專(zhuān)利名稱(chēng)：早產(chǎn)新生兒的治療的制作方法
早產(chǎn)新生兒的治療本發(fā)明涉及對(duì)早產(chǎn)新生兒(pre-term neonate)的治療,例如涉及減小或防止與早產(chǎn)有關(guān)的死亡和患病。早產(chǎn)影響著5% 10%的發(fā)達(dá)國(guó)家人口和約25%的發(fā)展中國(guó)家人口 L早產(chǎn)占新生兒死亡的大部分，并且占據(jù)了新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房工作量的絕大部分。這意味著巨大的成本負(fù)擔(dān)，在2006 2007年，一天的新生兒重癥監(jiān)護(hù)花費(fèi)約1000英鎊，在英國(guó)的總年度花費(fèi)據(jù)估算為4. 2億英鎊2。在新生兒重癥監(jiān)護(hù)中最成功的措施之一是在出生后立即將合成的表面活性劑施用到早產(chǎn)兒的肺中。該措施減小了與早產(chǎn)有關(guān)的死亡率和患病率(綜述見(jiàn)Soil3)。在動(dòng)物研究中鑒定出了表面活性劑，在這些研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)新生兒進(jìn)行其第一次呼吸時(shí)表面活性劑在降低肺部表面張力上起關(guān)鍵作用。在妊娠期的最后1/3表面活性劑在肺內(nèi)的表達(dá)升高，并且，在包括人在內(nèi)的多種物種中，這受到胎兒中的皮質(zhì)類(lèi)固醇的誘導(dǎo)。對(duì)表面活性劑 的使用是如何可以將對(duì)出生準(zhǔn)備生物學(xué)的理解轉(zhuǎn)化為可行的且可獲益的治療措施的實(shí)例。本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)編碼對(duì)氧磷酶3 (paraoxonase 3, P0N3)和血清淀粉樣蛋白A3 (serum amyloid A like protein 3, SAA3)的轉(zhuǎn)錄本在正常哺乳動(dòng)物妊娠末期的胎兒中上調(diào)，并且在使新生兒適應(yīng)在出生時(shí)從母體環(huán)境分娩后所出現(xiàn)的變化中起重要作用。因此，對(duì)氧磷酶3(P0N3)和/或血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)可用作減小或防止早產(chǎn)新生兒中的死亡和患病的治療劑。本發(fā)明的一方面提供治療早產(chǎn)新生兒的方法，所述方法包括提高早產(chǎn)新生兒的對(duì)氧磷酶3 (P0N3)多肽的水平或活性。本發(fā)明的另一方面提供治療早產(chǎn)新生兒的方法，所述方法包括提高早產(chǎn)新生兒的血清淀粉樣蛋白A3 (SAA3)多肽的水平或活性。早產(chǎn)新生兒是在正常妊娠期結(jié)束之前出生的嬰兒。在人類(lèi)中，通常認(rèn)為在妊娠期少于37周(從對(duì)估計(jì)到期日的最佳臨床估計(jì)中推算得到，其中估計(jì)到期日等于40周O天)時(shí)分娩的嬰兒是早產(chǎn)的。在一些實(shí)施方式中，早產(chǎn)新生兒可以是極早產(chǎn)新生兒，例如，在妊娠期少于32周時(shí)分娩的人類(lèi)嬰兒。適于本文中所述治療的早產(chǎn)新生兒可以是哺乳動(dòng)物早產(chǎn)新生兒，優(yōu)選為人類(lèi)早產(chǎn)新生兒。適于本文中所述治療的早產(chǎn)新生兒可缺乏P0N3。換言之，該早產(chǎn)新生兒的P0N3水平或活性可低于足月新生兒的P0N3水平或活性。在一些實(shí)施方式中，直接地通過(guò)測(cè)量分娩前或分娩后的P0N3水平，或者間接地通過(guò)鑒定與P0N3缺乏相關(guān)的一種或多種癥狀(例如與氧化應(yīng)激有關(guān)的并發(fā)癥)，可以在治療前鑒定早產(chǎn)新生兒缺乏P0N3。在另外一些實(shí)施方式中，可以在未鑒定早產(chǎn)新生兒缺乏P0N3的情況下對(duì)其進(jìn)行所述治療。適于本文中所述治療的早產(chǎn)新生兒可缺乏SAA3。換言之，該早產(chǎn)新生兒的SAA3水平或活性可低于足月新生兒的SAA3水平或活性。在一些實(shí)施方式中，直接地通過(guò)測(cè)量分娩前或分娩后的SAA3水平，或者間接地通過(guò)鑒定與SAA3缺乏相關(guān)的一種或多種癥狀(例如與氧化應(yīng)激有關(guān)的并發(fā)癥)，可以在治療前鑒定早產(chǎn)新生兒缺乏SAA3。在另外一些實(shí)施方式中，可以在未鑒定早產(chǎn)新生兒缺乏SAA3的情況下對(duì)其進(jìn)行所述治療。鑒定具有患病和/或死亡風(fēng)險(xiǎn)的早產(chǎn)新生兒的方法可以包括確定從該新生兒獲得的樣品中的P0N3和/或SAA3的水平或活性；其中，與對(duì)照相比P0N3和/或SAA3的水平或活性降低表明該早產(chǎn)新生兒具有患病和/或死亡風(fēng)險(xiǎn)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如諸如ELISA等免疫測(cè)定)或者使用酶活測(cè)定，可以在從早產(chǎn)新生兒獲得的樣品(例如血液或血清樣品)中確定P0N3和/或SAA3的水平。

具有患病和/或死亡風(fēng)險(xiǎn)的早產(chǎn)新生兒相對(duì)于足月新生兒可具有升高的死亡和/或患病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于被鑒定具有患病和/或死亡風(fēng)險(xiǎn)的早產(chǎn)新生兒，可以按本文所述進(jìn)行治療。提高本文所述的早產(chǎn)新生兒的P0N3多肽和/或SAA3多肽的水平或活性，可以降低死亡和/或患病的程度、嚴(yán)重性或風(fēng)險(xiǎn)。例如，本文所述的治療可以防止或降低早產(chǎn)的醫(yī)學(xué)并發(fā)癥(例如，與氧化應(yīng)激相關(guān)的并發(fā)癥)的嚴(yán)重性或風(fēng)險(xiǎn)?？梢灾委煹脑绠a(chǎn)并發(fā)癥包括呼吸并發(fā)癥，例如呼吸窘迫綜合征、肺性高血壓和支氣管肺發(fā)育不良；神經(jīng)學(xué)并發(fā)癥，例如早產(chǎn)兒呼吸暫停、低氧缺血性腦病(HIE)、顱內(nèi)出血、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、發(fā)育性殘疾和腦癱；心血管并發(fā)癥，例如動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(PDA)；胃腸及代謝并發(fā)癥，例如低血糖癥、喂食困難和壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC);以及血液學(xué)并發(fā)癥，例如早產(chǎn)兒貧血、血小板減少癥和高膽紅素血癥(黃疸)及核黃疸。