專利名稱：人rack1與mkk7相互作用表位的確定及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的功能表位的合理確定及應(yīng)用?；谏锎蠓肿娱g相互識(shí)別的空間結(jié)構(gòu)信息，借助計(jì)算機(jī)輔助分析技術(shù)，合理預(yù)測(cè)生物大分子間相互識(shí)別的功能表位；通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)的功能表位進(jìn)行驗(yàn)證；進(jìn)一步將該表位應(yīng)用于抑制腫瘤生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
JNK是MAI3K家族的重要成員。應(yīng)激、生長(zhǎng)因子、炎癥刺激等多種胞外刺激因子可激活以JNK為中心的JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。JNK通路的活化遵循經(jīng)典的MAHi蛋白序列磷酸化模式。其上游激酶是MKK7。MKK7通過(guò)雙磷酸化JNK的Thrl83、Tyrl85位點(diǎn)使JNK獲得蛋白激酶活性。JNK活化以后，可以調(diào)控多種底物的功能活性，這些底物既包括bcl-2家族成員等胞漿蛋白，又包括c-juruc-myc等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。此外，JNK還通過(guò)磷酸化非依賴的方式調(diào)節(jié)P53等蛋白的穩(wěn)定性。通過(guò)以上這些機(jī)制，JNK參與了多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、炎癥因子的產(chǎn)生、遷移等。而JNK活性的紊亂又促進(jìn)了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。MKK7-JNK途徑在多種生理病理?xiàng)l件下發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究這條通路的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義，可能為相關(guān)疾病的干預(yù)提供新靶點(diǎn)、新策略。RACKl (激活的蛋白激酶C的受體)是由7個(gè)Trp-Asp40 (WD40)高度保守的序列組成的分子量為36KD的蛋白。且RACKl蛋白從衣藻到人都是保守的。因?yàn)槠渑c哺乳動(dòng)物 G蛋白異源三聚體β亞基有同源性，故又被稱為GNB2L1，即鳥嘌核苷酸結(jié)合蛋白β 2-樣 1。RACKl只能與激活的蛋白激酶CO5KC)相互作用，同時(shí)既可以作為HiC的錨定蛋白，還可以招募PKC或者其它蛋白如PDE4D5、Src來(lái)行使支架蛋白的功能。而RACKl七個(gè)β螺旋組成的空間結(jié)構(gòu)為其調(diào)節(jié)蛋白與蛋白相互作用提供了多蛋白相互作用表面。RACKl在高等哺乳動(dòng)物和人類的組織中廣泛表達(dá)，包括腦、肝臟和腎等等，并且在生理方面發(fā)揮重要作用， 例如細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞的生長(zhǎng)、大腦的功能及免疫反應(yīng)。此外，文獻(xiàn)報(bào)道RACKl在人癌癥中表達(dá)上調(diào)，例如肝癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等等(Pablo Lopez-Bergami，Conway Huang, Conway Huang, et al. Rewired ERK-JNKSignalingPathwaysinMelanoma. Cancer Cell 11,447-460, May 2007)。因此，RACKl很有可能作為新的腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 這將為腫瘤的早期診斷提供了一個(gè)新的途徑。文獻(xiàn)報(bào)道，與正常肝細(xì)胞(Liver)相比，HCC(hepatocellularcarcinoma)中 JNK活性增強(qiáng)，即P-JNK水平升高。并且當(dāng)敲掉JNKl時(shí)，小鼠肝平均腫瘤體積減少，說(shuō)明JNK在肝癌形成中發(fā)揮著促瘤活性(Lijian Hui，Kurt Zatloukal，Harald Scheuch, et al. Proliferation of human HCC cells and chemically induced mouse liver cancers requires JNKl—dependent p21 downregulation. The Journal of Clinical Investigation, Volume 118 Number 12 December2008)。同時(shí)，RACKl 在肝癌病人的表達(dá)
(Katia Bourd-Boittin, He' Ie~ne Le Pabic, Dominique Bonnier, et al. RACKl, a New ADAM12 Interacting Protein. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYV0L. 283, NO. 38, pp. 26000-26009, September 19,2008) 我們前期工作表明
