專利名稱：快速起效且在酸性條件下穩(wěn)定的胰島素類似物及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人胰島素類似物，具體地講，涉及一種能快速起效且在酸性條件下穩(wěn)定的胰島素類似物，以及包含該胰島素類似物的藥物組合物和藥物制劑。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病。近年來，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增長。而在中國，隨著人民生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加速，糖尿病的患病率呈快速上升趨勢(shì)，在2010年中國糖尿病患者總數(shù)已突破9000萬人，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個(gè)嚴(yán)重危害人民健康的重要慢性非傳染性疾病。糖尿病的急、慢性并發(fā)癥，尤其是慢性病并發(fā)癥累及多個(gè)器官，致殘、致死率高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。胰島素治療一直被當(dāng)作是治療糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。正常人體的生理胰島素分泌由餐時(shí)刺激相和基礎(chǔ)平穩(wěn)相組成，即人們進(jìn)餐后外周血糖增高，刺激胰臟中貯存和新生的胰島素釋放，而平時(shí)為了維持機(jī)體的正常血糖水平，胰腺分泌少量基礎(chǔ)胰島素。因此，為了使糖尿病患者的餐時(shí)和基礎(chǔ)血糖都得到良好控制，患者需要在每日餐前注射速效胰島素(每日三次)，并在每日早晨和睡前各注射一次中或長效胰島素。這樣， 糖尿病患者必須承受每天4-5次的注射次數(shù)。為此，人們開發(fā)了在同一制劑中即有起速效作用的可溶胰島素又有起延緩作用的結(jié)晶胰島素(胰島素-魚精蛋白結(jié)晶)的預(yù)混胰島素制劑(參見《百明頓制藥科學(xué)》(Remington，s Pharmaceutical Sciences)，第17版，第 973-977頁，1985年)。但是，這些預(yù)混胰島素制劑仍然存在以下問題1.制劑中含有外源蛋白一魚精蛋白，易產(chǎn)生免疫反應(yīng)；2.藥效在注射后持續(xù)時(shí)間不足M小時(shí)，患者仍需每日注射兩次；3.藥效仍存在峰值，每天兩次藥效峰疊加，易造成午餐前和睡前低血糖；4.現(xiàn)有預(yù)混胰島素制劑均為混懸液，如果患者注射前混合不均勻，易造成藥液中可溶相和結(jié)晶相比例的持續(xù)差異，影響血糖控制。目前，市場上還有一種長效胰島素類似物一甘精胰島素，其由于能夠模擬生理基礎(chǔ)胰島素分泌，平穩(wěn)無峰，在血糖輕易控制達(dá)標(biāo)的同時(shí)，幾乎沒有低血糖風(fēng)險(xiǎn)，且持續(xù)時(shí)間為M小時(shí)左右，符合人類生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和醫(yī)生所青睞。但是，甘精胰島素在臨床應(yīng)用時(shí)也存在一些問題1.起效慢(起效時(shí)間約為1.5小時(shí))，對(duì)餐時(shí)血糖過高的患者，或偶爾進(jìn)餐較多的患者無法有效降低其餐后血糖；2.不能與其他胰島素混合使用，這是由于各種胰島素的等電點(diǎn)不同，甘精胰島素在酸性條件下穩(wěn)定，而天然胰島素及現(xiàn)有速效胰島素類似物在中性條件下穩(wěn)定，如果將甘精胰島素與其他胰島素直接混合，會(huì)導(dǎo)致甘精胰島素在注射前發(fā)生沉淀而不能施用，而其他胰島素在混合后也由于受混合物酸堿度變化的影響，穩(wěn)定性降低，安全性也隨即降低。因此，在甘精胰島素的包裝說明書上，生產(chǎn)商特別注明不要將甘精胰島素與其他任何類型的胰島素混合。在中國專利申請(qǐng)200780019450. 3中，提出通過添加特定的酸性穩(wěn)定劑和螯合劑， 將常規(guī)人胰島素制劑VIAjectTM在低pH的條件下與甘精胰島素混合，以實(shí)現(xiàn)共同使用人胰島素與甘精胰島素。但是，該方法一方面需要在制劑中額外添加有機(jī)酸、螯合劑等輔料；另一方面，在低PH的條件下，胰島素A鏈21位的Asn非常容易脫氨降解(參見《胰島素的穩(wěn)定性》(Stability of insulin), Jens Brange，1994年)，使得產(chǎn)品極不穩(wěn)定，而該專利申請(qǐng)并未對(duì)低PH條件下人胰島素的穩(wěn)定性、以及聯(lián)合制劑的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)研究，產(chǎn)品的安全性數(shù)據(jù)不全。