在一些實(shí)施方式中，本文所述的可以治療的早產(chǎn)并發(fā)癥不包括敗血癥或感染或者與敗血癥或感染相關(guān)的病況?？梢允箤?duì)氧磷酶3 (P0N3)多肽的水平或活性在新生兒中系統(tǒng)性地升高，或者在特定器官或組織(例如，早產(chǎn)新生兒的肺、血管系統(tǒng)和/或其他組織)中局部性地升高。優(yōu)選的是，通過(guò)向早產(chǎn)新生兒施用P0N3多肽來(lái)提高P0N3多肽的水平。對(duì)氧磷酶3(P0N3 ；GeneID: 5446)是與血清中的高密度脂蛋白關(guān)聯(lián)的磷酸二酯酶(EC 3. I. 8. I)。人P0N3的氨基酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為NP_000931. IGI: 29788996，并示于SEQ ID NO: 2中。編碼人Ρ0Ν3的核苷酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為NM_000940. 2GI:94538355，并示于 SEQ ID Ν0:1 中。發(fā)明人還鑒定了具有 SEQ IDN0:4 所示的氨基酸序列的人P0N3剪接變體。編碼該人P0N3剪接變體的核苷酸序列示于SEQ ID NO:3中。適合于本文所述應(yīng)用的其他P0N3多肽可以包括來(lái)自非人哺乳動(dòng)物(例如?；蜇i)的P0N3的氨基酸序列，或者可以是其片段、變體或等位基因產(chǎn)物。牛P0N3 (GeneID:510953)的氨基酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為ΝΡ_001068947. IGI: 115496165。編碼牛P0N3的核苷酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為NM_001075479. IGI: 115496164。豬 P0N3 (GeneID: 733674)的氨基酸序列的 Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為 ΝΡ_001038069. IGI: 113205866。適合于本文所述應(yīng)用的P0N3多肽可以包括參照P0N3序列的氨基酸序列(例如SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4)或者該參照P0N3序列的片段、等位基因產(chǎn)物或變體。例如，參照P0N3序列(例如SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4)的等位基因產(chǎn)物或變體可以包含與參照P0N3序列的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸序列。通過(guò)插入、增加、替換或缺失I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5 10個(gè)、10 20個(gè)或20 30個(gè)氨基酸，P0N3多肽可以包含例如與參照P0N3序列(例如SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4)不同的氨基酸序列。P0N3多肽可以是全長(zhǎng)P0N3氨基酸序列(例如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4)的片段，或者是SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的變體或等位基因產(chǎn)物。片段是截短的多肽，由比、全長(zhǎng)序列更少的氨基酸組成，且保留了對(duì)氧磷酶3的活性。適合的片段可以包含全長(zhǎng)序列中的至少100、至少150、至少200、至少250或至少300個(gè)氨基酸。適合的片段保留了 P0N3活性。適合于本文所述應(yīng)用的P0N3多肽可以由核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ IDNO: 3編碼，或者可以由SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 3的等位基因或變體編碼。例如，P0N3多肽可以由與核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:3的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的核苷酸序列編碼。通過(guò)插入、增加、替換或缺失I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5 10個(gè)、10 20個(gè)或20 30個(gè)核苷酸，編碼P0N3多肽的核苷酸序列可以例如與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3不同。類(lèi)似地，可以使血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)多肽的水平或活性在早產(chǎn)新生兒中系統(tǒng)性地升高，或者在特定器官或組織(例如，該新生兒的肺、血管系統(tǒng)和/或其他組織)中局部性地升高。優(yōu)選的是，通過(guò)向早產(chǎn)新生兒施用SAA3多肽來(lái)提高SAA3多肽的水平。人SAA3的氨基酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為AA048437. IGI: 28864698，并示于SEQ ID NO:6中。編碼人SAA3的核苷酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為AY209188. IGI:28864697，并示于 SEQ ID N0:5 中。適合于本文所述應(yīng)用的其他SAA3多肽可以包括來(lái)自非人哺乳動(dòng)物(例如牛、大鼠或小鼠)的SAA3的氨基酸序列，或者可以是其片段、變體或等位基因產(chǎn)物。鼠SAA3 (GeneID: 20210)的氨基酸序列的 Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為 NP_035445. 