專利名稱：一種抗凝血活性寡肽及寬體金線蛭中抗凝血活性寡肽類化合物的提取純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明從水蛭科寬體金線蛭(寬體螞蟥)Whitmanis pigra Whitman的干燥體中， 采用色譜技術(shù)提取、分離、純化出了具有熱穩(wěn)定性的一群低分子的寡肽化合物，實驗證實它們具有明顯的內(nèi)源性和外源性抗凝血活性。其中一個純度較高和活性較強(qiáng)的成分測定了其分子量和氨基酸序列。研究背景當(dāng)今世界上平均每天有5萬、中國每年有200萬多人死于心腦血管疾病，抗擊心腦血管疾病是醫(yī)療戰(zhàn)線的重要任務(wù)之一。凝血是機(jī)體重要的生理機(jī)能，但病理性凝血即血栓形成在心腦血管疾病惡化中起著關(guān)鍵的作用，因此，發(fā)現(xiàn)新的抗栓和抗凝血活性物質(zhì)是防治心腦血管疾病的一個重要的任務(wù)。血液凝固是一個復(fù)雜的過程，凝血酶在這過程中起著關(guān)鍵的作用。凝血酶的結(jié)構(gòu)顯示凝血酶有3個結(jié)合區(qū)[I]:纖維蛋白結(jié)合區(qū)、底物催化活性區(qū)及肝素結(jié)合區(qū)。其中纖維蛋白結(jié)合區(qū)和肝素結(jié)合區(qū)主要由數(shù)個精氨酸及賴氨酸組成，可與電負(fù)性氨基酸及基團(tuán)結(jié)合。這些特征為抗凝血藥物凝血酶抑制劑提供了較好的作用靶點。目前發(fā)現(xiàn)的凝血酶抑制劑主要作用于底物催化區(qū)或纖維蛋白結(jié)合區(qū)，或同時作用上述兩個區(qū)域，這類藥物主要為多肽及類肽類化合物。水輕素(hirudin)是從水輕Hirudo nipponica Whitman唾液分離得到的一種多肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的特異性凝血酶抑制劑[I]。水蛭素具有強(qiáng)大的抗凝血作用，其抗凝作用是傳統(tǒng)抗凝藥肝素的3-5倍、對各種類型的血栓形成具有抑制顯著、起效快等突出優(yōu)點2，但是水蛭素還存在著如下缺點一、有一定出血并發(fā)癥，需要準(zhǔn)確控制劑量，隨時監(jiān)測2；二、半衰期較短2，需要頻繁注射給藥，這樣無疑增加了給藥途徑的危險性；三、穩(wěn)定性差，溫度和PH值的變化、多種酶(如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶A等)可使水蛭素分解失活1；四、分離純化困難，天然水蛭素僅產(chǎn)生于唾液腺，水蛭唾液腺中含有大量成分復(fù)雜的物質(zhì)，水蛭軀體中含有大量在結(jié)構(gòu)上與水蛭素類似、卻無抗凝活性的偽水蛭素1；第五、原料保存困難，水蛭素必須以新鮮活體水蛭的頭部唾液腺分泌物為原料提取1；第六，最根本的問題是能提取水蛭素的水蛭動物資源十分匱乏，使水蛭素的成本高昂。由于天然水蛭素的巨大藥用價值及其資源稀少，歐美日等國相繼采用DNA重組技術(shù)研制水蛭素。目前天然水蛭素cDNA已在大腸桿菌、酵母菌、哺乳類細(xì)胞和枯草桿菌中得到成功的表達(dá)[I]。重組水蛭素的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與天然水蛭素極其相似，其作用也相似，但在63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酯化，這使得重組水蛭素對凝血酶的抑制常數(shù)比天然水蛭素降低了 90%，加上重組水蛭素生物半衰期短、治療費用昂貴等缺點，使其難以在臨床上推廣應(yīng)用。從水蛭素的結(jié)構(gòu)得到的啟發(fā)，促進(jìn)了抗凝血小分子多肽和類肽的生物合成。已進(jìn)入臨床應(yīng)用及臨床研究的小分子類肽主要有阿加曲班、美拉加群等，還有一系列類肽化合物被合成，但它們口服吸收率較低。希美加群是近50年來開發(fā)的第I個可以口服的多肽類抗凝藥，由于其肝毒性，F(xiàn)DA沒有批準(zhǔn)在美國上市，在歐洲則只用于短期給藥[6]。