或乙型肝炎表面抗原組分的良好的免疫應(yīng)答。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)在包含全細(xì)胞百日咳和/或乙型肝炎表面抗原的組合疫苗中，通過降低Hib和/或額外的細(xì)菌綴合物的糖劑量到低于每劑5 μ g，保持對糖綴合物的良好的免疫應(yīng)答并且全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的免疫原性得到增強(qiáng)(例如，使得如通過ELISA測量的Pw和/或乙型肝炎的GMC高于用含有5 μ g糖劑量的每種綴合物的免疫原性組合物免疫后實(shí)現(xiàn)的水平)。因此，本發(fā)明的第一方面提供了免疫原性組合物，其包含Hib糖綴合物、至少一種額外的細(xì)菌糖綴合物，和選自全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原，其中Hib糖綴合物的糖劑量小于每劑5 μ g。本發(fā)明的免疫原性組合物包含Hib糖綴合物，和/或至少或剛好1、2、3或4種細(xì)菌糖綴合物，例如，腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物，和選自全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原，其中Hib糖綴合物的糖劑量小于5 μ g或小于4 μ g，或者在1-4 μ g或1_3 μ g， 或2-4 μ g或2-3 μ g之間，或者約或者剛好2. 5 μ g，任選地，至少或剛好1、2、3或4種額外的細(xì)菌糖綴合物(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物)的全部或其每一種的糖劑量小于 10 μ g>9 μ g>8 μ g>7 μ g>6 μ g>5 μ g or 4 μ g, 1一10 μ g>l~8 μ g>l~6 μ g>l"5 μ g、l_4y g、1-3 μ g、或2-4 μ g或2-3 μ g之間或約或剛好2. 5 μ g。術(shù)語“糖”包括多糖或者寡糖。將多糖從細(xì)菌分離或從細(xì)菌分離并通過已知的方法(見例如EP4975M和EP497525)并任選通過微流化按大小分級(jí)到某種程度。可以按大小分級(jí)多糖以便減小多糖樣品中的粘性和/或提高綴合產(chǎn)物的濾過率。寡糖具有低數(shù)目的重復(fù)單位(通常5-30個(gè)重復(fù)單位)并且通常是經(jīng)水解的多糖。以施用于人的免疫原性組合物或者疫苗的量測量“糖劑量”。Hib糖是聚核糖基磷酸酯(PRP)莢膜多糖或者b型流感嗜血桿菌的寡糖?！爸辽僖环N額外的細(xì)菌多糖綴合物”是指連接到載體蛋白的任一種細(xì)菌糖類的綴合物。細(xì)菌糖類任選地是來自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株、肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)菌株、 傷寒沙門氏菌(S. typhi)菌株的莢膜多糖或者本文所述的任一種細(xì)菌糖類?！爸辽僖环N腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物”是指腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌W135莢膜糖 (Menff)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B莢膜糖 (MenB)、血清群C和Y莢膜糖(MenCY)、血清群C和A莢膜糖(MenAC)、血清群C和Wl35莢膜糖(MenCW)、血清群A和Y莢膜糖(MenAY)、血清群A和W135莢膜糖(MenAW)、血清群 W135和Y莢膜糖(MenWY)、血清群A、C和W135莢膜糖(MenACW)、血清群A、C和Y莢膜糖 (MenACY)、血清群A、W135和Y莢膜糖(MenAWY)、血清群C、W135和Y莢膜糖(MenCWY)或者血清群A、C、W135和Y莢膜糖(MenACWY)、血清群B和C莢膜糖(MenBC)、血清群B、C和Y莢膜糖(MenBCY)、血清群B、C和A莢膜糖(MenABC)、血清群B、C和W莢膜糖(MenBCW)、血清群 A、B和Y莢膜糖(MenABY)、血清群A、B和W莢膜糖(Men ABff)、血清群B、W135和Y莢膜糖 (MenBWY)、血清群 A、B、C 和 Wi;35 莢膜糖(MenABCW)、血清群 A、B、C 和 Y 莢膜糖(MenABCY)； 血清群A、B、Wi;35和Y莢膜糖(MenABWY)、血清群B、C、Wi;35和Y莢膜糖(MenBCWY)；或血清群 A、B、C、W135 和 Y 莢膜糖(MenABCffY)。例如，上面所列的加入或者不加入Hib糖綴合物的腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物的任一組合可以以小于5 μ g或小于4 μ g、或1-4 μ g或1-3 μ g、或2-4 μ g或2_3 μ g或約或剛好2. 5yg的糖劑量存在。為了本發(fā)明的目的，“約”或“大約”被定義為給定數(shù)字的10%上下。在一個(gè)實(shí)施方案中，Hib的糖劑量可以與腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物的糖劑量相同、更大或更少。Hib糖綴合物的糖劑量可以為例如至少一種額外細(xì)菌(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌)糖綴合物的平均或最低糖劑量的100 %或小于90 %、80 %、75 %、70 %、60 %、50 %、 40%、30%、20%或10%。Hib糖的糖劑量為例如至少一種額外細(xì)菌(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌)糖綴合物的平均或最低糖劑量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 %或約或剛好 50%。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種額外細(xì)菌(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌) 糖或者其每一種的劑量相同或者大約相同。本發(fā)明的免疫原性組合物的實(shí)例是由下面組成的或包含下面的組合物Hib綴合物和MenA綴合物和MenC綴合物，任選地，糖劑量比為2 2、1 2 1、 1 4 2、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、1 6 6 (w/w)。任選地，MenA 的糖劑量大于MenC的糖劑量。
Hib綴合物和MenC綴合物和MenY綴合物，任選地，糖劑量比為1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w) 0任選地，MenC的糖劑量大于MenY的糖劑量。Hib綴合物和MenC綴合物和MenW綴合物，任選地，糖劑量比為1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w)。任選地，MenC的糖劑量大于MenW的糖劑量。Hib綴合物和MenA綴合物和MenW綴合物，任選地，糖劑量比為1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w) 0任選地，MenA的糖劑量大于MenW的糖劑量。Hib綴合物和MenA綴合物和MenY綴合物，任選地，糖劑量比為1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w) 0任選地，MenA的糖劑量大于MenY的糖劑量。Hib綴合物和MenW綴合物和MenY綴合物，任選地，糖劑量比為1 2 2、 1 2 1、1 1 2、1 4 2、1 2 4、1 4 1、1 1 4、1 3 6、1 1 3、 1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、1 6 6 (w/w)。