專利名稱：一種分枝桿菌多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分枝桿菌多糖及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖是由許多單糖聚合而成的天然高分子化合物，相對(duì)分子質(zhì)量從幾千到幾百萬不等，是生命有機(jī)體的重要組成部分，自從20世紀(jì)50年末發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有抗腫瘤活性以來，人們對(duì)多糖這類重要生命物質(zhì)有了新的認(rèn)識(shí)，多糖的研究和應(yīng)用已滲入到醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等許多領(lǐng)域，從而使這一學(xué)科成為目前生命科學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域之一。
微生物多糖是細(xì)菌、真菌等微生物在代謝過程中產(chǎn)生的對(duì)微生物有保護(hù)作用的生物高聚物，安全無毒、理化性質(zhì)獨(dú)特。其生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地域等條件限制，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)カ和廣闊的發(fā)展前景。本發(fā)明主要針對(duì)非結(jié)核分枝桿菌，主要為快速生長(zhǎng)的非致病性分枝桿菌，提取其細(xì)胞壁或細(xì)胞莢膜中有活性的多糖成分，經(jīng)檢驗(yàn)，該多糖具有顯著的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。首先，分枝桿菌及其菌體制劑本身即可產(chǎn)生良好的非特異性免疫作用，可用于治療腫瘤和多種免疫性疾病。分枝桿菌種類較多，可分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌三類。自20世紀(jì)20年代用于預(yù)防結(jié)核的卡介苗(BCG，減毒的牛型結(jié)核分枝桿菌)問世以來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)其他非結(jié)核分枝桿菌如草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)、母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)等也可以用于結(jié)核病的免疫治療,而且分枝桿菌具有非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)接受治療的結(jié)核病患者原有的慢性氣管炎、感冒、哮喘、風(fēng)濕性疾病、神經(jīng)性慢性皮炎等疾病也有療效。因此，研究者注意到人體接種分枝桿菌屬細(xì)菌，可產(chǎn)生良好的非特異性免疫，并可提高機(jī)體抗病毒能力，對(duì)ー些慢性常見病具有一定的治療效果。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的分枝桿菌制劑主要有卡介菌制劑、草分枝桿菌制劑、母牛分枝桿菌制齊U、恥垢分枝桿菌制劑等。卡介菌苗是減毒牛型結(jié)核分枝桿菌，滅活的卡介菌苗是臨床上用于預(yù)防結(jié)核病的有效疫苗，也是有力的細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑，用于治療惡性黑色素瘤，或在肺癌、急性白血病、惡性淋巴瘤根治性手術(shù)或化療后作為輔助治療，尤其對(duì)淺表膀胱癌的防治，BCG療效明確，是目前公認(rèn)的首選療法。草分枝桿菌是非結(jié)核分枝桿菌的ー種，基于它同結(jié)核菌的生物親緣關(guān)系，通過特殊的物質(zhì)交換，可持久地介入人體的免疫過程，不斷調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫能力，特別是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的功能，從而表現(xiàn)出殺菌、清除體內(nèi)病原菌、增強(qiáng)抵抗力等免疫效應(yīng)，達(dá)到治療目的。由德國(guó)Sanum-Kehlbeck公司生產(chǎn)的草分枝桿菌注射液(Mycobacteriumphlei F. U. 36 injection),商品名烏體林斯(utilin “s” injection)(參見 Harders, G.