但抗凝血多肽、類肽類與其他抗凝化合物如肝素、華法林等相比，仍然具有起效快、副作用低等優(yōu)點， 是今后抗凝藥研究的重點。已經(jīng)研制的多肽和類肽類主要是從水蛭素的結(jié)構(gòu)得到的啟發(fā)，因此，從天然物種發(fā)現(xiàn)新的天然的小分子的抗凝血多肽，便于分析結(jié)構(gòu)與作用的關(guān)系、便于進(jìn)行重組和生物合成，研發(fā)新的天然的或重組的抗凝血藥物，具有重要意義。中藥水輕為螞蟥科動物水輕Hirudo nipponica Whitman、螞蟥Whitmania nipponica Whitman 或柳葉螞蟥 Whitmania acranulata Whitman 的干燥體，是我國傳統(tǒng)的常用中藥材，具有破血通經(jīng)、逐瘀消徵的,用于血瘀經(jīng)閉、徵瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌撲損傷。 由于現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水蛭具有“改善血液循環(huán)、加快血流速度、促進(jìn)新陳代謝、降低血液粘度、 保持血管彈性、使血流通暢”等藥理作用，中醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于治療因瘀血所致的多種疾病，適應(yīng)癥涉及心腦血管、肝腎和血液的病變、男性病及腫瘤等。水蛭依其食性不同，可分為吸血水蛭與非吸血水蛭兩大類。其中，日本醫(yī)蛭(水蛭Hirudo nipponia)是吸血水蛭,是從其分離水蛭素的物種，因其資源很少,個頭也很小， 成年體重不足Ig或至2g，加上需要用活體提取水蛭素，中藥水蛭藥材中幾乎沒有日本醫(yī)蛭。非吸血水蛭中最常見的品種是寬體金線蛭(Whitman pigra),其成年個體重在20克以上。由于其個體較大、采集容易的緣故，故它是目前中藥材市場上中藥水蛭的最常見和主流的品種，也就是說，在現(xiàn)在制藥廠生產(chǎn)含有中藥水蛭的中成藥或中藥店銷售的水蛭中可能 90%以上是寬體金線蛭。目前，國內(nèi)以中藥水蛭制成的中成藥有片劑、膠囊劑和口服劑，生產(chǎn)這些中成藥的廠家多達(dá)65家。中藥水蛭的用量，應(yīng)用歷史和臨床療效都說明寬體金線蛭含有有效的抗凝血活性成分。但寬體金線蛭中不含水蛭素，應(yīng)用水蛭素的中成藥制劑，用其干燥體直接打粉或冷凍干燥后打粉入藥，或水煮醇提后入藥，具有熱穩(wěn)定性，但其所含的抗凝血的活性成分并不清楚。2001年，朱正光報道(中國生化藥物雜志2001，22 (5) :229-231)發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭干體的水煮液的上清部分及其醇溶部分具有抗栓作用，并發(fā)現(xiàn)其抗栓作用至少可能有兩種途徑其一抑制凝血酶對纖維蛋白原的作用而直接凝血；其二，直接水解纖維蛋白原和纖維蛋白，產(chǎn)生溶栓、降低血粘度、改善血液流變性等作用。本文證實了寬體金線蛭干體中存在熱穩(wěn)定性的抗凝血組分，但并未分離和確定這是什么類型的成分，也未確定它的分子量范圍。2008年，鐘山等(中國中藥雜志，2008，33 (23) ;2781_2784)報道從寬體金線蛭干體中用色譜法分離得到3個抗凝血活性多肽，其相對分子質(zhì)量分別為7100、5531和8608，第三個用HPLC測定了純度和氨基酸組成，推測化合物3為首次分離得到的抗凝血多肽，命名為螞蟥多肽(whitmanin)。該研究報道從寬體金線蛭干體中分離得到了分子量大于5000的抗凝血活性多肽，但迄今為止，尚未報道發(fā)現(xiàn)分子量5000以下的小分子抗凝血活性多肽。我們在實驗中證實了朱正光的研究，但還未發(fā)現(xiàn)分子量大于5000的分子有抗凝血活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從寬體螞蟥Whitmanis pigra Whitman干燥體中，通過篩選和提取、分離，得到了一批小分子量[分子量小于5000Da]的、具有熱穩(wěn)定性的抗凝血活性多肽混合物，并通過分離和純化獲得了純度較高的6個抗凝血活性組分。