此外，該專利申請(qǐng)也沒有從胰島素的分子結(jié)構(gòu)方面解決產(chǎn)品穩(wěn)定性和保持產(chǎn)品臨床特性的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有上述胰島素預(yù)混制劑所存在的問題，提供一種在酸性條件下穩(wěn)定且快速起效的胰島素類似物或其可藥用鹽，使其能夠與甘精胰島素等長效胰島素類似物混合，制成澄清制劑，該制劑在使用前無需混勻即可注射使用，同時(shí)具有速效降糖和平穩(wěn)長效降糖兩種功能，每天只需注射一次，即可模擬生理胰島素的分泌模式，在血糖安全達(dá)標(biāo)的同時(shí)可更大程度減少低血糖風(fēng)險(xiǎn)，并且不含外源蛋白和額外的輔料，安全性更高。在低pH的條件下，胰島素A鏈A21位的Asn (天冬酰胺)非常容易發(fā)生脫氨降解反應(yīng)，使得胰島素分子在酸性條件下極不穩(wěn)定。本發(fā)明人通過大量研究發(fā)現(xiàn)，將胰島素A鏈 A21位的Asn替換為Gly (甘氨酸)，所得到的全新序列的胰島素類似物在酸性pH值時(shí)具有出人意料的穩(wěn)定性，并且在酸性和中性PH值時(shí)都具有較高的溶解度，從而解決了上述問題。因此，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種胰島素類似物或其可藥用鹽，其在酸性條件下穩(wěn)定且能快速起效，所述胰島素類似物為至少將其A鏈A21位的天冬酰胺(Asn) 突變?yōu)楦拾彼?Gly)的人胰島素，其中人胰島素的結(jié)構(gòu)如圖1所示，人胰島素A鏈序列為 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，人胰島素B鏈序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述胰島素類似物為僅在A21位上的Asn被Gly取代的人胰島素，即 GlyA21人胰島素，其A鏈序列為SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，B鏈序列為SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述胰島素類似物為A21位上的Asn被Gly取代，B28位上的Pro被Lys 取代，并且B^位上的Lys被Pro取代的人胰島素，即GlyA21-LySB28-Pr0B29人胰島素，其A鏈序列為SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列，B鏈序列為SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述胰島素類似物為A21位上的Asn被Gly取代，B28位上的Pro被Asp 取代的人胰島素，即GlyA21-AspM人胰島素，其A鏈序列為SEQ ID N0 :7所示的氨基酸序列， B鏈序列為SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。本發(fā)明還包括上述胰島素類似物的可藥用鹽，所述可藥用鹽包括但不限定于鋅鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽。本發(fā)明胰島素類似物或其可藥用鹽可以采用任何一種公認(rèn)的肽合成技術(shù)制備，例如溶液法、固相合成法(J. Mewart等，《固相肽合成》，F(xiàn)reeman and Co.，San Francisco, 1969)、半合成法、基因工程法、DNA重組法等。上述結(jié)構(gòu)優(yōu)化過的胰島素類似物或其可藥用鹽從分子結(jié)構(gòu)上消除了胰島素在酸性條件下不穩(wěn)定的因素，使得本發(fā)明胰島素分子在酸性條件下不易發(fā)生脫氨基反應(yīng)，具有非常高的穩(wěn)定性。因此該胰島素類似物或其可藥用鹽可以與長效胰島素類似物例如甘精胰島素一起組成藥物組合物，或制成澄清的酸性預(yù)混胰島素制劑。因此，本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明胰島素類似物或其可藥用鹽，以及長效胰島素類似物或其可藥用鹽，其中所述本發(fā)明胰島素類似物為至少在其A 鏈A21位突變?yōu)楦拾彼?Gly)的人胰島素。優(yōu)選地，所述本發(fā)明胰島素類似物選自GlyA21人胰島素、GlyA21-LysB28-proB29人胰島素或GlyA21-AspB28人胰島素，所述長效胰島素類似物選自甘精胰島素。優(yōu)選地，在上述藥物組合物中，本發(fā)明胰島素類似物和長效胰島素類似物的含量百分比為30 70-70 30，更優(yōu)選為50 50。本發(fā)明另一方面提供一種包含上述藥物組合物的胰島素藥物制劑，優(yōu)選地，該藥物制劑的PH為3. 5-4. 5，更優(yōu)選為3. 8-4. 2。上述藥物制劑還可進(jìn)一步包含一種或多種可藥用輔料，例如等滲劑、緩沖劑、增溶劑、防腐劑等。其中等滲劑包括但不限于甘油、氯化鈉等；緩沖劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液等；增溶劑包括但不限于生理可接受酸如鹽酸、乙酸、檸檬酸等；防腐劑包括但不限于苯酚、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯等。