，et al. Mitte丄 zur Immumisierung des menscnlichen Korpers bei HIV-Infektionen DE3728367C1 [P], 1988)能顯著增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫功能，臨床藥理實(shí)驗(yàn)證明用藥后機(jī)體免疫性能提高，減少腫瘤復(fù)發(fā)。母牛分枝桿菌也是非結(jié)核分枝桿菌的ー種，母牛分枝桿菌菌苗(Mycobacteriumvaccae vaccine)在結(jié)核病的免疫治療、結(jié)核病感染高危人群(HIV感染者)的預(yù)防性治療、癌癥治療(非小細(xì)胞肺癌、惡性間皮瘤、前列腺癌)、哮喘及過敏性皮炎的治療等方面均有應(yīng)用。安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的注射用母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae forinjection),商品名為微卡(Vaccae)(參見李偉，陶立峰.凍干母牛分枝桿菌制劑(微卡)及其制備方法和用途中國(guó)，CN1332018C[P]. 2007-08-15)具有明顯的雙向免疫調(diào)節(jié)功能。目前主要用于對(duì)結(jié)核病的免疫輔助治療，并在腫瘤、こ肝、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、感冒、皮膚病、哮喘等疾病的治療上均具有潛在的臨床價(jià)值。 王國(guó)治等研究的恥垢分枝桿菌制劑由恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)(參見王國(guó)治，徐苗，陳保文等.恥垢分枝桿菌制劑及其應(yīng)用中國(guó)，CN1318573C[P], 2007-05-30)經(jīng)破碎裂解制備而成，是ー種安全、有效的免疫調(diào)節(jié)劑，具有雙向免疫調(diào)劑作用，對(duì)結(jié)核病、肝炎如こ肝以及哮喘等疾病有潛在的預(yù)防或/和治療效果。長(zhǎng)春長(zhǎng)生基因藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的無細(xì)胞恥垢分枝桿菌制劑已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床研究。但是，分枝桿菌全菌制劑抗原性強(qiáng)，不良反應(yīng)較多，治病的機(jī)制，至今尚有爭(zhēng)議，國(guó)際上尚無確切的定論。近年來研究表明，從分枝桿菌提純得到的多糖類物質(zhì)，具有特殊的理化和生物學(xué)性質(zhì)，在臨床和科研上已開始得到應(yīng)用，在免疫調(diào)節(jié)方面具有特殊藥效，逐步引起人們的重視。分枝桿菌多糖克服了分枝桿菌全菌制劑的抗原性，是分枝桿菌有效成分的活性提取物，成分明確，安全無毒，無副作用。一般認(rèn)為分枝桿菌的細(xì)胞通常含有四種多糖，S卩阿拉伯半乳聚糖(AG)、阿拉伯甘露聚糖(AM)、甘露聚糖以及糖原樣葡聚糖。有研究表明，阿拉伯半乳聚糖主要分布在細(xì)胞壁，阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖、糖原樣葡聚糖分布在英膜樣外膜中，阿拉伯甘露聚糖和甘露聚糖是主要的抗原性多糖。很多研究者已證實(shí)用熱水從分枝桿菌細(xì)胞提取的多糖具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性(例如參見 Maes E, Coddeville B, Kremer L, et al. Polysaccharidestructural variability in mycobacteria identmcation and characterizationof phosphorylated mannan and arabinomannan[J]. Glycoconj J，2007，24 :439-448.)。Tian等用沸水提取母牛分枝桿菌(M. vaccae)完整細(xì)胞，認(rèn)為3. 6KDa的多糖是抗腫瘤蛋白-多糖復(fù)合物的主要糖部分，NMR顯示該糖是由α位連接的O-甲基化甘露糖組成的同聚糖(參見 Tian XX，Li AF, Farrugia IS, et al. Isolation and identification ofpoly-α - (I 一 4)-linked 3-0-methyl-D-mannopyranose irom a hot-water extract oiMycobacterium vaccae [J]. Carbohydrate Research，2000，324 :38-44.) DDinadayala 等從BCG Tice次代菌株中用沸水法提取到一種抗腫瘤多糖為6-a-葡聚糖(參見DinadayalaP，Lemassu A,branovski P，et al. Revisiting tne structure of the antι-neoplasticglucans of Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin[J]. Thejournal ofbiological chemistry，2004，279 (13) : 12369-12378.)