其中一個組分經(jīng)HPLC反復(fù)純化， 經(jīng)測定其具有較強(qiáng)的外源性和內(nèi)源性抗凝血活性，測得該化合物的分子量為2001. 25Da，由 22個氨基酸殘基組成，應(yīng)用氨基酸序列分析儀測定了它的氨基酸序列，為G-P-A-G-HyP-V-G-A-HyP-G-G-HyP-G-V-R-G-L-HyP-G-D-R-G,將其命名為螞蟥寡肽-I (Whitide-I)。將螞蟥寡肽-I在Swiss Prot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索分析匹配，提示該螞蟥寡肽片段類似人源膠原蛋白片段，氨基酸序列配對一致率高達(dá)61 %，屬于全新的一種多肽類結(jié)構(gòu)。寬體螞蟥資源豐富，其干燥品是中藥水蛭的主要來源，易于收集、保存和加工；其抗凝血成分能用醇和水加熱提取，是耐熱的較穩(wěn)定的成分，較易開發(fā)為內(nèi)服制劑或腸溶制劑，制劑技術(shù)將大大簡化，其安全性也將大為增加；同時，這一新的天然的小分子耐熱活性多肽的結(jié)構(gòu)將為重組或合成新的多肽和類肽類凝血酶抑制劑提供新的重要的信息。技術(shù)方案I本發(fā)明分離純化小分子的抗凝血活性多肽的提取分離步驟包括I. I小分子的抗凝血活性多肽的提取具熱穩(wěn)定性的、小分子的抗凝血活性多肽可經(jīng)由下述多種方法提取(I)將陰干的寬體螞蟥藥材粉碎后，用石油醚脫脂；再用生理鹽水加熱回流2次， 趁熱過濾后，合并濾液，在50°C以下減壓濃縮，取濃縮液冷凍干燥，得到粗提物凍干粉。(2)將陰干的寬體螞蟥藥材，加水用勻漿機(jī)粉碎后，加水煎煮，趁熱過濾；殘渣再加水煎煮，趁熱過濾。合并濾液，濃縮，在上述濃縮液中加入乙醇適量，使乙醇終濃度為 75%，4°C放置10-12h，離心取上清，在50°C以下減壓回收乙醇，至無醇味，冷凍干燥，得到粗提物凍干粉。(3)將干燥的寬體螞蟥藥材，用石油醚脫脂；再用30-75%的乙醇回流提取，趁熱過濾；殘渣再加乙醇回流提取，趁熱過濾，合并濾液，在50°C以下減壓回收乙醇，至無醇味。 加適量水，加溫(30-60°C )振搖使溶，4°C放置10-12h，離心取上清，冷凍干燥，得到粗提物凍干粉。(4)將干燥的寬體螞蟥藥材，加水用勻漿機(jī)粉碎后，用生理鹽水反復(fù)冷浸、過濾后， 合并濾液，離心，取上清液，在50°C以下減壓濃縮，取濃縮液冷凍干燥，得到粗提物凍干粉。以上多種提取方法有一個關(guān)鍵步驟，即提取物必須在水溶液中經(jīng)過冷凍干燥，才能便于濃縮和放置。如果不進(jìn)行冷凍干燥，則必須直接進(jìn)行下列分離步驟。I. 2小分子抗凝血活性多肽的分離步驟(I)將粗提物凍干粉溶于雙蒸水中，低溫離心后，取上清液通過S^hadex G5tl柱過濾層析，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，流速0. 5-2. 5ml/min。檢測波長254nm，得到一個峰，將其分成3個組分(S1, S2, S3),分別冷凍干燥(圖I)。(2)取經(jīng) S印hadex G50 層析后的 S2 組分凍干粉溶于 0-0. 2mol/L NH4HCO3(pH7. 8) 的溶液中，低溫離心后，取上清液通過DEAE-52柱層析。用O. 0-0. 2mo/L的NH4HCO3溶液洗脫，流速0. 5-2. 5ml/min。檢測波長254nm，按不同濃度洗脫液分別收集，分為4組分(D1, D2, D3, D4 ;圖2)，分別冷凍干燥。(3)取經(jīng)DEAE-52層析后的D1組分凍干粉溶于重蒸水中，低溫離心后，棄去沉淀，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾。用分析兼半制備型高效液相色譜儀(Agilent IlOOsystem),0DS-C18 柱(4. BmmX 1 50mm, 5u)進(jìn)行半制備。