1GI:6755396。編碼鼠SAA3的核苷酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為NM_011315. 3GI: 118130197。編碼大鼠SAA3的核苷酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為BF282318 GI: 11213489，并且在Rat230_2陣列上與Affymetrix探針1392647_at雜交。牛SAA3 (GeneID: 281474)的氨基酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為NP_851359. 2GI: 38566696。編碼牛SAA3的核苷酸序列的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別號(hào)為 NM_181016. 3GI: 38566695。適合于本文所述應(yīng)用的SAA3多肽可以包括參照SAA3序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6)或者該參照SAA3序列的片段、等位基因產(chǎn)物或變體。例如，參照SAA3序列(例如SEQ ID NO:6)的等位基因產(chǎn)物或變體可以包含與參照SAA3序列的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸序列。通過(guò)插入、增加、替換或缺失I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5 10個(gè)、10 20個(gè)或20 30個(gè)氨基酸，SAA3多肽可以包含例如與參照SAA3序列(例如SEQ ID NO:6)不同的氨基酸序列。
SAA3多肽可以是全長(zhǎng)SAA3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6)的片段，或者是SEQIDNO:6的變體或等位基因產(chǎn)物。片段是截短的多肽，由比全長(zhǎng)序列更少的氨基酸組成，且保留了血清淀粉樣蛋白A3的活性。適合的片段可以包含全長(zhǎng)序列中的至少30、至少40或至少50個(gè)氨基酸。適合的片段保留了血清淀粉樣蛋白A3的活性。適合于本文所述應(yīng)用的SAA3多肽可以由核苷酸序列SEQ ID N0:5編碼，或者可以由SEQ ID NO: 5的等位基因或變體編碼。例如，SAA3多肽可以由與核苷酸序列SEQ ID NO: 5的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的核苷酸序列編碼。通過(guò)插入、增加、替換或缺失I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5 10個(gè)、10 20個(gè)或20 30個(gè)核苷酸，編碼SAA3多肽的核苷酸序列可以例如與SEQ ID NO:5不同。通常，參照GAP 算法(GCG Wisconsin Package , Accelrys, San Diego CA)來(lái)定義
核苷酸和氨基酸序列同一性。GAP使用Needleman & Wunsch算法36來(lái)比對(duì)兩條完整序列，使匹配數(shù)最大化且使空位數(shù)最小化。通常，使用默認(rèn)參數(shù)，即空位建立罰分=12，空位延伸罰分=4。可以?xún)?yōu)選使用GAP，但也可以使用其他算法，例如BLAST或TBLASTN (其使用Altschul等，(1990) J. Mol. Biol. 215:405-410 中的方法),FASTA(其使用 Pearson 和 Lipman (1988)PNAS USA 85:2444-2448 中的算法)或 Smith-Waterman 算法(Smith 和 Waterman (1981) J.Mol Biol. 147:195-197)，通常采用默認(rèn)參數(shù)?？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)異源氨基酸(例如異源肽或異源多肽序列)接合或融合至本文所述的P0N3或SAA3氨基酸序列。例如，P0N3多肽可以包含與一個(gè)或多個(gè)異源氨基酸連接或融合的上文所述的P0N3氨基酸序列。所述一個(gè)或多個(gè)異源氨基酸可以包括來(lái)自非P0N3來(lái)源的序列。類(lèi)似地，SAA3多肽可以包含與一個(gè)或多個(gè)異源氨基酸連接或融合的上文所述的SAA3氨基酸序列。所述一個(gè)或多個(gè)異源氨基酸可以包括來(lái)自非SAA3來(lái)源的序列。P0N3或SAA3多肽可以包含在融合蛋白中。在一些實(shí)施方式中，在用于治療本文所述的早產(chǎn)兒之前，融合蛋白可以經(jīng)加工而產(chǎn)生成熟的P0N3或SAA3多肽。例如，除了 P0N3或SAA3多肽以外，融合蛋白可以在N端或C端包含一個(gè)或多個(gè)異源氨基酸，這些異源氨基酸構(gòu)成位點(diǎn)特異性蛋白酶識(shí)別序列的全部或一部分。通過(guò)切割該位點(diǎn)特異性蛋白酶識(shí)別序列(例如使用位點(diǎn)特異性蛋白酶，如凝血酶或因子X(jué)a)，可以從該融合蛋白得到成熟的P0N3或SAA多肽。融合蛋白可以包含純化標(biāo)簽，在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶將該純化標(biāo)簽除去。適合的純化標(biāo)簽包括谷胱甘肽-S-移轉(zhuǎn)酶(來(lái)自日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonica))。P0N3和SAA3多肽可以用任何常規(guī)技術(shù)來(lái)制造，并且有多種適合的方法可供使用。可以從非人哺乳動(dòng)物(例如豬或牛)中分離和/或純化出P0N3和SAA3多肽?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生完整或部分的P0N3和SAA3多肽。例如，可以使用以下方式來(lái)合成多肽使用液相或固相合成法；在溶液中；或者使用固相、液相和溶液化學(xué)的任何組合，例如，首先完成各肽部分，隨后，如有需要且合適，在除去所存在的任何保護(hù)性基團(tuán)后，憑借相應(yīng)的碳酸或磺酸或其反應(yīng)性衍生物的反應(yīng)來(lái)引入殘基X。