。阿拉伯甘露聚糖也能刺激和激活免疫細(xì)胞，可用作疫苗以抵抗分枝桿菌的感染，也可作為免疫治療劑用于癌癥治療(例如參見 WittKowski M，Mittelstadt J，Brandau S，et al. Capsular arabinomannansirom Mycobacterium avium with morphotype-specific structural differencesbut identical biological activity[J]· Thejournal ofbiological chemistry，2007，282(26) :19103-19112.)首都醫(yī)科大學(xué)的陳仁等選用草分枝桿菌，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、去蛋白、除核酸、脫脂肪等處理和柱層析純化，提取制備了分枝桿菌多糖(Mycobacterial polysaccharides,MPS),研究表明MPS有顯著的抗腫瘤活性。在臨床上可適用于化療患者的白細(xì)胞回升、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性こ型肝炎、反復(fù)呼吸道感染、哮喘以及其他伴有免疫功能降低或因免疫功能低下而引起的多種疾病的治療(參見陳仁，郭建強(qiáng)，潘燕春等.一種分枝桿菌多糖復(fù)合物及其制備方法:中國(guó)，CN100358535C[P], 2008-01-02.)。本發(fā)明的任務(wù)是從非結(jié)核分枝桿菌中提取分枝桿菌多糖，得到具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性多糖，本發(fā)明提供了ー種具有創(chuàng)新性的分離純化方法，使其具有エ藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、成本低廉的特點(diǎn)。與上述專利方法不同的是，本發(fā)明側(cè)重于ー類快速生長(zhǎng)的非致病性分枝桿菌，也屬于非結(jié)核分枝桿菌，并著重提取其細(xì)胞壁或細(xì)胞莢膜中有活性的多糖成分，成分和結(jié)構(gòu) 明確，純度高，并具有明顯的抗腫瘤作用。同時(shí)本發(fā)明采用新穎的水提與堿提相結(jié)合的方法，既得到雜多糖的復(fù)合物，又得到単一的勻多糖，多糖成分明確，結(jié)合蛋白少。得到水提多糖為含4 6種雜多糖成分的多糖復(fù)合物，多糖純度可達(dá)到90%以上；堿提多糖是ー種勻多糖，為單ー的甘露聚糖，純度可達(dá)到95%以上，這種制備エ藝，提高了分枝桿菌的利用率，提高了多糖的收率，使分枝桿菌多糖的生產(chǎn)成本降低，無副作用，將其開發(fā)成免疫調(diào)節(jié)類藥物，將會(huì)有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述需要，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤作用的分枝桿菌多糖及其制備方法和用途，所制得的分枝桿菌多糖具有較高的抗腫瘤活性，純度高，且制備方法簡(jiǎn)單易行，成本較低廉。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下ー種具有抗腫瘤活性的分枝桿菌多糖，為雜多糖復(fù)合物或勻多糖，重均分子量為I萬 10萬道爾頓,單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，上述的分枝桿菌是非結(jié)核分枝桿菌，可以是草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、母牛分枝桿菌、胃分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌中的ー種，優(yōu)選草分枝桿菌和恥垢分枝桿菌。在本發(fā)明中，分枝桿菌多糖含O 10%的結(jié)合蛋白質(zhì)。所述具有抗腫瘤活性的分枝桿菌多糖由下法制得A.將含有分枝桿菌的傳代培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)至生長(zhǎng)成淡黃色菌膜；B.水提多糖制備收集菌膜，依次脫脂，采用超聲輔助沸水提取，離心，提取液采用Sevag法除蛋白，濃縮，こ醇沉淀得到粗多糖；C.堿提多糖制備將上述水提殘?jiān)捎孟A在低溫下提取，離心得提取液，將提取液中和，提取液采用Sevag法除蛋白，濃縮，こ醇沉淀得到粗多糖；D.