任選地，MenY 的糖劑量大于MenW的糖劑量?！捌渌乖卑ㄈ?xì)胞百日咳(Pw)和乙型肝炎表面抗原OfepB)中的一種或兩種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其他抗原還包括白喉類毒素(DT)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、無細(xì)胞百日咳(Pa)和/或脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其他抗原包含DT、TT、 百日咳抗原0 或Pw)和H印B或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其他抗原包含或DT、 TT、百日咳抗原(Pa或Pw)、H印B和IPV其由組成。包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的Hib和/或腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合到載體蛋白如破傷風(fēng)類毒素、破傷風(fēng)類毒素片段C、破傷風(fēng)毒素的無毒突變體、白喉類毒素、 CRM197、白喉毒素的其他無毒突變體[如 CRM176，CRM197，CRM228，CRM45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218 ；3838-3844，1973) ；CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 和 CRM107，和 Nicholls 禾口 Youle 在遺傳工禾呈化的毒素(Genetically Engineered Toxins), Ed :Frankel, Maecel Dekker Inc，1992 中描述的其他突變；US 4709017 或US 4950740 中公開的 Glu-148 向 Asp、 Gln或Ser和/或Ala 158向Gly的缺失或突變和其他突變；US 5917017或US 6455673 中公開的至少一個(gè)或多個(gè)殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突變或者其他突變；或者US 5843711中公開的片段]、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素、OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取-EP0372501)、合成肽(EP0378881、 EP0427347)、熱休克蛋白(W093/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(W0 98/58668、 EP0471177)、細(xì)胞因子、淋巴因子、生長因子或激素(W0 91/01146)、包含來自多種病原體來源的抗原的人⑶4+T細(xì)胞表位的人工蛋白質(zhì)(Falugi等人O001)Eur J Immunol 31; 3816-3824)，如 N19 蛋白(Baraldoi 等人(2004) Infect Immun 72 ；4884-7)肺炎球菌表面蛋白 PspA(W) 02/091998)肺炎球菌溶血素(Kuo 等人(1995nnfect Immun 63 ；2706-13)、 鐵攝取蛋白(W001/72337)、難辨梭狀芽孢桿菌(C. difficile)的毒素A或B(W0 00/61761) 或蛋白 D(EP594610 和 WO 00/56360)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物在Hib綴合物和至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌綴合物中，任選在Hib綴合物和每種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物(任選免疫原性組合物中存在的所有糖綴合物)中使用相同的載體蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物任選地包含Hib糖綴合物和Men多糖綴合物、Hib糖綴合物和MenC糖綴合物、Hib糖綴合物和MenW糖綴合物、Hib糖綴合物和 MenY糖綴合物、Hib糖綴合物和Men和MenC糖綴合物、Hib糖綴合物和Men和MenW糖綴合物、Hib糖綴合物和Men和MenY糖綴合物、Hib糖綴合物和MenC和MenW糖綴合物、Hib糖綴合物和MenC和MenY糖綴合物、Hib糖綴合物和MenW和MenY糖綴合物、Hib糖綴合物和 MenA, MenC和MenW糖綴合物、Hib糖綴合物和MenA、MenC和MenY糖綴合物、Hib糖綴合物和MenA、Menff和MenY糖綴合物、Hib糖綴合物和MenC、Menff和MenY糖綴合物或Hib糖綴合物和MenA、MenC、Menff和MenY糖綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，單一載體蛋白可以攜帶一種以上的糖抗原(W004/083251)。例如，單一載體蛋白可以綴合至Ij Hib禾口 MenA、Hib禾口 MenC、Hib禾口 MenW、Hib禾口 MenY、MenA禾口 MenC、MenA 禾口 MenW、MenA 禾口 MenY、MenC 禾口 MenW、MenC 禾口 MenY 或 Menff 禾口 MenY。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白的Hib糖，所述載體蛋白選自TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D。其中對于Hib，所述載體蛋白是TT或者其片段和至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖，載體的總劑量為 2. 5-25 μ g,3-20 μ g,4-15 μ g,5-12. 5 μ g, 15-20 μ g, 16-19 μ g 或 17-18 μ g。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白的至少1、2、3、 或4種腦膜炎奈瑟氏球菌細(xì)菌糖，所述載體蛋白選自TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D。本發(fā)明的免疫原性組合物任選地包含Hib糖綴合物，其Hib與載體蛋白的比例為 1:5 至 5: 1;1:2 至 2: 1 ；1 1 至 1:4;1:2 至 1: 3. 5 ；或約或剛好 1 2.5 或 1 3(w/w)。本發(fā)明的免疫原性組合物任選包含至少一種腦膜炎球菌糖(例如，MenA和/或 MenC和/或MenW和/或MenY)綴合物，其Men糖與載體蛋白的比例為1 5到5 1、1 2 到 5 1、1 0.5 至Ijl 2. 5 或 1 1. 25 至Ij 1 2. 5 (w/w)。使用滅菌的綴合物可以測定綴合物中糖與載體蛋白(w/w)的比例。使用Lowry測定法(例如 Lowry 等人(1951) J. Biol. Chem. 193,265-275 或 Peterson 等人，Analytical Biochemistry 100，201-220 (1979))測定綴合物中糖與載體蛋白(w/w)的比例((w/w))并將ICP-OES (電感耦合的等離子體-光學(xué)發(fā)射光譜法)用于MenA，DMAP測定法用于MenC和間苯二酚測定法用于 MenW 和 MenY (Monsigny 等人(1988) Anal. Biochem. 175,525-530)以測定糖的量。在本發(fā)明的免疫原性組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，Hib糖通過接頭，如雙功能接頭綴合到載體蛋白。