溶液A液超純水(Millipore)；B 液乙腈(Fisher)；梯度60min內(nèi)B液由15%升至50%，檢測波長214nm，流速1·Oml/min,進(jìn)樣量200μ I按照峰的個數(shù)分為6組分(PpPyPyPyPMP6 ;圖3)進(jìn)行收集，將若干次半制備所得的收集液相同的組分合并，冷凍干燥。(4)取經(jīng)半制備高效液相色譜法分離后的P6組分凍干粉溶于ΙΟΟμ I的超蒸水中， 低溫離心后，上清液用高效液相色譜法再次純化。高效液相色譜儀(Agilent1100 system),Zorbax C18 柱(4. 6mm X 250mm, 5u),進(jìn)行二次純化；溶液A液超純水(Millipore)；B 液乙腈(Fisher)；梯度40min內(nèi)B液由20%升至40%，檢測波長214nm，流速1·Oml/min,進(jìn)樣量10μ L收集P6組分的洗脫液，將其冷凍干燥后，得到較純的多肽(圖4)，將P6組分命名為螞蟥寡肽-I (Whitide-I)。2螞蟥寡肽的鑒定2. I將螞蟥寡肽樣品的凍干粉用超純水溶解后，吸取10 μ I注入基質(zhì)輔助激光解吸離子化時間飛行質(zhì)譜儀中，加速電壓20000V，采樣分子量范圍1000-5000Da，測得其分子量是 1997. 1-2001. 25Da。(圖 5)2. 2將經(jīng)過HPLC 二次分離純化的螞蟥寡肽樣品通過Edman降解在AppI ied Biosystems 477A序列儀上進(jìn)行，并偶聯(lián)120A氨基酸分析儀完成序列分析。測出的氨基酸序列為G-P-A-G-HyP-V-G-A-HyP-G-G-HyP-G-V-R-G-L-HyP-G-D-R-G。


圖I :寬體金線蛭粗提物經(jīng)過Sephadex G50葡聚糖凝膠層析后的色譜2 =S2組分經(jīng)過DEAE-52離子交換樹脂層析后的色譜3 =D1組分經(jīng)過HPLC的分離色譜4 :螞蟥寡肽-I (WhiTIde-I)經(jīng)過HPLC 二次純化后的色譜5 :螞蟥寡肽-I (Whitide-I)經(jīng)過MALDI-TOF-MS后的色譜6 :提取物抗凝血活性(平板法)3寬體金線蛭中小分子多肽類成分和螞蟥寡肽-I的抗凝血活性將上述寬體金線蛭粗提物冷凍干燥品的粗提取物，以及經(jīng)色譜方法收集的小分子多肽類混合物SI、S2、S3、DI、D2、D3、D4以及分離出的6個組分P1-P6進(jìn)行內(nèi)源性抗凝血途
6徑和外源性抗凝血途徑的活性測試，發(fā)現(xiàn)這些小分子的混合物和/或單體都有一定外源性或內(nèi)源性抗凝血活性，其中P6組分(即螞蟥寡肽-I)在內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑上均具有較好的活性，且活性較其它組分更強(qiáng)。提取物組分的抗凝血活性試驗3. I實驗材料全自動凝血分析儀(BE公司，Thrombolyzer Compact)；氯化鈣凝血活酶試劑(德靈，4ml，No. OUHP 29)；佛羅那巴比妥緩沖液(德靈，10ml, B4234-25)；APTT試劑(商品試劑，德靈，4ml)；正常人血漿(正常人體檢所得)。3. 2 方法3. 2. I凝血分析儀測定各組分的凝血酶原時間(PT)分離乏血小板血漿用一次性塑料采血器抽取20個以上男女各半的正常人靜脈血液，用109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝劑與血液之比為9 : I,輕輕顛倒混勻，以3000r/min,4°C 離心lOmin，分離血漿中的血小板后，混合分裝為每瓶1ml，備用。配制樣品各樣品凍干粉用雙蒸水溶解，配制成濃度為5 μ g/μ I的溶液，混合均勻，即為樣品備用。平衡溫度將乏血小板血漿、氯化鈣組織凝血活酶溶液各置于37°C水浴中溫浴 5min。測定各樣品作用后的PT值按照凝血分析儀試劑位置程序要求，把乏血小板血漿、凝血活酶含鈣試劑和佛羅那巴比妥緩沖液等，每一項的試劑放在相應(yīng)的位置。按血凝儀的操作方法，取樣品溶液30 μ I加到測試杯中，凝血分析儀取樣針自動吸取乏血小板血漿、 氯化鈣組織凝血活酶試劑和佛羅那巴比妥緩沖液，血凝儀自動測定血漿凝固的終點，并顯示樣品的PT值。表I各樣品作用后凝血酶原時間(PT)