3RACKl與P-JNK有相關(guān)性，并且文獻(xiàn)報(bào)道，PKC調(diào)節(jié)JNK活性依賴于RACKl的WD1-4結(jié)構(gòu)域 (Pablo Lopez-Bergami, Hasem Habelhah, Anindita Bhoumik,et al. Receptor for RACKl Mediates Activation of JNK by Protein Kinase C. Molecular Cell, Vol. 19,309-320， August 5,2005)。同時(shí)，我們通過(guò)酵母雙雜交方式篩出RACKl是MKK7的相互作用蛋白，而 MKK7是JNK的上游激酶。因此，我們提出基于研究RACKl與MKK7相互作用位點(diǎn)為新型肝癌藥物的研發(fā)提供新的靶位。本發(fā)明即基于上面的研究背景，利用生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)相關(guān)理論方法構(gòu)建 RACK1-MKK7相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，通過(guò)距離幾何學(xué)等手段對(duì)RACKl與MKK7相互識(shí)別的結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行了判定，通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)理論模型進(jìn)行了驗(yàn)證，確定了 RACKl與MKK7特異性相互識(shí)別的功能表位；進(jìn)一步將該表位的缺失可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了基于計(jì)算機(jī)同源模擬技術(shù)獲得的RACKl及MKK7空間構(gòu)象，以及通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)獲得的RACKl與MKK7相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。本發(fā)明公開(kāi)了 RACKl與MKK7相互作用的功能表位為RACKl的275-280位氨基酸
位點(diǎn)為 275IlemSer277Thi^8Ser”9Ser2iKILyS。本發(fā)明公開(kāi)了基于RACKl分子抑制腫瘤生長(zhǎng)的新方法，即針對(duì)RACKl的275-280 位氨基酸的突變可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明公開(kāi)了針對(duì)RACKl的275-280位氨基酸的突變抑制腫瘤生長(zhǎng)的具體突變方法:I275A/S276A/T277A/S278A/S279A/K280Ao本發(fā)明還公開(kāi)了人RACKl與MKK7相互作用表位的確定及其應(yīng)用的具體實(shí)施過(guò)程1)RACKl及MKK7相互作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)的模擬及功能靶位的理論預(yù)測(cè)2)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論預(yù)測(cè)的功能表位3基于RACKl功能表位抑制腫瘤生長(zhǎng)借助下述具體實(shí)施例，詳細(xì)地闡述了本發(fā)明實(shí)施過(guò)程。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不僅僅限定于下述實(shí)施例，任何與本發(fā)明的實(shí)施例等同的變體也包括在本發(fā)明中。


圖1、RACK1、MKK7理論空間構(gòu)象。a表示MKK7空間構(gòu)象；b表示RACKl空間構(gòu)象。圖2、RACKl與MKK7相互作用的復(fù)合物空間構(gòu)象。圖3、RACKl及其突變?nèi)ッ庖吖渤恋鞰KK7，RACKl的275-280位氨基酸殘基突變后， RACKl與MKK7相互作用明顯減弱。圖4、RACKl的275-280位氨基酸殘基突變不影響JNK磷酸化水平。圖5、穩(wěn)定表達(dá)RACKl及其突變體的細(xì)胞株的鑒定；1表示P⑶NA3. 1對(duì)照細(xì)胞株， 2表示RACKl野生型表達(dá)細(xì)胞株，3表示RACKl (275-280)Mut突變體表達(dá)細(xì)胞株。圖6、RACKl及其突變體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響(*表示P < 0. 05)。
實(shí)施例一、RACKl、MKK7空間構(gòu)象的模擬以及功能靶位的理論預(yù)測(cè)
1.材料Insightll 2005程序包(MSI分子模擬，San Diego)，該程序包包括Homology 同源模建Discover 力學(xué)優(yōu)化DisC0Ver_3常溫動(dòng)力學(xué)模擬Docking 分子對(duì)接Delphi表觀靜電勢(shì)能分析Ludi分子設(shè)計(jì)程序(1995)；IBM圖形工作站；PDB 2008 數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)絡(luò) www. rcsb. org 下載)；SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù) Q008，網(wǎng)絡(luò)下載)。2.方法與結(jié)果1) RACKl及MKK7空間構(gòu)象模擬基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB提供的RACKl晶體結(jié)構(gòu)(PDB code lmpx)、MKK7晶體結(jié)構(gòu)(PDB code :2dyl)，在CVFF、Amber力場(chǎng)下，依次選擇最陡下降(收斂判據(jù)0. 05kCal/ mol,優(yōu)化步長(zhǎng)10000步)、共軛梯度(收斂判據(jù)0. 02kCal/mol,優(yōu)化步長(zhǎng)20000步)，獲得RACK1、MKK7理論空間構(gòu)象(圖1)。借助主鏈碳原子均方根位移評(píng)判方法，將理論獲得的RACK1、MKK7結(jié)構(gòu)與其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)疊合，計(jì)算獲得的RMSD(Root Mean Square Distance，均方根位移)值為0. 018nm、0. 023nm，提示優(yōu)化獲得的結(jié)構(gòu)是合理的。