上述藥物制劑為澄清液體制劑，其可通過注射、口服、口腔、舌下、陰道、直腸或鼻腔施用的方式來施用。優(yōu)選的，該藥物制劑是通過注射來施用的。在施用時(shí)，患者可以根據(jù)自身生活習(xí)慣選擇在每日主餐前或主餐后注射一次。在本發(fā)明酸性預(yù)混胰島素制劑中，兩種胰島素類似物都有很好的溶解度，并且物理化學(xué)穩(wěn)定性不變、臨床作用特點(diǎn)也不變。在皮下注射后，長效胰島素可在皮下注射后形成微小沉淀起長效作用，而本發(fā)明速效胰島素類似物在體內(nèi)中性PH下仍可保持較高的溶解度而發(fā)揮速效作用。本發(fā)明預(yù)混胰島素制劑具有以下優(yōu)點(diǎn)1.制劑澄清，因而在使用前無需混勻即可抽取準(zhǔn)確劑量注射；2.臨床作用時(shí)間上兼有現(xiàn)有速效胰島素起效快、長效胰島素平穩(wěn)降糖的優(yōu)點(diǎn)；3.患者可以根據(jù)自身生活習(xí)慣選擇在每日主餐前或主餐后注射一次，即可模擬生理胰島素的分泌模式；4.既能解決每日主餐后高血糖，又不易在其他時(shí)間特別是夜間出現(xiàn)低血糖，使血糖維持在一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，在使血糖安全達(dá)標(biāo)的同時(shí)最大程度減少低血糖風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)糖尿病患者的微血管，防止或延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，進(jìn)一步提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。本發(fā)明胰島素類似物在動(dòng)物體內(nèi)未見明顯毒性反應(yīng)。藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，本發(fā)明預(yù)混胰島素制劑在注射后10分鐘開始起效，1-8小時(shí)內(nèi)一直有平穩(wěn)的降糖作用，12小時(shí)時(shí)作用仍明顯，能滿足臨床糖尿病患者要求注射次數(shù)少、起效快、持續(xù)時(shí)間長、降糖平穩(wěn)、低血糖發(fā)生率低的需求。


圖1 人胰島素的結(jié)構(gòu)。圖2 重組甘賴脯胰島素各時(shí)點(diǎn)電泳表達(dá)檢測(cè)圖譜。圖3 重組甘賴脯胰島素RP-HPLC檢測(cè)圖譜。圖4:重組甘賴脯胰島素與甘精胰島素以50 50的百分比預(yù)混后的高效液相色譜的保留時(shí)間測(cè)定圖譜。
圖5 不同胰島素對(duì)四氧嘧啶高血糖大鼠作用的降糖百分率(％ )。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明胰島素類似物的制備和確認(rèn)材料菌株克隆菌coli (DH5a)是基因工程常用工具菌種，表達(dá)菌種hcherichia coli (3110)購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。酶和試劑分子克隆工具酶和試劑購于北京經(jīng)科宏達(dá)公司。質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR純化試劑盒購于北京天根公司(TianGen)。定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Fast Mutagenesis System)購于全式金公司CTransGene)。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基、氨芐抗性LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基為基因工程領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的配方可參見分子克隆第三版下冊(cè)附錄2。方法質(zhì)粒提取擴(kuò)增、聚合酶鏈反應(yīng)、PCR產(chǎn)物純化、質(zhì)?；厥?、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 這些在基因工程研究領(lǐng)域都是常規(guī)操作方法，可參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh EF, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboiatory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Piess,1989，pp.16—340。