接頭任選地是異雙功能的或者同雙功能的，具有例如一個(gè)活性氨基和一個(gè)活性羧酸基團(tuán)、2個(gè)活性氨基或2個(gè)活性羧酸基團(tuán)。接頭具有例如4到20、4到12、5到10 個(gè)碳原子?？赡艿慕宇^是ADH。其他接頭包括B-丙酰氨基(W0 00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever 等人(1979)Med. Microbiol. Immunol. 165 ；171-288)、鹵代燒基鹵(US4057685) 糖苷鍵(US4673574, US4808700)和 6-氨基己酸(US4459286)。在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的糖綴合物可以通過任何已知的偶聯(lián)技術(shù)制備。例如，可以通過硫醚鍵將糖偶聯(lián)。綴合方法可以依賴于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶饋活化糖以形成氰酸酯。從而，活化的糖可以直接或者通過間隔基(接頭)被偶聯(lián)到載體蛋白上的氨基。任選地，用己二胺或者ADH將氰酸酯偶聯(lián)并且使用涉及硫醚鍵形成的雜連接化學(xué)將氨基衍生的糖綴合到載體蛋白，或者使用碳二亞胺(例如，EDAC或EDC)化學(xué)將其綴合到載體蛋白。此類綴合物在PCT公布的申請WO 93/15760 Uniformed Services University 和 WO 95/08348 和 WO 96/29094 中描述。其他合適的技術(shù)使用碳酰亞胺、酰胼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多在WO 98/42721中描述。綴合可以涉及羰基接頭，其可以通過糖的游離羥基與CDI反應(yīng)(Bethell等人J. Biol. Chem. 1979,254 ；2572-4，Heam等人 J. Chromatogr. 1981.218 ；509-18)，接著通過與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成氨基甲酸酯鍵而形成。這可以涉及將異頭末端還原成伯羥基，任選地保護(hù)/去保護(hù)伯羥基，使伯羥基與CDI反應(yīng)形成 CDI氨基甲酸酯中間體并將CDI氨基甲酸酯中間體與蛋白質(zhì)上的氨基反應(yīng)。通過如US 4365170 (Jennings)和 US 4673574 (Anderson)中描述的直接還原胺化方法也可以制備綴合物。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。另一方面涉及通過碳化二亞胺縮合(Chu C.等人hfect. Immunity，1983 245 256)，例如使用EDAC，將用己二酸酰胼(ADH)衍生的溴化氰(或CDAP)活化的糖偶聯(lián)到載體蛋白(Chu C.等人 hfect. Immunity，1983 245 256)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將糖上的羥基直接或間接(通過接頭)地連接到蛋白質(zhì)上的氨基或羧基。當(dāng)存在接頭時(shí)，任選地例如使用CDAP綴合，將糖上的羥基連接到接頭上的氨基。接頭(例如ADH)上的另一氨基可以被綴合到蛋白質(zhì)上的羧酸基團(tuán)，例如，通過使用碳化二亞胺化學(xué)，例如，通過使用EDAC。在一個(gè)實(shí)施方案中，在接頭被綴合到載體蛋白前，首先將Hib或者至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合到接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)Hib糖存在時(shí)，其被使用CNBr、或者CDAP，或者CDAP和碳化二亞胺化學(xué)(如EDAC)的組合，或CNBr和碳化二亞胺化學(xué)(如EDAC)的組合綴合到載體蛋白。任選地，使用CNBr和碳化二亞胺化學(xué)(任選EDAC)綴合Hib。例如，用CNBr連接糖和接頭，然后用碳化二亞胺化學(xué)連接接頭和蛋白質(zhì)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖中的至少一種被直接綴合到載體蛋白。任選地，將MenW和/或MenY和/或MenC和/或MenA糖直接綴合到載體蛋白。 例如,將 Menff ；MenY ；MenC ；MenA ；Menff 禾口 MenY ；Menff 禾口 MenC ；MenY 禾口 MenC ； ^ Menff, MenY 和MenC直接連接到載體蛋白。任選地，通過CDAP將至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖中的至少一種直接綴合。例如，將 Menff ；MenY ；MenC ；Menff 禾口 MenY ；Menff 禾口 MenC ；MenY 禾口 MenC ；或 Menff, MenY和MenC通過CDAP直接連接到載體蛋白(見WO 95/08348和W096/29094)。任選地，MenW和/或Y糖與載體蛋白的比例為1 0. 5到1 2 (w/w)或者M(jìn)enC 糖與載體蛋白的比例為1 0. 5和1 2或1 1.25和1 1. 5或1 0. 5和1 1 (w/ w)，特別任選地使用CDAP將這些糖直接連接到蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過接頭，如雙功能接頭將至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合到載體蛋白。接頭任選地是異雙功能的或者同雙功能的，具有例如一個(gè)活性氨基和一個(gè)活性羧酸基團(tuán)、2個(gè)活性氨基或2個(gè)活性羧酸基團(tuán)。接頭具有例如4到20、4到12和5到 10個(gè)碳原子?？赡艿慕宇^是ADH。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過接頭將MenA ；MenC ；或MenA和MenC綴合到載體蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用CDAP和EDAC，通過接頭將腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合到載體蛋白。例如，使用如上述的CDAP和EDAC，通過接頭(例如，在其末端具有兩個(gè)氨基，如 ADH)將MenA ；MenC ；或MenA和MenC綴合到蛋白質(zhì)。例如，用CDAP將糖綴合到接頭并用 EDAC將接頭綴合到蛋白質(zhì)。任選地，對于MenA ；MenC ；或MenA和MenC，通過接頭的綴合導(dǎo)致糖與載體蛋白的比例為1 0.5到1 6;1 1到1 5或1 2到1 4。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白的來自血清群 A、C、W和Y中的至少1、2、3或4種的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖，其中至少1、2、3或4種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖或者被最高達(dá)xl. 5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、 x9、xl0或x20的系數(shù)按大小分級(jí)。例如，至少1、2、3或4種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小為約 50kDa、60kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa 或 130kDa?！疤烊欢嗵恰笔侵高€沒有接受目的是減小該多糖的大小的處理的多糖。 “被最高達(dá)x2的系數(shù)按大小分級(jí)”是指對該多糖進(jìn)行一種處理，該處理的目的是減小多糖的大小但是保留超過天然多糖大小的一半的尺寸。X3、x4等以相同的方式被解釋， 即，對多糖進(jìn)行處理，其目的是減小多糖的大小但是保留超過天然多糖大小1/3、1/4等等的大小。在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白的來自血清群A、C、W和 Y的至少1、2、3或4種的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖，其中至少1、2、3或4種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，免疫原性組合物包含綴合到載體蛋白的來自血清群A、C、 W和Y的至少1、2、3或4種的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖，其中至少1、2、3或4種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖被最高達(dá)xl. 5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的系數(shù)按大小分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少1、2、3或4種或每種腦膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小如通過 MALLS 測定的，為 50KDa 到 1500kDa、50kDa 到 500kDa、50kDa 到 300KDa、IOlkDa 到 1500kDa、IOlkDa 到 500kDa、IOlkDa 到 300kDa。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)MenA糖存在時(shí)，其具有如通過MALLS測定的50_500kDa、 50-100kDa、100-500kDa、55-90KDa、60-70kDa 或 70_80kDa 或 60_80kDa 的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)MenC糖存在時(shí)，其具有如通過MALLS測定的100_200kDa、 50-100kDa、100-150kDa、101-130kDa、150-210kDa 或 180_210kDa 的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)MenY糖存在時(shí)，其具有如通過MALLS測定的60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50_100kDa、100_140kDa、 140-170kDa 或 150_160kDa 的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)MenW糖存在時(shí)，其具有如通過MALLS測定的60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa、110-140kDa、50-100kDa 或 120_140kDa 的
分子量。糖的分子量是指在綴合之前并且通過MALLS測定的多糖的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖或者在正常提取物過程中大小減小的天然多糖。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將腦膜炎奈瑟氏球菌糖通過機(jī)械斷裂，如通過微流化或者超聲處理按大小分級(jí)。微流化和超聲處理具有降低較大的天然多糖的大小而足以提供可濾過的綴合物的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖的多分散性是1-1. 5,1-1. 3,1-1. 2U"1. 1或1-1. 05并且在綴合到載體蛋白后，綴合物的多分散性為1. 0-2. 5,1. 0-2. 0,1. 0-1. 5,1. 0-1. 2,1. 5-2. 5、 1. 7-2. 2或1. 5-2. 0。所有多分散性都通過是MALLS測量的。對于腦膜炎球菌糖的MALLS分析，可以組合使用兩個(gè)柱子(TSKG6000和5000PWxl TOSOH Bioscience)并用水洗脫糖。使用光散射檢測器(例如，裝備IOmW氬激光器的Wyatt Dawn DSP在488nm下)和干涉測量折射計(jì)(例如，裝備PlOO測定池和紅色濾光器的Wyatt Otilab DSP在498nm下)檢測糖類。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)MenA糖，其被至少部分地0_乙?；?，使得至少50 %、 60 %、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單位在至少一個(gè)位置被0-乙酰化。0-乙?；绱嬖谟谥辽?-位。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)MenC糖，其被至少部分地0_乙酰化，使得至少30 %、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 98% 的 O — 9)-連接的 NeuNAc 重復(fù)單位在至少一個(gè)或兩個(gè)位置被0-乙?；?-乙?；绱嬖谟?-7和/或0-8位。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)MenW糖，其被至少部分地0-乙?；?，使得至少30%、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重復(fù)單位在至少一個(gè)或兩個(gè)位置被0-乙?；?-乙?；绱嬖谟?-7和/或0-9位。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)MenY糖，其被至少部分地0_乙?；?，使得至少40 %、 50 %、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重復(fù)單位在至少一個(gè)或兩個(gè)位置被0-乙酰化。 0-乙酰化存在于7和/或9位。0-乙?；陌俜直仁侵负?-乙?；闹貜?fù)單位的百分比。這可以在綴合之前和/或綴合后在糖中測量。本發(fā)明的另一方面是包含本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的疫苗。任選地，免疫原性組合物或疫苗含有足夠增強(qiáng)對免疫原的免疫應(yīng)答量的佐劑。合適的佐劑包括，但不限于，鋁鹽(磷酸鋁或氫氧化鋁)、角鯊烯混合物(SAF-I)、胞壁酰肽、 皂苷衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制備物、單磷酰脂質(zhì)A、霉酚酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞基、聚磷腈和衍生物，和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)，如 Takahashi 等人(1990)Nature 344 :873-875 描述的那些。對于上文討論的HibMen組合，有利的是Hib和Men糖綴合物不被吸附到鋁鹽佐劑或者任何佐劑上。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物是無佐劑的。對于本發(fā)明，“無佐劑的”是指自身不作是抗原性組分的佐劑組分不存在于免疫原性組合物中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，H印B被吸附到磷酸鋁(W093/M148)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含通過接頭綴合到破傷風(fēng)類毒素的Hib糖和直接或通過接頭綴合到破傷風(fēng)類毒素的MenC糖和直接或通過接頭綴合到破傷風(fēng)類毒素的MenA糖。