多糖精制上述粗多糖分別經(jīng)離子交換柱精制，透析，濃縮，冷凍干燥得到兩種分枝桿菌多糖。在本發(fā)明中，水提多糖是ー種雜多糖的復(fù)合物，重均分子量為I萬 10萬道爾頓，單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等；堿提多糖是均一的甘露聚糖，重均分子量為I萬 10萬道爾頓，單糖組成為甘露糖；在本發(fā)明中，分枝桿菌的傳代培養(yǎng)物接種于液體蘇通培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)15 25天，收集液體表面的菌膜為淡黃色、多皺狀，培養(yǎng)過程中保持分枝桿菌傳代數(shù)小于等于五代。在本發(fā)明中，采用有機(jī)溶劑于70°C回流脫脂，有機(jī)溶劑為丙酮、石油醚等。在本發(fā)明中，采用超聲提取時(shí)間為40 60分鐘，固液比為I : 100 I : 200，提取次數(shù)為I 2次。
在本發(fā)明中，加入菌體量8 10倍的水，沸水提取2次，提取時(shí)間為4 8h，濃縮相當(dāng)于菌體干重的2倍體積，得濃縮液。在本發(fā)明中，所用的堿提多糖提取采用堿為NaOH、KOH、NaHC03、KHCO3> K2CO3，堿液濃度為O. I 2mol ·じ1NaOH，提取溫度為4 10°C。在本發(fā)明中，采用Sevag法除蛋白的具體方法是Sevag試劑中氯仿正丁醇=5 : I。Sevag試劑與多糖樣品的體積比為I : 5,振搖萃取時(shí)間為20 30min,萃取次數(shù)為4 8次。在本發(fā)明中，所述濃縮液經(jīng)こ醇沉淀分離得到粗多糖的方法是向濃縮液加入こ醇，使溶液こ醇濃度達(dá)80%以上，分離沉淀，得粗多糖。在本發(fā)明中，所用離子交換柱為DEAE纖維素柱或DEAE瓊脂糖柱，洗脫液為蒸餾水和O. I Imol ·じ1的NaCl溶液,分步收集,用苯酹-濃硫酸法檢測(cè)。分枝桿菌多糖含量測(cè)定采用苯酚-濃硫酸法。(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取葡萄糖對(duì)照品lOOmg，置于IOOml容量瓶?jī)?nèi).加入蒸餾水溶解并定容至刻度。用移液管精密吸取O. 25,0. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5ml溶液分別置于具塞刻度試管中，蒸懼水補(bǔ)充至5ml,加入5%的苯酹溶液I. Oml,再用酸式滴定管滴加濃硫酸5. 0ml，振搖5min，沸水水浴加熱15min，取出，冷水冷卻30min。以空白為參比，用紫外可見光分光光度計(jì)在波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度。以糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)分枝桿菌多糖的含量測(cè)定精密稱取多糖O. 05g,加入90ml蒸餾水，加熱使溶解，移入IOOml容量瓶?jī)?nèi)，蒸餾水定容至刻度。再精密吸取溶液2. Oml置于具塞刻度試管中，定容到5ml,加入5%苯酹溶液I. Oml,濃硫酸5. Oml,振搖5min,沸水水浴加熱15min,取出，冷水冷卻30min，以空白為參比，在紫外可見波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出多糖的含量。每份樣品平行測(cè)定3次。分枝桿菌多糖純度測(cè)定采用液相色譜法。色譜條件反相C-18色譜柱(250mm X 4. 6mm, 5 μ m),流動(dòng)相為O. I %三氟こ酸こ腈(9 :1)，流速I. OmL · mirT1，柱溫35°C，進(jìn)樣量20 μ I，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光檢測(cè)器。測(cè)定方法將樣品稀釋后注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。分枝桿菌多糖重均分子量測(cè)定采用HPGPC法。色譜條件TSK-GEL3000SW色譜柱(7. 8X 300mm)，流動(dòng)相為水，流速 L OmL .mirT1,柱溫35°C，進(jìn)樣量20 μ 1，標(biāo)樣為已知分子量的葡聚糖(分子量分別為600，7100，21400，41100,84400,133800，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光檢測(cè)器。測(cè)定方法將樣品與已知分子量的標(biāo)樣葡聚糖，分別溶解制成每IOmg ι Γ1的溶液注入液相色譜儀，由GPC軟件計(jì)算該樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。分枝桿菌多糖的單糖組分測(cè)定采用氣相色譜法。(I)單糖衍生物的制備準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品10. Omg于試管中，加入鹽酸羥胺IOmg和內(nèi)標(biāo)8mg，加入吡啶O. 5ml，振蕩混勻，放入90°C水浴中加熱反應(yīng)30min。取出后冷卻至室溫，加入O. 5ml醋酸酐，在90°C下繼續(xù)反應(yīng)30min進(jìn)行こ酰化，70°C水浴中將反應(yīng)產(chǎn)物吹干，加入Iml氯仿重新溶解，去O. 5 μ I進(jìn)行GC分析。