多肽的化學(xué)合成在本領(lǐng)域中是公知的(J. M. Stewart和J. D. Young, Solid PhasePeptide Synthesis,第 2 版,Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)；M. Bodanzsky和A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, NewYork(1984) ；J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford UniversityPress, Oxfordl991 ；Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc. , Foster City,California ；G. A. Grant，(編)Synthetic Peptides, A User’s Guide. W. H. Freeman &Co.，New York 1992 ；E. Atherton 和 R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, APractical Approach. IRL Press 1989 ；G. B. Fields,(編)Solid_Phase PeptideSynthesis(Methods in Enzymology 第 289 卷).Academic Press, New York and London1997)o可以用重組技術(shù)產(chǎn)生完整或部分的P0N3和SAA3多肽。例如，編碼P0N3或SAA3多肽的核酸可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且可以從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和/或提純所表達(dá)的多肽。為了產(chǎn)生重組P0N3或SAA3多肽，可以將編碼P0N3或SAA3多肽的核酸序列(即P0N3核酸或SAA3核酸)包含在表達(dá)載體中?？梢赃x擇或構(gòu)建合適的載體，其包含適合的調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)志基因和其他適合的序列。優(yōu)選的是，載體包含適合的調(diào)控序列來(lái)驅(qū)動(dòng)P0N3或SAA3核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。驅(qū)動(dòng)異源核酸編碼序列在多種表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)的適合的調(diào)控序列在本領(lǐng)域是公 知的，其包括組成型啟動(dòng)子，例如病毒啟動(dòng)子(例如CMV或SV40)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如Tet-on控制的啟動(dòng)子)。載體還可以包含諸如復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記等序列，這些序列使得可以對(duì)其進(jìn)行選擇并且可以使其在細(xì)菌宿主(例如大腸桿菌)和/或真核細(xì)胞(例如酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中復(fù)制和表達(dá)。適用于表達(dá)P0N3或SAA3核酸的載體包括質(zhì)粒和病毒載體(例如噬菌體或噬菌粒)，而對(duì)載體的精確選擇將取決于所用的特定表達(dá)系統(tǒng)。P0N3或SAA3多肽可以在任何便利的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并且在本領(lǐng)域中有多種適合的系統(tǒng)可供使用，包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:a Laboratory Manual)(第 3 版)，Russell 等，2001, Cold Spring HarborLaboratory Press。用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)重組多肽以及其隨后的分離和純化的技術(shù)和操作規(guī)程在本領(lǐng)域中是公知的(參見(jiàn)例如Protocols in Molecular Biology,第2版，Ausubel 等編，John Wiley & Sons, 1992 ；Recombinant Gene Expression ProtocolsEd RSTuan(1997 年 3 月)Humana Press Inc.)。如上所述，P0N3或SAA3多肽可以作為包含P0N3或SAA3多肽序列和純化標(biāo)簽的融合蛋白在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。優(yōu)選的是，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)位于P0N3或SAA3多肽與純化標(biāo)簽之間。在表達(dá)后，可以使用可與純化標(biāo)簽結(jié)合的固定試劑通過(guò)親和層析來(lái)分離出融合蛋白。在分離后，可以使用例如凝血酶或因子X(jué)a來(lái)以蛋白水解方式切割融合蛋白，從而產(chǎn)生P0N3或SAA3多肽。純化標(biāo)簽是構(gòu)成特異性結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員的異源氨基酸序列。通過(guò)所述特異性結(jié)合對(duì)的另一個(gè)成員與多肽的結(jié)合，可以檢測(cè)、分離和/或純化包含所述純化標(biāo)簽的多肽。例如，該純化標(biāo)簽可以構(gòu)成抗體分子所結(jié)合的表位。多種適合的純化標(biāo)簽在本領(lǐng)域中是已知的，例如包括MRGS冊(cè)6、DYKDDDDK (FLAG )、T7-、S- (KETAAAKFERQHMDS)、聚 Arg(R5_6)、聚 His (H2_10)、聚 Cys (C4)聚Phe (F11)聚 Asp (D5_16)、Strept-tag 11 (WSHPQFEK) > c_myc (EQKLISEEDL)、Influenza-HA 標(biāo)簽(Murray, P. J.等，(1995) Anal Biochem 229，170-9)、Glu-Glu-Phe 標(biāo)簽(Stammers, D.K.等，(1991)FEBS Lett 283, 298-302) ,Tag. 100(Qiagen ;源自哺乳動(dòng)物MAP激酶2 的 12氨基酸標(biāo)簽)和Cruz tag 09 (MKAEFRRQESDR, Santa Cruz Biotechnology Inc.)