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物被緩沖在、或調(diào)節(jié)到pH 7. 0到8. 0， pH 7. 2到7. 6或約或剛好pH 7. 4。任選地在穩(wěn)定劑如多元醇如蔗糖或者海藻糖存在下凍干本發(fā)明的免疫原性組合物或者疫苗。對于所有免疫原性組合物或疫苗，必須通過經(jīng)驗(yàn)確定免疫原的免疫學(xué)有效量。待考慮的因素包括免疫原性、免疫原是否將與佐劑或載體蛋白或其他蛋白質(zhì)復(fù)合或者共價(jià)連接、施用途徑和待施用的免疫劑量數(shù)。此類因素是疫苗領(lǐng)域已知的并且免疫學(xué)家完全可以不用過度實(shí)驗(yàn)來做出此類確定?；钚詣┛梢砸圆煌臐舛却嬖谟诒景l(fā)明的藥物組合物或疫苗中。通常，物質(zhì)的最小濃度是實(shí)現(xiàn)它的預(yù)期用途必須的量，盡管最大濃度是將保持在溶液中或者均勻懸浮在最初混合物中的最大量。例如，治療劑的最小量任選地為將提供單一治療有效劑量的量。對于生物活性物質(zhì)，最小濃度是重構(gòu)時(shí)生物活性必需的量，并且最大濃度是不能保持均勻懸浮液時(shí)的濃度。對于單次劑量單位，所述量是單次治療應(yīng)用的量。通常，預(yù)期每劑將包含 1-100 μ g蛋白質(zhì)抗原，任選地5-50 μ g或5-25 μ g。本發(fā)明的疫苗制劑可以用于保護(hù)或治療對感染敏感的哺乳動(dòng)物(例如，人類患者)，可以通過全身或粘膜途徑施用所述疫苗。人類患者任選地為嬰兒(12個(gè)月以下)、初學(xué)走路的孩子(12-M、12-16或12-14個(gè)月)、兒童 (2-10、3-8或3-5歲)和青少年(12-25、14-21或15-19歲)或成人(12、15、18或21歲以上)。這些施用可以包括通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或者皮下途徑注射；或者通過粘膜施用到口腔/食道、呼吸道、生殖泌尿道。優(yōu)選鼻內(nèi)施用疫苗以治療肺炎或者中耳炎(如可以有效預(yù)防肺炎雙球菌的鼻粘膜攜帶，從而減輕它的最早階段的感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可以作為單次劑量施用，但是其組分也可以一起或者在不同的時(shí)間共同施用(例如，如果糖存在于疫苗中，那么這些可以在同時(shí)分開施用或者在細(xì)菌蛋白質(zhì)疫苗施用后1-2周施用以最佳地協(xié)調(diào)相互的免疫應(yīng)答)。除了單一施用途徑外，還可以使用2種不同的施用途徑。例如， 病毒抗原可以ID(皮內(nèi))施用，而細(xì)菌蛋白質(zhì)可以IM(肌內(nèi))或者IN(鼻內(nèi))施用。如果存在糖類，那么它們可以IM(或ID)施用并且病毒蛋白質(zhì)可以IN(或ID)施用。此外，本發(fā)明的疫苗可以被IM施用用作引發(fā)劑量，以及IN施用用作加強(qiáng)劑量。疫苗制劑一般被描述于疫苗設(shè)計(jì)(“The subunit and adjuvant approach "(Powell Μ. F.禾口 Newman Μ. J.著)(1995) Plenum Press New York)。Ful lerton, 美國專利4，235，877描述了在脂質(zhì)體內(nèi)的包裹。本發(fā)明的另一方面是用于相伴或者順序施用的疫苗試劑盒，其包含兩種多價(jià)免疫原性組合物，用于在宿主中賦予抗百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)禾口腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)弓I起的疾病的保護(hù)。例如，該試劑盒任選地包含第一個(gè)容器和第二容器，第一容器包含一種或多種破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，和全細(xì)胞百日咳組分和任選地還包含乙型肝炎表面抗原，第二個(gè)容器包含
Hib糖綴合物，和至少1、2、3或4種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物，其中Hib綴合物的糖劑量小于5 μ g或4 μ g，或1-4 μ g或1-3 μ g，或2-4 μ g或 2-3 yg或者約或剛好2. 5 μ g，任選地至少或剛好1、2、3或4種額外的細(xì)菌糖綴合物(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物)或其每一種的糖劑量小于10 μ g、9 μ g、8 μ g、7 μ g、6 μ g、
5μ g 4 μ 1"10 μ g、1~8 μ g、1一6 μ g、1~5 μ g、1一4 μ g、1~3 μ g、$ 2~4 Ug^ 2~3 Ug^. 間或約或剛好2.5 μ g。Hib綴合物和至少一種額外的細(xì)菌糖(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌糖)綴合物的實(shí)例如上述。上述綴合物的任一種性質(zhì)可以存在于疫苗試劑盒中。任選地，本發(fā)明的疫苗試劑盒包含第三種組分。例如，本發(fā)明的試劑盒任選地包含第一個(gè)容器和第二個(gè)容器以及第三個(gè)容器，第一個(gè)容器包含一種或多種破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，和全細(xì)胞百日咳組分，和任選包含乙型肝炎表面抗原；第二個(gè)容器包含載體蛋白和來自肺炎鏈球菌的莢膜糖的一種或多種綴合物[其中莢膜糖任選來自選自 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、 23F和33F的肺炎球菌血清學(xué)]，而第三個(gè)容器包含Hib糖綴合物，和至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物，其中Hib綴合物的糖劑量小于5 μ g或4 μ g，或1-4 μ g或1-3 μ g，或2-4 μ g或 2-3 μ g或者約或剛好2. 5 μ g，并且任選地至少或剛好1、2、3或4種額外的細(xì)菌糖綴合物 (例如，腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物)或其每一種的糖劑量小于10 μ g、9 μ g、8 μ g、7 μ g、
6μ g>5 μ g 4 μ g> $ 1—10 μ g、1一8 μ g、1一6 μ g、1一5 μ g、1一4 μ g、1一3 μ g、 2~4 Ug^ 2-3 μ g之間或約或剛好2. 5 μ g。包含腦膜炎球菌綴合物，如HibMenC、HibMenAC, HibMenAff, HibMenAY, HibMenCff, HibMenCY, HibMenffY, MenAC, MenAff, MenAY, MenCW、MenCY, MenffY 或 MenACWY 的免疫原性組合物，包括與上述那些相似組分的試劑盒任選地包含來自麻疹和/或腮腺炎和/或風(fēng)疹和/ 或水痘的抗原。例如，腦膜炎球菌免疫原性組合物含有來自麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹或麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹和水痘的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些病毒抗原任選地存在于與腦膜炎球菌和 /或Hib糖綴合物相同的容器中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將這些病毒抗原凍干。