(2)多糖樣品的水解和衍生化水解精密稱取分枝桿菌多糖樣品10. Omg溶解到4mol ·じ1三氟こ酸溶液中，配成10. 0g·じ1的多糖水解溶液，轉(zhuǎn)移此溶液到安瓿中封ロ，置于105°C烘箱中加熱水解。取出，70°C水浴中吹干。衍生化將上述水解后的分枝桿菌多糖按照上述單糖衍生化的方法，依次加入各種試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)，取O. 5 μ I經(jīng)過氯仿重新溶解的衍生化產(chǎn)物進(jìn)行GC分析。(3)氣相色譜的條件為分離柱采用HP-5MS(30mX0. 25mm，0. 25μπι)，氫氣流速16mL · mirT1,空氣流速15OmL · mirT1,氮?dú)饬魉?OmL · mirT1,進(jìn)ロ溫度230 °C,檢測(cè)器溫度230 V，柱采用程序升溫，起始溫度130で，以5 °C · mirT1升至180 V，保持2min，再以5°C ^mirT1升至220°C，保持3min。對(duì)照樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置判斷多糖組成。本發(fā)明利用生物技木，從ー類快速生長(zhǎng)的非結(jié)核分枝桿菌菌種培養(yǎng)得到的菌體中提取分離具有明顯抗腫瘤活性和免疫機(jī)能的分枝桿菌多糖，采用新穎的水提與堿提相結(jié)合的方法，既得到雜多糖的復(fù)合物，又得到單ー的勻多糖，多糖成分明確，結(jié)合蛋白少。得到水提多糖為含4 6種雜多糖成分的多糖復(fù)合物，多糖純度可達(dá)到90%以上；堿提多糖是一種勻多糖，為單ー的甘露聚糖，純度可達(dá)到95%以上，并制定了嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所用方法簡(jiǎn)單易行，提高了分枝桿菌的利用率，提高了多糖的收率，使分枝桿菌多糖的生產(chǎn)成本降低，成本較低廉，所得分枝桿菌多糖具有較高的抗腫瘤活性，可用于制備提高免疫機(jī)能和抗腫瘤的藥物或保健品。對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明分枝桿菌多糖可以能顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增埴，甚至超過卡介菌多糖核酸的效果。對(duì)植入Sarcoma 180腫瘤的小鼠進(jìn)行體內(nèi)腹腔注射實(shí)驗(yàn)的生物活性結(jié)果表明，本發(fā)明分枝桿菌多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。分枝桿菌多糖的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)肉瘤細(xì)胞S180、肝癌細(xì)胞SMMC-7721、胃癌細(xì)胞SGC-7901、肺癌細(xì)胞A549等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。


圖I為草分枝桿菌水提多糖液相色譜示意圖說明水提多糖為含有4 6種多糖的復(fù)合物，圖為E101013批水提多糖液相色譜圖。色譜條件反相C-18色譜柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流動(dòng)相為O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱溫35°C，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測(cè)器為SEDEX75蒸發(fā)光檢測(cè)器。