和Cruz tag22 (MRDALDRLDRLA, Santa Cruz Biotechnology Inc·)。在 Terpe(2003)Appl. Microbiol.Biotechnol. 60523-533中綜述了已知的標(biāo)簽序列。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，可以采用谷胱甘肽-S-移轉(zhuǎn)酶純化標(biāo)簽。在表達(dá)后，可以使用固定的谷胱甘肽通過(guò)親和層析來(lái)分離出包含P0N3或SAA3多肽和谷胱甘肽-S-移轉(zhuǎn)酶的融合蛋白。對(duì)谷胱甘肽-S-移轉(zhuǎn)酶融合蛋白的純化在本領(lǐng)域中是公知的。在分離后，可以以蛋白水解方式切割該融合蛋白，從而產(chǎn)生P0N3或SAA3多肽?？梢韵蛏衔乃龅脑绠a(chǎn)新生兒施用P0N3多肽和/或SAA3多肽。雖然可以單獨(dú)施用P0N3或SAA3多肽，但優(yōu)選使其呈現(xiàn)為藥物組合物(例如，制劑)，所述藥物組合物包含上文定義的P0N3多肽和/或SAA3多肽，以及一種或多種藥物可接受的載劑、佐劑、賦形劑、 稀釋劑、填充劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他材料，以及可選的其他治療藥物或預(yù)防性藥劑。本文所述的包含與一種或多種藥物可接受的載劑、賦形劑、緩沖劑、佐劑、穩(wěn)定劑或其他材料混合或配制在一起的P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物可以用于上文所述的方法中。本發(fā)明的另一方面提供制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供上述P0N3多肽和/或SAA3多肽，和將所述P0N3多肽和/或SAA3多肽與藥物可接受的賦形劑混合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的”是描述在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與受試對(duì)象(例如人或其他哺乳動(dòng)物)的組織接觸且不會(huì)引起過(guò)量的毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)或者其他問(wèn)題或并發(fā)癥的化合物、材料、組合物和/或劑型，具有合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比。各載劑、賦形劑等還必須在與制劑中其他成分相容的意義上也是“可接受的”。適合的載劑、賦形劑等可見(jiàn)于標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)教科書(shū)中，例如，RemingtonJ sPharmaceutical Sciences,第 18 版,Mack Publishing Company,Easton, Pa.，1990?？梢苑奖愕厥怪苿┮詥挝粍┬托问酱嬖?，并且可以用藥學(xué)領(lǐng)域中公知的任何方法來(lái)制備該制劑。此類(lèi)方法包括使P0N3多肽和/或SAA3多肽與可以構(gòu)成一種或多種附屬成分的載劑結(jié)合的步驟。通常，通過(guò)使活性化合物與液體載劑和/或細(xì)分的固體載劑均勻緊密地結(jié)合，并隨后視需要使產(chǎn)品成形，來(lái)制備制劑。優(yōu)選的制劑可以為液體或溶液形式，或者為緩釋植入物或膠囊形式，例如用于口服施用?？梢酝ㄟ^(guò)任何方便的施用途徑向受試對(duì)象施用P0N3多肽、SAA3多肽或者包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)注入靜脈內(nèi)途徑、皮下途徑、鞘內(nèi)途徑或氣管內(nèi)途徑等胃腸外途徑來(lái)進(jìn)行施用。例如，可以通過(guò)注射、特別是靜脈內(nèi)注射來(lái)施用P0N3多肽和/或SAA3多肽。在其他實(shí)施方式中，通過(guò)腸內(nèi)途徑來(lái)進(jìn)行施用，例如，通過(guò)鼻空腸管或氣管內(nèi)管(endotracheal tube)。適合于胃腸外施用(例如通過(guò)注射，包括靜脈內(nèi)注射)的制劑包括水性或非水性的、等滲的、無(wú)致熱原的無(wú)菌注射溶液，該溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定齊U、抑菌劑和使所述制劑與計(jì)劃的接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和水性或非水性的懸液，所述懸液可以包含懸浮劑和增稠劑。用于此類(lèi)制劑中的適合的等滲載質(zhì)的實(shí)例包括氯化鈉注射液、林格氏液或乳酸林格氏注射液。通常，活性化合物在溶液中的濃度為約I μ g/ml 約100mg/ml,例如約 10 μ g/ml 約 50mg/ml。適合于腸內(nèi)施用(例如通過(guò)吞入)的制劑可以呈現(xiàn)為離散單元，例如膠囊劑、扁囊劑或片劑，其中每個(gè)單元都包含預(yù)定量的P0N3多肽和/或SAA3多肽；散劑或顆粒劑；水性或非水性液體中的溶液或懸液；水包油乳液或油包水乳液；推注劑；藥糖劑；或糊劑?？梢钥蛇x地為片劑或膠囊提供腸溶衣，從而使其釋放在腸的各部分中而不是胃中。包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的制劑可以為單位劑量或多劑量封裝的容器(例如，安瓿瓶和小藥水瓶(vial))中，并且可以?xún)?chǔ)存在冷凍干燥(凍干)的條件下，從而僅需在使用前即刻添加無(wú)菌液體載劑(例如注射用水)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到的是，P0N3多肽和/或SAA3多肽以及包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物的適合劑量可以根據(jù)情況而在患者間有所不同。對(duì)最佳劑量進(jìn)行確定會(huì)通常涉 及到在治療益處水平與施用所帶來(lái)的任何風(fēng)險(xiǎn)或有害副作用之間進(jìn)行權(quán)衡。選定的劑量水平將取決于多種因素，包括但不限于施用途徑，施用時(shí)間，P0N3多肽和/或SAA3多肽的排泄率，組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，以及早產(chǎn)兒的成熟度、性別、體重、病況和整體健康情況。