2)RACKl與MKK7相互作用復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模擬在獲得RACKl及MKK7空間構(gòu)象的基礎(chǔ)上，借助計(jì)算生物學(xué)相關(guān)理論對(duì)其表位結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的分析。在此基礎(chǔ)上，利用分子對(duì)接及動(dòng)力學(xué)模擬，在考慮溶劑效應(yīng)的情況下，設(shè)定原子間作用域?yàn)?A，搭建RACKl與MKK7相互作用的復(fù)合物空間構(gòu)象(圖2)。3、RACKl與MKK7相互作用識(shí)別功能域的理論判定借助分子間氫鍵形成理論、Van der Waals相互作用模式，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、距離幾何學(xué)技術(shù)對(duì)RACKl與MKK7相互作用模式進(jìn)行了理論分析，結(jié)果提示RACKl與 MKK7相互作用的功能表位為RACKl的275-280位氨基酸殘基275IlemSer277Thi^8Ser”9Ser
280τ
Lys0實(shí)施例二、RACKl與ΜΚΚ7相互作用功能表位的生物學(xué)驗(yàn)證1.實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Midi Prep購(gòu)自Promega公司；真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 Lopofectamin2000 03 自 Invitrogen Aprotinin> PMSF VX R Na3VO4 g Sigma
司；SDS-PAGE系統(tǒng)及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購(gòu)自Bio-RAD公司；轉(zhuǎn)引用硝酸纖維素膜Hybond-C購(gòu)自 Amersham公司；辣根酶底物的ECL購(gòu)自GE公司；RACKl抗體購(gòu)自BD Biosicences公司； MKK7抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；抗FLAG標(biāo)簽抗體購(gòu)自Sigma公司；JNK抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔(GAR) 二抗及辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠(GAM) 二抗購(gòu)自中杉金橋公司。免疫共沉淀(Co-IP)裂解緩沖液配方如下Tris-HCKpH 7. 5) 20mM, NaCl 120mM, Glycerol 10%, EDTA ImM, Triton X-100
5ImM0 使用前加入蛋白酶抑制劑PNPP IOmM, PMSF ImM, Na3VO4 ImM, Aprotinin 10yg/ml。2.實(shí)驗(yàn)方法DRACKl及其突變體表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)理論預(yù)測(cè)確定的RACKl與MKK7相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)275IlemSer277Thr278Ser W9Ser28tlLys,將每個(gè)氨基酸殘基突變?yōu)楸彼?Ala)，具體為I275A/S276A/T277A/S278A/ S279A/K280A ；利用常規(guī)的基因工程技術(shù)，將野生型RACKl基因和突變體RACKl (275480) Mut基因克隆到ρ⑶NA3. 1(_)載體上，為便于檢測(cè)，在基因5’端引入FLAG標(biāo)簽。2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后，按照4 X IO5/孔的密度接種于6孔板里；約Μι，細(xì)胞成片率約在70% -80%，用 Lipofectamin 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟遵循說(shuō)明書。用于檢測(cè)RACKl分子中與MKK7相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染時(shí)，每樣品2個(gè)孔，每孔分別轉(zhuǎn)染ι μ g野生型RACKl，或者突變體RACKl (275-280) Mut表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染野生型 GFP-MKK7 lug；用于檢測(cè)RACKl及其突變體與JNK相互作用，轉(zhuǎn)染時(shí)，每樣品2個(gè)孔，每孔分別轉(zhuǎn)染1 μ g野生型RACKl，或者突變體RACKl (275-280)Mut表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染野生型GFP-JNK iyg;3)裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，準(zhǔn)備預(yù)冷的Co-IP緩沖夜，裂解6孔板內(nèi)的細(xì)胞，每個(gè)樣品用400 μ 1 裂解液，使用細(xì)胞刮收取細(xì)胞；裂解、刮取和收取裂解液的過(guò)程均在碎冰上進(jìn)行；裂解液收于1. 5ml微量離心管中，插在冰上放置IOmin后，移至4°C微型冷凍離心機(jī)中，12000rpm離心 15min。4)免疫共沉淀離心后取上清移至另一只干凈微量離心管中，取出5μ 1作為內(nèi)參；其余每管上清依次加入ftOtein A/G beads 20 μ 1，抗FLAG標(biāo)簽抗體(M2) 1 μ 1，4°C孵育過(guò)夜；用Co-IP 緩沖夜洗滌beads，每次1ml，洗滌5min，3000rpm離心30秒，棄上清，重復(fù)3次；洗滌和離心均在4°C進(jìn)行。