本發(fā)明的另一方面是制備本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，其包括將Hib糖綴合物與至少一種額外的細(xì)菌(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌)糖綴合物和選自全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原混合而形成組合物的步驟，其中Hib綴合物的糖劑量小于5 μ g 或4 μ g，或1-4 μ g或1-3 μ g，或2-4 μ g或2_3 μ g之間或者約或剛好2. 5 μ g，并且任選地， 至少或剛好1、2、3或4種額外的細(xì)菌(如腦膜炎奈瑟氏球菌)糖綴合物或其每一種的糖劑 fi /h T 10 μ g>9 μ g>8 μ g>7 μ g>6 μ g>5 μ g 4 μ g> 1—10 μ g>l~8 μ g>l~6 μ g>l"5 μ g、1-4 μ g、1-3 μ g、或 2-4 μ g 或 2-3 μ g 之間或約或剛好 2. 5 μ g。本發(fā)明另一方面是免疫人宿主以抗流感嗜血桿菌和任選地腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，其包括對宿主施用免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的免疫原性組合物，其用于治療或預(yù)防由流感嗜血桿菌和/或腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病。本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒用于生產(chǎn)治療或預(yù)防由流感嗜血桿菌和/或腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的藥物的用途。如本文所用的術(shù)語“包含”和“包括”被發(fā)明人意在與術(shù)語“由...組成”和“組成為”在每一方面可以任選地替代。本專利說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾埗家氡疚淖鳛閰⒖肌Ｔ诟诫S的實(shí)施例中闡明本發(fā)明。除了另外詳細(xì)描述的之外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行下面的實(shí)施例。這些實(shí)施例是舉例說明性的，并且不限定本發(fā)明。
具體實(shí)施方案實(shí)施例實(shí)施例1-多糖綴合物的制備通過Chu等人anfection and Immunity 1983,40(1) ；245-256)開發(fā)的偶聯(lián)化學(xué)方法進(jìn)行流感嗜血桿菌(Hib)PRP多糖與TT的共價(jià)結(jié)合。通過加入CNBr并在ρΗΙΟ. 5溫育 6分鐘活化Hib PRP多糖。將pH降低到pH8. 75并加入己二酸二酰胼(ADH)并繼續(xù)溫育90 分鐘。使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)通過碳化二亞胺縮合將活化的PRP偶聯(lián)到純化的破傷風(fēng)類毒素。加入EDAC到活化的PRP以達(dá)到0. 6mg EDAC/ mg活化的PRP的最終比例。調(diào)節(jié)pH到5.0并加入純化的破傷風(fēng)類毒素至達(dá)到aiig TT/mg 活化的PRP。將所得溶液在溫和攪拌下放置3天。通過0.45 4!11膜過濾后，在用0.211 NaCl 平衡的聚丙烯酰胺葡聚糖S500HR(Wiarmacia，Sweden)柱上純化綴合物。使用(通過MALLS測量在150kDa以上的)天然多糖或者通過溫和微流化產(chǎn)生 MenC-TT綴合物。使用天然多糖或者如通過實(shí)施例2的方法測量的60kDa以上溫和微流化的多糖產(chǎn)生MenA-TT綴合物。使用如通過MALLS測量的約100-200kDa的按大小分級(jí)的多糖產(chǎn)生MenW和MenY-TT綴合物(見實(shí)施例2)。使用勻漿器Emulsiflex C-50裝置通過微流化進(jìn)行按大小分級(jí)。然后通過0.2μπι濾器過濾多糖。如W096/29094和WO 00/56360中所述的進(jìn)行活化和偶聯(lián)。簡言之，將2Μ NaCl pH 5. 5-6. 0中10-20mg/ml濃度的多糖與CDAP溶液(用乙腈/WFI50/50新鮮制備的IOOmg/ ml)混合至最終CDAP/多糖比例為0.75/1或1.5/1。1. 5分鐘后，用氫氧化鈉升高pH到 pH10.0o 3分鐘后，加入破傷風(fēng)類毒素以達(dá)到糖/蛋白質(zhì)比例對于MenW為1.5/1，對于MenY 為1. 2/1，對于MenA為1. 5/1或?qū)τ贛enC為1. 5/1。反應(yīng)持續(xù)1到2小時(shí)。在偶聯(lián)步驟之后，加入甘氨酸至甘氨酸/PS(w/w)最終比例為7. 5/1并調(diào)節(jié)pH到 PH9.0。將混合物放置30分鐘。使用10 μ m Kleenpak濾器澄清綴合物，然后裝載到聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR柱上，使用150mMNaCl，IOmM或5mM Tris pH7. 5的洗脫液。在Opticap 4無菌膜上過濾臨床批號(hào)。得到的綴合物的平均多糖蛋白質(zhì)比例為1 1-1 5(w/w)0
為了通過間隔基將MenA莢膜多糖綴合到破傷風(fēng)類毒素，使用下面的方法。通過偶聯(lián)化學(xué)方法進(jìn)行多糖和間隔基(ADH)的共價(jià)結(jié)合，通過該方法，在受控的條件下通過氰化 (cyanylating)試劑四氟硼酸1_氰基_4_ 二甲基氨基吡啶饋(CDAP)活化多糖。使間隔基通過它的胼基與氰化的PS反應(yīng)，在間隔基和多糖之間形成穩(wěn)定的異脲。用新鮮制備的乙腈/水(50/50(v/v))中的100mg/ml CDAP溶液處理10mg/ml MenA 溶液得到CDAP/MenA比例為0. 75 (w/w)。1. 5分鐘后，升高pH到pH 10. O。3分鐘后，加入 ADH得到ADH/MenA比例為8. 9。降低溶液的pH到8. 75并且進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)。在綴合反應(yīng)前，將純化的TT融合和將PSAah溶液稀釋而達(dá)到10mg/ml的PSAah濃度和10mg/ml的TT濃度。向PSAah溶液中加入EDAC以便達(dá)到0. 9mg EDAC/mg PSAah的最終比例。調(diào)節(jié)pH到 5.0。用蠕動(dòng)泵(60分鐘內(nèi))加入純化的破傷風(fēng)類毒素達(dá)到aiig TT/mg PSAah。將所得溶液在+25°C在攪拌下放置60分鐘，得到120分鐘的最終偶聯(lián)時(shí)間。使用10 μ m濾器澄清綴合物并用聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR柱進(jìn)行純化。實(shí)施例2-使用MALLS測定分子量將檢測器連接到HPLC大小排阻柱，從其洗脫樣品。一方面，激光散射檢測器在16 個(gè)角度處測量大分子溶液散射的光強(qiáng)度，另一方面，在線放置的干涉測量折射計(jì)允許測定洗脫的樣品的量。從這些強(qiáng)度可以測定溶液中大分子的大小和形狀。以重量計(jì)的平均分子量(Mw)被定義為所有物種的重量乘以它們各自的分子量的和并除以所有物種重量之和。a)重量-平均分子量-Mw-[
0123]
權(quán)利要求
1.免疫原性組合物，其包含Hib糖綴合物、至少一種額外的細(xì)菌如腦膜炎奈瑟氏球菌的糖綴合物以及選自由全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原組成的組的另一抗原，其中Hib 糖綴合物的糖劑量小于5 μ g。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中至少一種額外的細(xì)菌，例如，腦膜炎奈瑟氏球菌的糖綴合物或者其每一種的糖劑量小于6 μ g。