P0N3多肽和/或SAA3多肽的量以及施用途徑最終將由醫(yī)師的判斷來(lái)決定，但通常該劑量將實(shí)現(xiàn)足以產(chǎn)生有益效果且不引起較大的有害或有毒副作用的P0N3多肽和/或SAA3多肽的血清濃度。體內(nèi)施用可以以一個(gè)劑量持續(xù)地或間歇性地(例如，具有適當(dāng)間隔的分割的劑量)實(shí)現(xiàn)。確定最有效的施用方式和施用劑量的方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是公知的，并且根據(jù)制劑和受治療的受試對(duì)象而有所變化。用醫(yī)師所選定的劑量水平和方式，可以進(jìn)行單次或多次施用。P0N3多肽和/或SAA3多肽優(yōu)選在早產(chǎn)新生兒分娩后立即或短時(shí)間內(nèi)施用。例如，P0N3多肽和/或SAA3多肽可以在分娩后I小時(shí)內(nèi)、3小時(shí)內(nèi)、6小時(shí)內(nèi)、12小時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)或48小時(shí)內(nèi)施用。在其他實(shí)施方式中，P0N3多肽和/或SAA3多肽可以在出生后超過(guò)48小時(shí)后施用。在分娩后，或者在早產(chǎn)新生兒顯示出一種或多種與P0N3缺乏相關(guān)的癥狀(例如與氧化應(yīng)激有關(guān)的并發(fā)癥)時(shí)，可以預(yù)防性地施用P0N3多肽。在分娩后，或者在早產(chǎn)新生兒顯示出一種或多種與SAA3缺乏相關(guān)的癥狀時(shí)，可以預(yù)防性地施用SAA3多肽。在一些實(shí)施方式中，可以將SAA3多肽施用至未受到機(jī)械通氣和/或肺損傷或炎癥的早產(chǎn)新生兒中。P0N3多肽和/或SAA3多肽以及包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物可以與其他治療劑組合施用，例如上文所述的表面活性劑和類(lèi)固醇。本發(fā)明的其他方面提供用于治療早產(chǎn)新生兒的上述P0N3多肽和/或SAA3多肽，以及P0N3多肽和/或SAA3多肽在制造用于治療早產(chǎn)新生兒的藥物中的應(yīng)用。如上文所述，使用P0N3多肽和/或SAA3多肽對(duì)早產(chǎn)新生兒進(jìn)行的治療可以減小死亡和/或患病的程度、嚴(yán)重性或風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的其他各方面和實(shí)施方式將因本公開(kāi)內(nèi)容而對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言變得顯而易見(jiàn)。將本說(shuō)明書(shū)中提及的所有文獻(xiàn)都通過(guò)援弓I完整地并入本文。將在申請(qǐng)日時(shí)具有數(shù)據(jù)庫(kù)(例如Genbank)登錄號(hào)的上述序列也通過(guò)援引完整地并入本文。本文所用的“和/或”應(yīng)理解為對(duì)兩種具體特征或組成部分中的每一個(gè)或兩個(gè)的具體公開(kāi)。例如“A和/或B”應(yīng)理解為對(duì)⑴A、(ii)B和(iii)A和B中的每一個(gè)的具體公開(kāi)，相當(dāng)于在本文中對(duì)每個(gè)都進(jìn)行了單獨(dú)敘述。除非上下文另有說(shuō)明，否則上文所述的對(duì)特征的描述和定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓绞?，并且等同地適用于所描述的所有方面和實(shí)施方式。下文將通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖
來(lái)闡明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方式。圖I顯示了用于鑒定在妊娠后期胎兒中發(fā)生上調(diào)或下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本的實(shí)驗(yàn)方案。
圖2顯示了對(duì)在起始陣列中所用大鼠的同胞的肺組織(A)、腸(B)和肝(C)中的與18S RNA相對(duì)的Pon3mRNA的RT-PCR分析的結(jié)果，對(duì)在孕齡為16天和20天時(shí)分娩的大鼠進(jìn)行了比較(二者均為η=ιο，每只動(dòng)物來(lái)自一次獨(dú)立的產(chǎn)崽)。P值使用學(xué)生未配對(duì)T檢驗(yàn)比較了給定組織中的在兩個(gè)孕齡時(shí)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的Pon3轉(zhuǎn)錄本水平(相對(duì)于18S RNA)。圖3顯示了對(duì)妊娠期最后1/3的不同孕齡(每組中n=5)的羊的肺㈧和腸⑶中的相對(duì)于四種管家基因的幾何平均值的P0N3mRNA的RT-PCR分析的結(jié)果。柱=平均值；條=SEM。P值來(lái)自對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的Pon3轉(zhuǎn)錄本水平(相對(duì)于四種管家基因)對(duì)孕齡的線(xiàn)性回歸。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)P在A中為O. 94，在B中為O. 79，兩者的P都小于O. 001。圖C和D是對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的Pon3水平對(duì)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的皮質(zhì)醇值的作圖。P值來(lái)自對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的Pon3水平對(duì)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的皮質(zhì)醇的線(xiàn)性回歸。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)P在C中為O. 94，在D中為O. 80，兩者的P都小于O. 001。圖4顯示了對(duì)130天孕齡的經(jīng)地塞米松處理的羊和對(duì)照羊(每組中n=5)的肺和腸中的P0N3 mRNA的PR-PCR分析的結(jié)果。