1. GlyA21-LysB28-ProB29人胰島素(甘賴脯胰島素)的制備(1)重組甘賴脯胰島素質(zhì)粒的構(gòu)建賴脯胰島素質(zhì)粒的擴(kuò)增將根據(jù)現(xiàn)有LysB28-Pr0B29人胰島素(賴脯胰島素)序列制得的賴脯胰島素質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到hcherichia coli (DH5a)中，然后加入到氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，在搖床中225rpm，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，對(duì)賴脯胰島素質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，然后用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。PCR定點(diǎn)突變使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Fast Mutagenesis System)，將擴(kuò)增的賴脯胰島素質(zhì)粒稀釋60倍作為定點(diǎn)突變的模板，以設(shè)計(jì)的兩條引物為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)
+曰O其中引物序列如下N-Gf :CTCGAGAACTACTGCGGCTAATGAAGCTTGATCN-Gr CCGCAGTAGTTCTCGAGCTGGTACAGGCTGPCR 體系為質(zhì)粒模板(5ng)lul，上游引物N-Gf(IOuM)O. 5uL,下游引物N-Gr(IOuM)O. 5uL,5 倍 Trans Start 快速 Pfu 緩沖液 5uL，dNTPs (IOmM) IuL,TransStart 快速 Pfu DNA 聚合酶 0. 7uL,
無菌水 16. 3uL,總體積25uL。擴(kuò)增條件為94°C4min ；94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 2. 5min 25 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。PCR產(chǎn)物的純化和消化將上述PCR產(chǎn)物用TianGen公司的PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，然后將Iul DMT酶加于40ul PCR純化產(chǎn)物中，混勻，37°C孵育1小時(shí)進(jìn)行消化。甘賴脯胰島素質(zhì)粒的構(gòu)建和確認(rèn)將2ul的DMT酶消化產(chǎn)物加到50ul的DMT感受態(tài)細(xì)胞中(來自定點(diǎn)突變?cè)噭┖?(Fast Mutagenesis System)，在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入消化產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴30 分鐘；于42°C準(zhǔn)確熱激45秒，立即置于冰上2分鐘；加到250ul室溫的LB培養(yǎng)基中，在搖床中225rpm，37°C培養(yǎng)1小時(shí)。然后取200ul菌液鋪于氨芐抗性LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜。挑選10個(gè)長出的轉(zhuǎn)化子，分別接入氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。第二天再從這10個(gè)過夜培養(yǎng)物中用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒；把提取的10個(gè)質(zhì)粒送到北京諾賽公司進(jìn)行序列測(cè)定，以鑒定突變基因的正確性。 選出載有正確突變基因的重組甘賴脯胰島素質(zhì)粒。(2)重組甘賴脯胰島素表達(dá)工程菌的構(gòu)建將2ul篩選出來的載有正確突變基因的重組甘賴脯胰島素質(zhì)粒加入到IOOul Escherichia coli(3110)的感受態(tài)細(xì)胞中(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴30分鐘；于42°C準(zhǔn)確熱激90秒，立即置于冰上2分鐘；加到300ul室溫的LB培養(yǎng)基中，在搖床中225rpm，37°C培養(yǎng)1小時(shí)，然后取50ul菌液鋪于氨芐LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜。從表達(dá)菌種hcherichia coli (3110)的培養(yǎng)平板上挑取單菌落，接種于5ml氨芐LB培養(yǎng)基中，在搖床中225rpm，37°C培養(yǎng)8小時(shí)，再從中吸取IOOul菌液接種于IL含有 20%富集培養(yǎng)基的M9培養(yǎng)基中，在搖床中225rpm，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，制成大量甘賴脯胰島素的表達(dá)工程菌。