3.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中至少一種額外的細(xì)菌，例如，腦膜炎奈瑟氏球菌的糖綴合物包含來自選自血清群A、B、C、W135和Y的菌株的腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜糖。
4.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C莢膜糖(MenC)。
5.權(quán)利要求3或4的免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A莢膜糖 (MenA)。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y莢膜糖(MenY)。
7.權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W135莢膜糖(MenW)。
8.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含DT、TT、Pw和!fepB。
9.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B外膜泡制劑。
10.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含來自選自血清群1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的菌株的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖。
11.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含傷寒沙門氏菌莢膜糖。
12.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中相同的載體蛋白被用于Hib綴合物和所述的至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物或其每一種。
13.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中Hib糖被綴合到選自TT、DT、 CRM197、TT的片段C、蛋白D、0MPC和肺炎鏈球菌溶血素的載體蛋白。
14.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖或其每一種被綴合到選自TT、DT、CRM197、TT的片段C、蛋白D、0MPC和肺炎鏈球菌溶血素的載體蛋白。
15.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在Hib糖綴合物中Hib與載體蛋白的比例為 1 5 到 5 1、1 1到1 4、1 2 到 1 3. 5 或約 1 3 (w/w)。
16.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中Hib糖經(jīng)由接頭被綴合到載體蛋白。
17.權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中所述接頭是雙功能的。
18.權(quán)利要求17的免疫原性組合物，其中所述接頭具有兩個(gè)活性氨基。
19.權(quán)利要求17的免疫原性組合物，其中所述接頭具有兩個(gè)活性羧酸基團(tuán)。
20.權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中所述接頭在一端具有活性氨基并且在另一端具有活性羧酸基團(tuán)。
21.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述接頭具有4到12個(gè)碳原子。
22.權(quán)利要求16或17的免疫原性組合物，其中所述接頭是ADH。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用CNBr或CDAP將Hib糖綴合到載體蛋白或接頭。
24.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用碳化二亞胺化學(xué)方法、任選地使用EDAC化學(xué)方法將載體蛋白綴合到Hib糖或接頭。
25.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物或其每一種具有1 5-5 1或1 1-1 4(w/w)的糖載體比例。
26.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖被直接綴合到載體蛋白。
27.權(quán)利要求沈的免疫原性組合物，其中至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖是MenW和/或 MenY、Menff 禾口 / 或 MenC、MenY 禾口 / 或 MenC、或 MenW 禾口 MenC 禾口 MenY。
28.權(quán)利要求沈或27的免疫原性組合物，其中通過CDAP化學(xué)方法將至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖直接綴合。
29.權(quán)利要求沈-28中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中MenW和/或Y糖與載體蛋白的比例為1 0. 5至Ij 1 2。
30.權(quán)利要求沈-29中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中MenC糖與載體蛋白的比例為 1 0. 5 至Ij 1 2。
31.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中經(jīng)由接頭將一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合到載體蛋白。
32.權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中所述接頭是雙功能的。
33.權(quán)利要求32的免疫原性組合物，其中所述接頭具有兩個(gè)活性氨基。
34.權(quán)利要求32的免疫原性組合物，其中所述接頭具有兩個(gè)活性羧酸基團(tuán)。
35.權(quán)利要求32的免疫原性組合物，其中所述接頭在一端具有活性氨基并且在另一端具有活性羧酸基團(tuán)。
36.權(quán)利要求31-35的免疫原性組合物，其中所述接頭具有4到12個(gè)碳原子。
37.權(quán)利要求31或32的免疫原性組合物，其中所述接頭是ADH。
38.權(quán)利要求31-37任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中通過CDAP化學(xué)方法將一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌糖或者其每一種綴合到接頭。
39.權(quán)利要求31-38中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用碳化二亞胺化學(xué)方法，任選地使用EDAC將所述載體蛋白綴合到接頭。
40.權(quán)利要求31-39中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在載體蛋白被綴合到接頭之前， 將每種腦膜炎奈瑟氏菌糖或每一種綴合到接頭。
41.權(quán)利要求31-40中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中經(jīng)由接頭將MenA綴合到載體蛋白。
42.權(quán)利要求41的免疫原性組合物，其中MenA糖與載體蛋白的比例為1 2到1 5。