圖2為草分枝桿菌堿提多糖液相色譜示意圖說明堿提多糖含主要為甘露聚糖，圖為E101013批堿提多糖液相色譜圖。色譜條件反相C-18色譜柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流動(dòng)相為O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱溫35°C，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測(cè)器為SEDEX75蒸發(fā)光檢測(cè)器。圖3為恥垢分枝桿菌水提多糖液相色譜示意圖說明水提多糖為含有4 6種多糖的復(fù)合物，圖為Ε101020批水提多糖液相色譜圖。色譜條件反相C-18色譜柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流動(dòng)相為O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱溫35°C，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測(cè)器為SEDEX75蒸發(fā)光檢測(cè)器。圖4為恥垢分枝桿菌堿提多糖液相色譜示意圖說明水提多糖主要為甘露聚糖，圖為Ε101020批堿提多糖液相色譜圖。色譜條件反相C-18色譜柱(250_X4. 6mm, 5 μ m),流動(dòng)相為O. 1%三氟こ酸乙腈(9 I)，流速I. OmL .mirT1,柱溫35°C，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測(cè)器為SEDEX75蒸發(fā)光檢測(cè)器。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體的實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)ー步說明實(shí)施例I采用ISP-2斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)草分枝桿菌，培養(yǎng)過程中保持分枝桿菌傳代數(shù)小于等于五代。米用液體蘇通培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，在37°C培養(yǎng)15 20天,培養(yǎng)基表面長(zhǎng)成淡黃色、多皺狀菌膜，過濾收集菌體。培養(yǎng)過程中，注意監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物未染菌，無異常，采用生物顯微鏡抽樣檢查。上述培養(yǎng)物加入菌體量十倍的丙酮，于70°C用回流脫脂兩次，毎次4小吋，然后過濾收集菌體，自然揮干，加入菌體量150倍的蒸餾水，超聲提取兩次，毎次40分鐘，再煮沸提取兩次，毎次4小吋，離心收集提取液，濃縮至初始菌體量的2倍，為水提濃縮液。將上述水提殘?jiān)尤胂A，至終濃度為O. 5mol ·じ1NaOH，4°C攪拌過夜，離心收集上清，棄殘?jiān)谏锨寮酉∷嶂泻椭罰H6 8，透析，濃縮至初始菌體量的2倍，為堿提濃縮液。將上述濃縮液分別采用Sevag法除蛋白，Sevag試劑中氯仿正丁醇=5 I, Sevag試劑與濃縮液體積比為I : 5,振搖萃取時(shí)間為20min,萃取6次。向濃縮液加入こ醇，使溶液こ醇濃度達(dá)80%，離心分離沉淀，用蒸餾水溶解，得粗多糖溶液。將粗多糖溶液透析后，上DEAE纖維素柱，分別用蒸餾水和O. 25mol ·じ1、Imol ·じ1的NaCl溶液洗脫，分步收集，采用苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測(cè)，從洗脫曲線上看到三個(gè)峰，第ー個(gè)峰含量高，為目的產(chǎn)物，將其收集、透析，濃縮，冷凍干燥，分別得到水提多糖和堿提多糖。采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖的含量，用帶有蒸發(fā)光或示差檢測(cè)器的液相色譜測(cè)定其純度，用HPGPC法測(cè)定重均分子量(Mw)，用氣相色譜法測(cè)定其單糖組成。經(jīng)過多批次提取多糖試驗(yàn)證明，多糖質(zhì)量穩(wěn)定，收率理想，純度高，結(jié)果見附表I。附表I三批草分枝桿菌多糖的質(zhì)量情況
實(shí)施例2采用羅氏雞蛋培養(yǎng)基培養(yǎng)恥垢分枝桿菌，培養(yǎng)過程中保持分枝桿菌傳代數(shù)小于等于五代。采用馬鈴薯培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，在37°C培養(yǎng)20 25天，培養(yǎng)基表面長(zhǎng)成淡黃色、多皺狀菌膜，過濾收集菌體。培養(yǎng)過程中，注意監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物未染菌，無異常，采用生物顯微鏡抽樣檢查。上述培養(yǎng)物加入菌體量十倍的丙酮，于70°C用回流脫脂兩次，毎次4小吋，然后過濾收集菌體，自然揮干，加入菌體量150倍的蒸餾水，超聲提取兩次，毎次40分鐘，再煮沸提取兩次，毎次4小吋，離心收集提取液，濃縮至初始菌體量的2倍，為水提濃縮液。將上述水提殘?jiān)尤胂A，至終濃度為O. 5mol ·じ1NaOH，4°C攪拌過夜，離心收集上清，棄殘?jiān)?，于上清加稀酸中和至PH6 8，濃縮至初始菌體量的2倍，為堿提濃縮液。