(3)重組甘賴脯胰島素工程菌的發(fā)酵表達(dá)將上述合格的工程菌接種至2L氨芐LB液體培養(yǎng)基中，在搖床中32°C，250rpm培養(yǎng)約6小時(shí)，轉(zhuǎn)種到5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至菌密度為0D600值為1. 5-2. 0時(shí)，再轉(zhuǎn)接入250L 發(fā)酵罐中，并在以下條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)pH控制在約7. 0 ；溶氧控制在7-65%之間，溫度前期控制在32°C，待0D600到20以后升溫至35°C，保持2小時(shí)后升溫至37°C，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中PH值靠補(bǔ)加氨水量控制；溶氧靠補(bǔ)料、通入壓縮空氣和調(diào)整攪拌速度控制。 圖2為所得重組甘賴脯胰島素在250L發(fā)酵罐中的各時(shí)點(diǎn)電泳表達(dá)檢測(cè)圖譜。由電泳圖譜可以看出甘賴脯胰島素在發(fā)酵15小時(shí)后，13kDa處可見明顯的目的蛋白表達(dá)條帶，26小時(shí)電泳掃描表達(dá)量為27. 37%。(4)甘賴脯胰島素原的復(fù)性與轉(zhuǎn)化將誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體洗滌液(pH 8. 0，50mM Tris-Cl)中，4-15°C攪拌洗滌1小時(shí)，再次離心回收菌體，然后將菌體懸浮在冰水中，在高壓勻漿機(jī)中進(jìn)行細(xì)胞破碎(750-800個(gè)大氣壓)，通過離心收集甘賴脯胰島素包涵體，包涵體再通過洗滌(pH8. 0,50mM Tris-Cl，0. 2% Triton X_100)，離心回收沉淀。而后將所得包涵體在高濃度尿素(8M)下進(jìn)行蛋白質(zhì)變性，低濃度尿素(1.6M)下進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性，得到有正確構(gòu)象的甘賴脯胰島素原。將甘賴脯胰島素原溶液除鹽后用50mM Tris調(diào)pH至10. 0，按質(zhì)量比 1 500-1 1000(E/S，即酶/前體胰島素原)分別加入胰蛋白酶和羧肽酶B，37°C反應(yīng) 30min，得到有正確構(gòu)象的甘賴脯胰島素。(5)甘賴脯胰島素的純化及確認(rèn)轉(zhuǎn)化后的甘賴脯胰島素經(jīng)陽離子交換層析(CM)純化，層析用緩沖液包含pH5. 0， IOmM檸檬酸，梯度洗脫用0-0. 8M NaCl梯度進(jìn)行，甘賴脯胰島素層析后純度在90%以上。再經(jīng)反相高壓液相層析后，經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)純度達(dá)到99. 77% (參見圖幻，符合國內(nèi)外藥典重組人胰島素項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)要求。將所得重組甘賴脯胰島素經(jīng)氨基酸序列分析，所得結(jié)構(gòu)與預(yù)
期一致。2. GlyA21人胰島素(甘胰島素)和GlyA21-AspB28人胰島素(甘門冬胰島素)的制備甘胰島素和甘門冬胰島素的制備過程與甘賴脯胰島素的制備過程一致，只是在質(zhì)粒構(gòu)建的步驟中，分別用現(xiàn)有的人胰島素質(zhì)粒和門冬胰島素質(zhì)粒代替賴脯胰島素質(zhì)粒進(jìn)行。實(shí)施例2本發(fā)明胰島素類似物在酸性條件下的穩(wěn)定性將通過實(shí)施例1方法制備得到的本發(fā)明胰島素類似物分別置于pH值為4. 0士0. 2 的溶液中，所得溶液為澄清狀態(tài)。將上述溶液在2_8°C貯存9個(gè)月后，各種胰島素類似物溶液中的相關(guān)蛋白的總增加量不超過1. 26% ；高分子蛋白的增加量不超過0. 55% ；效價(jià)的降低量不超過1%，都在95% -105%的范圍內(nèi)。上述結(jié)果說明，由于本發(fā)明胰島素類似物將酸性條件下易脫氨的A21位天冬酰氨替換為甘氨酸，因此在酸性條件下表現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性。實(shí)施例3本發(fā)明藥物制劑的制備方法及成分分析1.本發(fā)明藥物制劑的制備方法< 原料 > 甘賴脯胰島素通過實(shí)施例1的方法制備得到。甘精胰島素甘李藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)GLGB09001。鹽酸(批號(hào)2007080 、氫氧化鈉(批號(hào)20090804)購自湖南爾康制藥有限公司； 氯化鋅(批號(hào)20090522)、間甲酚(07496PK)購自上海京華有限公司；甘油購自浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司，批號(hào)20090921。