最后一次洗滌上清吸棄后，加入2X蛋白上樣緩沖液，100°C沸水煮lOmin， 12000rpm離心30秒,取上清進(jìn)行western blot分析。5) Western blot 分析使用濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用15mA/塊膠進(jìn)行恒流電泳，電泳時(shí)間約120min ；電泳后，將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印條件為 60V, ISOmin ；轉(zhuǎn)印完畢的硝酸纖維素膜放于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉池；一抗 40C (MKK7或JNK或M2抗體)孵育過(guò)夜；TBST洗液中洗3次，每次IOmin ；將硝酸纖維素膜孵育相應(yīng)二抗，室溫Ih ；TBST洗液中洗3次，每次lOmin，洗完后滴加辣根酶底物的ECL發(fā)光液，在暗室進(jìn)行顯影分析。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論RACKl與MKK7結(jié)合的能力由免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)RACKl共沉淀下來(lái)的MKK7的量來(lái)衡量，共沉淀下來(lái)的MKK7量越大，RACKl與MKK7則結(jié)合越強(qiáng)。結(jié)果顯示與野生型RACKl相比，突變體RACKl (275-280)Mut共沉淀下來(lái)的MKK7的量明顯減少。提示RACKl的275-280位氨基酸殘基突變后，RACKl與MKK7相互作用明顯減弱；證明RACKl的275-280位氨基酸殘基是其與MKK7相互做用的關(guān)鍵位點(diǎn)(圖3)。RACKl與JNK結(jié)合的能力由免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中RACKl共沉淀下來(lái)的JNK的量來(lái)衡量，共沉淀下來(lái)的JNK量越大，則RACKl與JNK結(jié)合越強(qiáng)；結(jié)果顯示野生型RACK1、突變體 RACKl (275-280)Mut共沉淀下來(lái)的JNK的量沒(méi)有明顯差別。提示RACKl的275-280位氨基酸殘基不參與RACKl與JNK相互作用(圖4)。提示提示RACKl 的 275-280 位氨基酸殘基 275Ile276Ser277Thr278Ser27、er28°LyS 是 RACKl與MKK7相互作用的特異性位點(diǎn)。實(shí)施例三、突變RACKl與MKK7相互作用功能表位抑制腫瘤的生長(zhǎng)1.實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Midi Prep購(gòu)自Promega公司；真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 Lopofectamin2000 購(gòu)自 Invitrogen 公司；G418 購(gòu)自 invitrogen 公司；ScaI 酶及其反應(yīng) buffer均購(gòu)自NEB公司；切膠回收試劑盒購(gòu)自TianGen公司；M2抗體購(gòu)自Sigma公司； P-JNK抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；SDS-PAGE系統(tǒng)及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購(gòu)自Bio-RAD公司；轉(zhuǎn)印用硝酸纖維素膜Hybond-C購(gòu)自Amersham公司；辣根酶底物的ECL購(gòu)自GE公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠(GAM) 二抗購(gòu)自中杉金橋公司。M2裂解緩沖液配方如下Tris-HCl (pH 7. 5) 20mM, NaCl 250mM, EDTA 3mM, EGTA 3mM,0. 5% NP40 ；使用前加入PNPP IOmM, DTT IM，Na3VO4 ImM, Aprotinin 10yg/ml。2.實(shí)驗(yàn)方法1)轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后，按照4X IO5/孔的密度接種于6孔板里；約Mh，細(xì)胞匯合度約在70% -80%, 將PCDNA3. 1空載體以及含野生型RACK1、突變體RACKl (275480)Mut基因的載體分別用 Lipofectamin 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染；每孔轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量為2 μ g，轉(zhuǎn)染步驟遵循說(shuō)明書。2)加壓篩選轉(zhuǎn)染后Mh，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后，按照10個(gè)/孔的密度接種于96孔板里。24h后，加入G418進(jìn)行篩選，濃度為600 μ g/ml，每 3 4天更換含有G418的培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察克隆形成，將形成的單克隆放大培養(yǎng)，用 Western blot方法分析目的基因表達(dá)情況。3) Western blot 分析準(zhǔn)備預(yù)冷的M2緩沖夜，裂解目的克隆細(xì)胞，裂解液收于1. 5mi微量離心管中，冰上放置IOmin后，4°C、12000rpm離心15min ；取上清進(jìn)行^festern blot分析。使用濃度為12% 的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，使用15mA/塊膠進(jìn)行恒流電泳，電泳時(shí)間約120min ；電泳后， 將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印條件為60V，ISOmin ；轉(zhuǎn)印完畢的硝酸纖維素膜放于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉Ih ；—抗4°C孵育過(guò)夜；TBST洗液中洗3次，每次IOmin ；相應(yīng)的二抗室溫孵育Ih ；將二抗孵育過(guò)后的膜取出放入TBST洗液中洗 3次，每次lOmin，洗完后滴加辣根酶底物的ECL發(fā)光液，在暗室進(jìn)行顯影分析。4)荷瘤動(dòng)物觀察腫瘤生長(zhǎng)速度