43.權(quán)利要求31-42中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中通過接頭將MenC綴合到載體蛋 白。
44.權(quán)利要求43的免疫原性組合物，其中MenC糖與載體蛋白的比例為1 2到1 5。
45.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenA糖存在時(shí)，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 50-100kDa、55_90KDa 或 60_80kDa 的平均大小。
46.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenC糖存在時(shí)，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 100_200kDa、100_150kDa 或 150_200kDa 之間的平均大
47.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenY糖存在時(shí)，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90_160kDa、 100-150kDa或110_140kDa之間的平均大小。
48.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenW糖存在時(shí)，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90_160kDa、 100-150kDa或110_140kDa之間的平均大小。
49.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenC存在時(shí)，其被至少部分地 0-乙酰化，使得至少30%的重復(fù)單位在至少一個(gè)位置被0-乙?；?br> 50.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenY存在時(shí)，其被至少部分地 0-乙?；?，使得至少20%的重復(fù)單位在至少一個(gè)位置被0-乙酰化。
51.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenW存在時(shí)，其被至少部分地 0-乙酰化，使得至少30%的重復(fù)單位在至少一個(gè)位置被0-乙酰化。
52.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中當(dāng)MenA存在時(shí)，其被至少部分地 0-乙酰化使得至少50%的重復(fù)單位在至少一個(gè)位置被0-乙?；?。
53.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中hib糖綴合物和至少一種腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物不被吸收到鋁鹽上。
54.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其是無佐劑的。
55.前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其被緩沖在pH7.0到8.0之間。
56.疫苗，其包含權(quán)利要求1-55中任一項(xiàng)的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
57.用于相伴或者順序給藥的疫苗試劑盒，其包含兩種多價(jià)免疫原性組合物，該組合物用于在宿主中賦予抗由百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌 (Clostridium tetani)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)禾口、流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)引起的疾病的保護(hù)，所述試劑盒包含第一個(gè)容器和第二個(gè)容器，第一個(gè)容器包含破傷風(fēng)類毒素(TT)，和白喉類毒素(DT)，和全細(xì)胞百日咳組分，和/或乙型肝炎表面抗原；第二個(gè)容器包含含有權(quán)利要求1^5中任一項(xiàng)的免疫原性組合物的免疫原性組合物。
58.權(quán)利要求57的疫苗試劑盒，其中所述第一個(gè)容器還包含吸附到磷酸鋁上的乙型肝炎表面抗原。
59.權(quán)利要求57或58的疫苗試劑盒，其中所述第一個(gè)或第二個(gè)容器還包含失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV)。
60.用于制備權(quán)利要求1-55中任一項(xiàng)的免疫原性組合物的方法，其包括將Hib綴合物與至少一種額外的細(xì)菌糖綴合物和選自全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原混合以形成組合物的步驟，其中Hib糖綴合物的糖劑量小于5 μ g并且至少一種額外的細(xì)菌糖綴合物或者其每一種的糖劑量小于6 μ g。
61.免疫人宿主以抗腦膜炎的方法，其包括對該宿主施用免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求 1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒。
62.免疫人宿主以抗由流感嗜血桿菌引起的疾病的方法，其包括對該宿主施用免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒。
63.免疫人宿主以抗由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的方法，其包括對該宿主施用免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒。
64.用于治療或預(yù)防腦膜炎的權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒。
65.用于治療或預(yù)防由流感嗜血桿菌引起的疾病的權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒。
66.用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒。
67.權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防腦膜炎的藥物中的用途。
68.權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防由流感嗜血桿菌引起的疾病的藥物中的用途。
69.權(quán)利要求1-59任一項(xiàng)的免疫原性組合物、疫苗或者試劑盒在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含Hib糖綴合物、至少一種額外的細(xì)菌如腦膜炎奈瑟氏球菌糖綴合物和選自全細(xì)胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原的免疫原性組合物，其中Hib糖綴合物的糖劑量小于5μg。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102218138SQ20111014386
公開日2011年10月19日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者C·卡皮奧, D·布特里奧, J·普爾曼, P·德內(nèi)爾, P·迪維維耶, R·L·比曼斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司