權(quán)利要求
1.一種抗凝血活性寡肽及水蛭藥材中抗凝血活性寡肽類化合物的提取物及其純化，以及應(yīng)用這種抗凝血活性寡肽及水蛭藥材提取的含有抗凝血活性寡肽類化合物的提取物的各種應(yīng)用制劑。其特征在于包括下列步驟(I)水蛭藥材中小分子的抗凝血活性多肽的提取；(2)小分子的抗凝血活性多肽的分離(3)小分子的抗凝血活性多肽的鑒定；(4)水蛭藥材中小分子多肽類成分的抗凝血活性篩選和測定；(5)應(yīng)用這種抗凝血活性寡肽或水蛭藥材中提取的含有抗凝血活性寡肽類化合物的提取物制備的各種醫(yī)藥和保健制劑，如針劑、膠囊劑、片劑。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的藥材為水蛭藥材中之一種水蛭科寬體金線蟲至(寬體螞蟥)ffhi tmanis pigra Whitman。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述用石油醚脫脂、加熱回流、冷凍干燥。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述得到的粗提物凍干粉。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，步驟⑵中所述用SephadexG5tl柱過濾層析、DEAE-52層析。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，步驟(2)中所述通過過濾層析得到3個組分(S1,S2，S3), 4 組分(D1, D2, D3, D4)，6 組分(P1, P2, P3, P4, P5, P6)。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，步驟(3)得到的小分子多肽鑒定為螞蟥寡肽-I (Whitide-I)，其分子量為 2001. 2 a，氨基酸序列為G-P-A-G-HyP-V-G-A-HyP-G-G_H yP-G-V-R-G-L-HyP-G-D-R-G。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，按步驟(3)得到的抗凝血的小分子多肽螞蟥寡肽-I (Whitide-I)，其分子量和氨基酸序列如7所示，其可以是從任何天然的水蛭類動物中提取的，也可以是通過人工合成的，或通過基因表達(dá)產(chǎn)生的，它們可以用于制備抗凝血的各種醫(yī)藥和保健類制劑，如膠囊劑、片劑、針劑等。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，從寬體金線蛭中經(jīng)提取得到的冷凍粗提取物、再經(jīng)各種柱層析分離的混合物和各種組分，用于抗凝血作用相關(guān)的活性篩選及其開發(fā)利用。這些冷凍粗提取物、分離的混合物和各種組分中含有主要活性成分為分子量小于5000的抗凝血多肽，它們可以用于制備抗凝血的各種醫(yī)藥和保健類制劑，如膠囊劑、片劑、針劑等。
全文摘要
本發(fā)明提供了寬體金線蛭藥材中抗凝血活性寡肽類化合物的提取物及其純化的方法，并得到和鑒定了一個具有抗凝血活性的小分子多肽，鑒定為螞蟥寡肽-1(Whitide-1)，其分子量為2001.25Da，氨基酸序列為G-P-A-G-HyP-V-G-A-HyP-G-G-HyP-G-V-R-G-L-HyP-G-D-R-G。得到的提取物和小分子多肽具有很強(qiáng)的抗凝血活性，因此，該發(fā)明對應(yīng)用寬體金線蛭藥材中含有抗凝血活性寡肽類化合物的提取物及這種抗凝血活性小分子多肽開發(fā)各種制劑具有重要意義。
文檔編號A61P7/02GK102603881SQ20111002271
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者萬明, 劉義梅, 唐仕歡, 游云, 鄭霄蓓, 陳正望, 陳科力, 黃璐琦 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所