將利用上述方法獲得的穩(wěn)定表達(dá)野生型RACKl基因、突變體RACKl (275-280)Mut 基因以及表達(dá)POTNA3. 1空載體的單克隆細(xì)胞株放大培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單克隆細(xì)胞株，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1200r/min離心5min，棄上清，并用無(wú)血清培養(yǎng)基洗一次細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞調(diào)成2. 5 X 107/mL。采用皮下注射的方法，把目的細(xì)胞移植在3_4周齡的雄性裸鼠腋下，進(jìn)行荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，每個(gè)移植點(diǎn)的移植量為100 μ L，每只裸鼠注射兩個(gè)點(diǎn)。 觀察裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，每周測(cè)量一次瘤體積。瘤體積大小計(jì)算公式為0. 52X長(zhǎng)徑X短徑2。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論1)穩(wěn)定表達(dá)目的基因的單克隆細(xì)胞株的鑒定借助上述的實(shí)驗(yàn)方法，將目的載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)過(guò)加壓篩選，分別獲得了表達(dá)空載體POTNA3. 1的單克隆細(xì)胞株P(guān)OTNA3. 1-G10、表達(dá)野生型RACKl基因的單克隆細(xì)胞株 RACK1-G3、表達(dá)突變體 RACKl (275-280)Mut 基因的單克隆細(xì)胞株 RACKl (275-280)Mut-G60 與 PCDNA3. 1-G10 細(xì)胞株相比，RACK1-G3、RACKl (275-280) Mut-G6 細(xì)胞株在 36KD 位置處有特異性的目的蛋白條帶表達(dá)。(圖5)2)荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將表達(dá)空載體POTNA3. 1的單克隆細(xì)胞株P(guān)OTNA3. 1-G10、表達(dá)野生型RACKl基因的單克隆細(xì)胞株RACK1-G3、表達(dá)突變體RACKl (275480)Mut基因的單克隆細(xì)胞株 RACKl (275-280)Mut-G6按實(shí)驗(yàn)方法所述，皮下接種裸鼠，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。與接種表達(dá)空載體POTNA3. 1的單克隆細(xì)胞株P(guān)OTNA3. 1-G10形成的瘤體積相比，接種表達(dá)野生型RACKl基因的單克隆細(xì)胞株RACK1-G3后腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快；而接種表達(dá)突變體 RACKl (275480)Mut基因的單克隆細(xì)胞株RACKl (275480)Mut_G6后腫瘤生長(zhǎng)速度顯著減緩，與對(duì)照組PCDNA3. 1-G10相似(圖6)。提示，針對(duì)RACKl的275-280位氨基酸殘基275Il e276Ser277Thr278Ser279Ser280Lys進(jìn)行基因突變，可以顯著減緩RACKl引起的腫瘤生長(zhǎng)。
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權(quán)利要求
1.一個(gè)RACKl分子的功能表位，其特征在于由RACKl分子275Ile27、er277Thr278kr2%er 280Lys 組成。
2.權(quán)利要求1所述功能表位在抑制腫瘤生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
3.針對(duì)權(quán)利要求1所述功能表位進(jìn)行基因突變?cè)谝种颇[瘤生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述基因突變具體為將RACKl分子275IlemSer277Thr2%er27、er28°LyS 氨基酸殘基分別突變?yōu)?275Ala276Ala277Ala278Ala279Ala28°Ala。
全文摘要
本發(fā)明利用生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)相關(guān)理論方法預(yù)測(cè)了RACK1分子與MKK7相互作用的功能表位為RACK1分子的275Ile276Ser277Thr278Ser279Ser280Lys氨基酸殘基，并通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證；進(jìn)一步突變?cè)摴δ鼙砦豢梢詰?yīng)用于抑制腫瘤生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102212108SQ20111007183
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者馮健男, 張紀(jì)巖, 沈倍奮, 王慶陽(yáng), 王晶, 郭媛媛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所