柱=平均值；條=SEM。顯示了相對(duì)于四種管家基因的幾何平均值的P0N3 mRNA水平。圖5顯示了對(duì)經(jīng)歷了未足月時(shí)(115dGA 188dGA)腎上腺切除術(shù)的羊和對(duì)照羊的肺和腸中的P0N3 mRNA的PR-PCR分析的結(jié)果，這兩組均在145天孕齡時(shí)分娩(每組中n=5)。柱=平均值；條=SEM。顯示了相對(duì)于四種管家基因的幾何平均值的P0N3mRNA水平。圖6顯示了對(duì)成體血液(Ad)和來(lái)自4個(gè)早產(chǎn)兒和4個(gè)足月嬰兒的臍帶血中的P0N3的蛋白質(zhì)印跡分析，比較了使用不同的商購(gòu)抗體的情況(上圖)。還顯示了對(duì)信號(hào)的密度計(jì)量結(jié)果，從而對(duì)足月和早產(chǎn)進(jìn)行了比較(下圖)。圖7顯示了對(duì)孕齡為16天和20天時(shí)的大鼠的肺(A和C)和腸(B和D)的蛋白質(zhì)印跡分析。圖A和B采用了對(duì)P0N3有特異性的抗體。圖C和D采用了分別與A和B相同的印跡，對(duì)其進(jìn)行剝離，并用對(duì)GAPDH有特異性的抗體再次探測(cè)。圖A和C :泳道I和2為來(lái)自16dGA的肺，泳道3和4為來(lái)自20dGA的肺。圖B和D :泳道I和2=合并了來(lái)自16dGA的小腸和大腸；泳道3和4=來(lái)自20dGA的小腸；泳道5和6=來(lái)自20dGA的大腸。圖8A顯示了對(duì)來(lái)自8個(gè)早產(chǎn)兒和10個(gè)足月嬰兒的臍帶血清中的P0N3的蛋白質(zhì)印跡分析。圖8B顯示了對(duì)信號(hào)的密度計(jì)量結(jié)果，從而對(duì)足月和早產(chǎn)進(jìn)行了比較。P值為對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的密度計(jì)量值，用學(xué)生未配對(duì)T檢驗(yàn)比較了早產(chǎn)和足月。表I示出了用于在羊中進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR的引物和探針。
表2示出了在基因陣列上選定轉(zhuǎn)錄本在16天和20天孕齡(dGA)之間的倍數(shù)變化。實(shí)駘方法動(dòng)物樣品所有實(shí)驗(yàn)程序都是按照《英國(guó)動(dòng)物(科學(xué)程序)法案1986》在適合的內(nèi)政部執(zhí)照下且在當(dāng)?shù)貍惱韺彶檫^(guò)程的許可下進(jìn)行的。用過(guò)量CO2將孕齡(dGA)為16天(n=10)和20天(n=10)的交配20次的懷孕Wistar
大鼠無(wú)痛處死，其中將陰栓日(day of plug)定義為第O天，而足月期是21天。使用剖腹生產(chǎn)術(shù)使幼崽分娩，通過(guò)頸椎脫位術(shù)將其無(wú)痛處死，并在解剖顯微鏡下摘除它們的器官。將來(lái)自多個(gè)同胞動(dòng)物的組織在液氮中急速冷凍，隨后儲(chǔ)藏在_80°C下以用于后續(xù)的分析。對(duì)羊進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)按之前所詳細(xì)描述的進(jìn)行7。簡(jiǎn)言之，將孕齡已知的懷孕威爾士山脈母羊置于單獨(dú)的圍欄中，并以200g/日的精料維持，且可以自由獲取干草、水和舐食巖鹽塊。為了研究孕齡對(duì)基因表達(dá)的影響，在孕期的第100天(n=5)、第114 116天(n=5)、第129 131天(n=5)和第144 145天(n=5)(足月期為145±2天)在全身麻醉(靜脈內(nèi)施用20mg/kg的戊巴比妥鈉)下用剖腹生產(chǎn)術(shù)使正常胎畜分娩，以便進(jìn)行組織收集。為了研究對(duì)足月時(shí)出現(xiàn)的內(nèi)源皮質(zhì)類(lèi)固醇的正常上升進(jìn)行阻止所造成的影響，在第116 120dGA時(shí)在全身麻醉(在I: I的O2:N2O中的I. 5%氟烷)下對(duì)胎兒(n=5)進(jìn)行腎上腺切除，隨后使其足月分娩。之前已顯示，這會(huì)使皮質(zhì)醇水平降低到正常足月水平的15%。為了研究母體糖皮質(zhì)激素處理的效果，用兩份劑量的12mg地塞米松或者用鹽水從125dGA開(kāi)始24小時(shí)時(shí)處理母羊(每組n=5)，在第二次注射后10小時(shí)，用剖腹生產(chǎn)術(shù)使胎兒分娩。在所有情況中，新生的羊在分娩后立即用戊巴比妥鈉(200mg/kg)無(wú)痛處死。在分娩后獲得臍帶血。使用經(jīng)驗(yàn)證可用于綿羊血漿的放射免疫測(cè)定2°，測(cè)量了皮質(zhì)醇濃度。皮質(zhì)醇的最小可檢測(cè)量是I. 5ng/ml,測(cè)定間變動(dòng)系數(shù)為11%。在尸體剖檢過(guò)程中，將胎兒的肺和空腸(幽門(mén)括約肌和回腸-盲腸連接處之間的中部)的樣品在液態(tài)中冷凍，并儲(chǔ)藏在_80°C直至進(jìn)行分析。人臍帶血樣品用于獲得人臍帶血的操作規(guī)程已得到劍橋本地第2研究倫理委員會(huì)的許可。所有的女性都提供了書(shū)面通知的同意書(shū)。早產(chǎn)兒如果在孕齡完成了 24 28周時(shí)活產(chǎn)，則適于進(jìn)行研究。將足月期定義為大于等于37周。RNA抽提和cDNA合成使用·ΓΚ ζ Γ_ (Invitrogen, Paisley,英國(guó))根據(jù)制造商的使用說(shuō)明從冷凍的組織中分離出總RNA,并且用DNaseI (Promega, Southampton,英國(guó))在37 °C下處理30分鐘。添加終止溶液并在65°C下加熱10分鐘來(lái)使反應(yīng)終止。使用分光光度計(jì)和Agilent2100Bioanalyzer確認(rèn)了 RNA的完整性。僅將OD 260/280〉I. 8的RNA用于定量PCR，并將RNA完整性指數(shù)大于7的RNA用于陣列雜交。在定量RT-PCR中，使用隨機(jī)六聚體弓I物(Bioline，倫敦，英國(guó))和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, Paisley,英國(guó))將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。微陣列分析采用了 Affymetrix大鼠基因組230. 2基因芯片。使用標(biāo)準(zhǔn)Affymetrix雙循環(huán)靶標(biāo)標(biāo)記和雜交操作規(guī)程對(duì)總RNA進(jìn)行了加工。