<制備步驟> 胰島素母液的制備分別精密稱取甘賴脯胰島素和甘精胰島素各50萬單位，加入到3升蒸餾水中，攪拌混懸均勻，滴加3M鹽酸使其完全溶解后，補(bǔ)入適量氯化鋅溶液，使最終胰島素混合液中每毫升含鋅量約為30ug，然后補(bǔ)水至5L。其他輔料母液的制備精密稱取甘油160克，間甲酚27. 0克，放于適量注射用水中，攪拌至全部溶解后補(bǔ)水至4升。混合方法將其他輔料母液加入到胰島素母液中，再用10%氫氧化鈉或10%鹽酸調(diào)溶液的PH值至4. 0士0. 2，補(bǔ)水至終體積10升，貯存于2-8°C的條件下。最終所得澄清溶液中甘賴脯胰島素和甘精胰島素的濃度各為50IU/ml，總活性胰島素成分的濃度為100IU/ml。2.本發(fā)明藥物制劑的成分分析分析方法高效液相色譜法分析條件使用烷基硅烷鍵合硅膠為填充物的C4柱(3. 5μπι，15(3πιχ4.6πιπι I. D.)，用高氯酸鈉鹽緩沖液(精密稱取無水磷酸二氫鈉5. 9998g，加水900ml溶解，再加高氯酸鈉14. 046g溶解，混均，用高氯酸調(diào)其pH值為2. 5，加水至1L，過濾)為流動(dòng)相A ；再取高氯酸鈉鹽緩沖液-乙腈(50 50)為流動(dòng)相B，流速為l.Oml/min，柱溫為40°C，檢測(cè)波長為214nm。洗脫梯度為60% B平衡，初始狀態(tài)為60% B，然后在49分鐘內(nèi)將B%增至74%， 50分鐘時(shí)為100% B，持續(xù)10分鐘，61分鐘時(shí)為60% B，持續(xù)5分鐘。分析結(jié)果圖4為本發(fā)明甘賴脯胰島素與甘精胰島素以50 50的百分比預(yù)混后的高效液相色譜的保留時(shí)間測(cè)定圖譜。從圖4可以看出，在pH4. O時(shí)，速效和長效胰島素類似物的含量比例基本為50 50，且兩樣品峰之間的分離度大于2.0，說明兩種類似物在該條件下可以得到充分的分離，即可以進(jìn)行有效含量分析，保證生產(chǎn)過程中各組份的含量準(zhǔn)確控制。本發(fā)明實(shí)施例1中所制備的GlyA21人胰島素、GlyA21_ASpB28人胰島素也可按上述方法與甘精胰島素混合，并可按照需要以不同比例投料，制成含量百分比為30 70-70 30 的混合藥物制劑。所制得制劑通過高效液相色譜法分析也可以在PH4. O時(shí)得到充分的分離，即可以進(jìn)行有效含量分析，保證生產(chǎn)過程中各組份的含量準(zhǔn)確控制。實(shí)施例4本發(fā)明藥物制劑的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)<試驗(yàn)藥品 > 實(shí)施例3制備的本發(fā)明藥物制劑。<試驗(yàn)動(dòng)物> Wistar大鼠，體重200 220g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK-(吉)2003-0007。昆明種小白鼠，體重18 22g，由長春生物制品研究所提供，許可證號(hào) SCXK-(吉)2006-0001。豚鼠，體重300 350g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK-(吉)2008-0004。家兔，體重2. O 3. Okg,吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào) SCXK-(吉)2008-0004。〈試驗(yàn)方法和結(jié)果>:1.急性毒性研究按照現(xiàn)有藥物急性毒性研究方法(參見徐叔云，《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第二版，人民衛(wèi)生出版社，第201頁)，觀察小鼠禁食后皮下注射本發(fā)明藥物制劑引起的急性毒性反應(yīng)，記錄14日內(nèi)試驗(yàn)動(dòng)物的活動(dòng)情況及死亡數(shù)，計(jì)算LD50。所得計(jì)算結(jié)果為雄性小鼠LD50 = 3. 346U/Kg，其 95%的可信限為 2. 372 4. 719U/kg ；雌性小鼠LD50 = 4. 767U/kg，其 95%的可信限為 3. 556 6. 391U/kg ；雄性大鼠LD50 = 7. 447U/kg，其 95% 的可信限為 6. 159 9. 004U/kg。
對(duì)死亡動(dòng)物解剖肉眼觀察，主要臟器無異常。2.長期毒性研究試驗(yàn)方法分別給大鼠皮下注射3.72U/kg(LD50的1/2)、2. OU/kg(大鼠藥效劑量)、1.0U/kg(LD50的1/8)劑量的本發(fā)明藥物制劑，以及生理鹽水(對(duì)照組)，每日1次，連續(xù)5周，再停藥觀察2周。試驗(yàn)結(jié)果在給藥期間、停藥恢復(fù)期間，本發(fā)明藥物制劑各劑量組大鼠的體重、飲食量、飲水量及一般活動(dòng)等與生理鹽水組(對(duì)照組)比較均無明顯差異。給藥5周、停藥2 周時(shí)，本發(fā)明藥物制劑各劑量組大鼠血常規(guī)指標(biāo)、凝血項(xiàng)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、血清抗體、臟器系數(shù)及臟器組織病理學(xué)檢查等指標(biāo)與生理鹽水組(對(duì)照組)比較均無明顯差異。