將上述濃縮液分別采用Sevag法除蛋白，Sevag試劑中氯仿正丁醇=5 I,Sevag試劑與濃縮液體積比為I : 5,振搖萃取時(shí)間為20min,萃取6次。向濃縮液加入こ醇，使溶液こ醇濃度達(dá)80%，離心分離沉淀，用蒸餾水溶解，得粗多糖溶液。將粗多糖溶液透析后，上DEAE纖維素柱，分別用蒸餾水和O. 25mol ·じ1、Imol ·じ1的NaCl溶液洗脫，分步收集，采用苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測(cè)，從洗脫曲線上看到三個(gè)峰，第ー個(gè)峰含量高，為目的產(chǎn)物，將其收集、透析，濃縮，冷凍干燥，分別得到水提和堿提分枝桿菌多糖。采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖的含量，用帶有蒸發(fā)光或示差檢測(cè)器的液相色譜測(cè)定其純度，用HPGPC法測(cè)定重均分子量(Mw)，用氣相色譜法測(cè)定其單糖組成。經(jīng)過多批次提取多糖試驗(yàn)證明，多糖質(zhì)量穩(wěn)定，收率理想，純度高，結(jié)果見附表2。附表2三批恥垢分枝桿菌多糖的質(zhì)量情況
權(quán)利要求
1.ー種具有抗腫瘤活性的分枝桿菌多糖，為雜多糖復(fù)合物或勻多糖，重均分子量為I萬 10萬道爾頓，單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分枝桿菌多糖，其又ー個(gè)特征在于含O 10%的結(jié)合蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分枝桿菌多糖，其特征在于所述分枝桿菌是非結(jié)核分枝桿菌，可以是草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、母牛分枝桿菌、胃分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌中的ー種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分枝桿菌多糖，其特征在于所述分枝桿菌優(yōu)選草分枝桿菌和恥垢分枝桿菌。
5.一種如權(quán)利要求I所述的分枝桿菌多糖的制備方法，主要包括如下步驟 A.將含有分枝桿菌的傳代培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)至生長(zhǎng)成淡黃色菌膜； B.水提多糖制備收集菌膜，依次脫脂，采用超聲輔助沸水提取，離心，提取液采用Sevag法除蛋白，濃縮，こ醇沉淀得到粗多糖； C.堿提多糖制備將上述水提殘?jiān)捎孟A在低溫下提取，離心得提取液，將提取液中和，提取液采用Sevag法除蛋白，濃縮，こ醇沉淀得到粗多糖； D.多糖精制上述粗多糖分別經(jīng)離子交換柱精制，透析，濃縮，冷凍干燥得到兩種分枝桿囷多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分枝桿菌多糖的制備方法，其特征在于水提多糖是ー種雜多糖的復(fù)合物，重均分子量為I萬 10萬道爾頓，單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分枝桿菌多糖的制備方法，其特征在于堿提多糖是均一的甘露聚糖，重均分子量為I萬 10萬道爾頓，單糖組成為甘露糖。
8.權(quán)利要求1-4所述的分枝桿菌多糖在制備用于抗腫瘤和提高免疫機(jī)能的藥物及保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分枝桿菌多糖。其制法是，將分枝桿菌培養(yǎng)15～25天，收集菌膜，依次脫脂，采用超聲輔助沸水提取，離心；殘?jiān)捎孟A提取，中和；提取液除蛋白，乙醇沉淀得到粗多糖，最后經(jīng)過離子交換柱，透析，濃縮，冷凍干燥得分枝桿菌多糖，得到產(chǎn)品為雜多糖復(fù)合物或勻多糖，重均分子量為1萬-10萬，單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等，總收率可達(dá)20～30mg/L培養(yǎng)液，多糖成品純度高，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。所得分枝桿菌多糖具有較高的抗腫瘤活性，可用于制備提高免疫機(jī)能和抗腫瘤的藥物或保健品。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102690445SQ20111006753
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者周莉婷, 徐川, 徐明波, 趙晶晶 申請(qǐng)人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司, 北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司