3.免疫毒性試驗(yàn)按照現(xiàn)有動(dòng)物免疫毒性試驗(yàn)方法(參見《中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光敏反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》，國家藥監(jiān)局，2005年)進(jìn)行豚鼠的主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)(ASA) 和大鼠的被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)(PCA)。①主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)(ASA)-豚鼠試驗(yàn)將本發(fā)明藥物制劑0. 87U/kg(豚鼠藥效劑量的1/ 、3. 48U/kg(豚鼠藥效劑量的 2倍)經(jīng)皮下注射于豚鼠，隔日1次，共5次，末次致敏后的第10天由靜脈注射上述藥物制劑的2倍量進(jìn)行激發(fā)，觀察并記錄激發(fā)注射后30分鐘內(nèi)豚鼠有無過敏癥狀兩個(gè)劑量組的結(jié)果皆呈陰性。②被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)(PCA)-大鼠試驗(yàn)將本發(fā)明藥物制劑1. OU/kg(大鼠藥效劑量的1/ 、4. OU/kg(大鼠藥效劑量的2 倍)經(jīng)皮下注射于大鼠，隔日1次，共5次，于末次致敏后第11天，腹主動(dòng)脈采血，制備抗體血清。將上述抗體血清用生理鹽水稀釋后，在大鼠皮內(nèi)注射0. Iml，48小時(shí)后，靜脈注射與致敏劑量相同的抗原(內(nèi)含0. 75%的伊文思藍(lán)染料)激發(fā)，30分鐘后測(cè)量皮膚內(nèi)側(cè)的藍(lán)色反應(yīng)斑直徑并判定陰陽性藍(lán)色反應(yīng)斑直徑大于5mm者判定為陽性，本發(fā)明藥物制劑兩個(gè)劑量組的結(jié)果皆呈陰性。4.刺激性、溶血性試驗(yàn)按照現(xiàn)有動(dòng)物刺激性、溶血性試驗(yàn)方法(參見《中藥、天然藥物刺激性、溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》，國家藥監(jiān)局，2005年)對(duì)家兔進(jìn)行刺激性試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)。①刺激性試驗(yàn)將本發(fā)明藥物制劑0. 5U/kg(家兔藥效劑量的1/ 、2. OU/kg(家兔藥效劑量的2 倍)單次經(jīng)皮下注射于家兔，從注射時(shí)至72h，注射局部沒有紅斑、水腫、充血等反應(yīng)癥狀， 其組織病理學(xué)檢查結(jié)果也表明本發(fā)明藥物制劑的兩個(gè)劑量組對(duì)家兔皮下組織無刺激性。②溶血試驗(yàn)本發(fā)明藥物制劑在3小時(shí)內(nèi)都沒有發(fā)生溶血和凝聚現(xiàn)象。由以上安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果可以看出本發(fā)明藥物制劑對(duì)動(dòng)物均未見明顯毒副作用影響，沒有過敏現(xiàn)象，注射部位無刺激反應(yīng)，藥物制劑本身無溶血現(xiàn)象。說明本發(fā)明藥物制劑具有很高的安全性。實(shí)施例5本發(fā)明藥物制劑的藥效學(xué)試驗(yàn)1、試驗(yàn)藥品
1
實(shí)施例3制備的本發(fā)明藥物制劑；重組賴脯胰島素注射液(100IU/ml，批號(hào)22080301，由甘李藥業(yè)有限公司提供)；重組甘精胰島素注射液(100IU/ml，批號(hào)12080303，由甘李藥業(yè)有限公司提供)。2、試驗(yàn)動(dòng)物=Wistar大鼠，雄性，50只，體重250 280g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK-(吉)2003-0007。3、試驗(yàn)試劑葡萄糖試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào) 081251. 200802。4、試驗(yàn)儀器GF_D800型半自動(dòng)生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司。 TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)。5、試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體方法參見徐叔云，《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第三版，人民衛(wèi)生出版社， 1517 頁①動(dòng)物分組和建模將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常組(不建立高血糖模型，給藥生理鹽水)；模型組(建立高血糖模型，給藥生理鹽水)；賴脯胰島素組(建立高血糖模型，給藥賴脯胰島素)；甘精胰島素組(建立高血糖模型，給藥甘精胰島素組)；本發(fā)明藥物制劑組(建立高血糖模型，給藥本發(fā)明藥物制劑)。其中高血糖模型通過以下方法建立先令Wistar大鼠禁食不禁水M小時(shí)，尾部靜脈注射四氧嘧啶60mg/kg，48小時(shí)后形成永久性高血糖模型。②給藥和采血高血糖模型建立后，令所有Wistar大鼠禁食不禁水16h，并在給藥前先采血測(cè)藥前血糖，然后對(duì)賴脯胰島素組、甘精胰島素組、本發(fā)明藥物制劑組的動(dòng)物皮下注射相應(yīng)胰島素，劑量均選為2. 0IU/kg ；對(duì)模型組、正常對(duì)照組的動(dòng)物皮下注射等體積生理鹽水。然后于給藥后 10min、30min、lh、2h、3h、4h、8h、12h、16h 眼眶采血，3000rpm/min 離心 5min，取血清， 終點(diǎn)法測(cè)血糖。③數(shù)據(jù)處理降糖百分率通過以下公式計(jì)算降糖百分率(％)=((藥前血糖值-藥后血糖值)/藥前血糖值)X 100%試驗(yàn)結(jié)果采用表示，相同時(shí)間點(diǎn)血糖及降糖百分率進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。計(jì)算結(jié)果見表1、表2和圖5。表1不同胰島素對(duì)四氧嘧啶高血糖大鼠血糖值(mmol/L)的影響，n = 10)
權(quán)利要求
1.一種胰島素類似物或其可藥用鹽，其特征在于，所述胰島素類似物為至少將其A鏈 A21位的天冬酰胺(Asn)突變?yōu)楦拾彼?Gly)的人胰島素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素類似物或其可藥用鹽，其中胰島素類似物為A21位上的Asn被Gly取代的人胰島素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素類似物或其可藥用鹽，其中胰島素類似物為A21位上的Asn被Gly取代，B^位上的Pro被Lys取代，并且B^位上的Lys被Pro取代的人胰島ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島素類似物或其可藥用鹽，其中胰島素類似物為A21位上的Asn被Gly取代，B28位上的Pro被Asp取代的人胰島素。
5.一種胰島素藥物組合物，包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的胰島素類似物或其可藥用鹽，以及長效胰島素類似物或其可藥用鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述長效胰島素類似物選自甘精胰島素。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述胰島素類似物和長效胰島素類似物的含量百分比為30 70-70 30。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述胰島素類似物和長效胰島素類似物的含量百分比為50 50。
9.一種胰島素藥物制劑，包含權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物和可藥用輔料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物制劑，該藥物制劑的pH為3.5-4. 5。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物制劑，該藥物制劑的pH為3.8-4. 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速起效且在酸性條件下穩(wěn)定的胰島素類似物及其藥物組合物和藥物制劑。該胰島素類似物的A鏈A21位的天冬酰胺(Asn)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，并可以與長效胰島素類似物如甘精胰島素混合，制成同時(shí)具有速效降糖和平穩(wěn)長效降糖兩種功能的預(yù)混制劑，解決現(xiàn)有天然胰島素(豬、牛、人)和速效胰島素類似物在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，以及現(xiàn)有胰島素預(yù)混制劑不澄清，需引入外源蛋白(例如魚精蛋白)作緩釋劑而易產(chǎn)生免疫反應(yīng)，每日需早、晚注射兩次的問題，使制劑安全性更高。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102199206SQ201110064530
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者彭毅, 王大梅, 金太河 申請(qǐng)人:甘李藥業(yè)有限公司