使用魯棒性多陣列平均技術(shù)(robustmultiarray averaging)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了預(yù)標(biāo)準(zhǔn)化,并使用LIMMA軟件包(微陣列數(shù)據(jù)的線(xiàn)性模型，http://bioinf.wehi.edu.au/limma/)實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)化。使用兩種獨(dú)立的方法，即Cyber-T算法和排名結(jié)果(Rank Product)分析21’22，在16dGA和20dGA之間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。Cyber-T算法是通過(guò)包含基于數(shù)據(jù)集中其他轉(zhuǎn)錄本的方差的貝葉斯先驗(yàn)信息(Bayesian prior)而修飾過(guò)的未配對(duì)T檢驗(yàn)。將使用Cyber-T (貝葉斯P值〈O. 001，差異表達(dá)的后驗(yàn)概率>0.99)和排名結(jié)果分析(P〈0.0001)時(shí)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的轉(zhuǎn)錄本鑒定為是差異表達(dá)的。使用NetAffx 分析中心(AfTymetrix)對(duì)微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行了注釋。大鼠cDNA的定量實(shí)時(shí)RT-PCR所有實(shí)時(shí)PCR都是在ABIPrism 7900HT 系統(tǒng)(Applied Biosystems, Warrington,、英國(guó))上完成的，并且是在含有IOOng cDNA模板、I XABI PCR Mix No AmpEraseUNG (Applied Biosystems, Warrington,英國(guó))和為對(duì)氧憐酶 3 (Pon3)和 18S 預(yù)先設(shè)計(jì)并預(yù)先優(yōu)化的基因表達(dá)測(cè)定試劑(購(gòu)自Applied Biosystems,分別為Rn01500926_ml和Rn00824548_ml)的IOyl體積中進(jìn)行。這些專(zhuān)賣(mài)的引物-探針組的序列未知。PCR循環(huán)包括在95°C下進(jìn)行20秒的起始變性，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95°C下I秒和60°C下20秒。對(duì)所有樣品都以三等分試樣進(jìn)行分析。使用ddCt法對(duì)相對(duì)于18S的表達(dá)水平進(jìn)行了定量。羊cDNA的克隆和定量實(shí)時(shí)RT-PCR由于綿羊Pon3基因的序列尚未公開(kāi)，發(fā)明人使用牛Pon3mRNA (nm_001075479)在NCBI表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了搜索。該搜索鑒定出了與?；虻耐恍猿^(guò)95%的若干羊EST。為了克隆推定的羊Pon3cDNA的片段，發(fā)明人使用了顯示出最高同源性的兩個(gè)EST (EE859920和EE792195)來(lái)設(shè)計(jì)PCR方案。引物如下正向(5' -CCCTAGTCGGGGAGAGATTT-3 ')，反向(5 ' -TTCTATGCCACCAGAGACCA-3 ')。所用的模板是從胎羊的腸產(chǎn)生的cDNA。PCR在含有最終濃度為I. 25nM的MgCl2、200ii M的每種dNTP、800nM的每種引物和0. I單位/ Ul的BioTaq DNA聚合酶(Bioline，倫敦，英國(guó))的50 u I中進(jìn)行。PCR程序的組成如下，在95°C下進(jìn)行5分鐘的起始變性，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95°C下45秒、60°C下45秒、72°C下60秒，和72°C下10分鐘的最終延伸步驟。在I. 5%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，切下具有預(yù)期大小的條帶并使用Qiaquick 凝膠抽提試劑盒(Qiagen, Crawley,英國(guó))進(jìn)行純化,隨后將其克隆至pGEM-T-Easy 質(zhì)粒(Promega)中。測(cè)序驗(yàn)證了三個(gè)克隆。使用對(duì)綿羊P0N3克隆的部分cDNA和公眾可獲得的綿羊管家基因序列數(shù)據(jù)(NCBI)用Applied Biosystems File Builder 3. I設(shè)計(jì)了米用帶6-FAM標(biāo)記的大溝結(jié)合劑(MGB)探針的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定(表I)。針對(duì)四種管家基因(18S、GAPDH、親環(huán)素A和￠-肌動(dòng)蛋白)的幾何平均值對(duì)Pon3進(jìn)行了相對(duì)定量，這是因?yàn)榘l(fā)明人在羊中觀察到了更大的動(dòng)物間變化性，并且該方法據(jù)報(bào)道優(yōu)于使用任何單一參照基因23。PCR在含有IOOng cDNA模板、IX TaqMan Fast Universal PCR Mix No AmpErase UNG(Applied Biosystems, Warrington,英國(guó))和定制設(shè)計(jì)的引物-探針組的10 體積中進(jìn)行。PCR循環(huán)包括在95°C下進(jìn)行20秒的起始變性，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95°C下I秒和60°C下20秒。使用參照樣品的梯度稀釋液為每個(gè)測(cè)定制作了相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并且用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法分析結(jié)果。蛋白質(zhì)印跡
為了分析大鼠腸中的Pon3蛋白表達(dá)，使用玻璃勻漿器在每IOml含有I片Complete Mini無(wú)EDTA蛋白酶抑制劑混合片劑(Roche)的IXRIPA緩沖液(Millipore)中使冷凍的組織均質(zhì)化。使用BioRad DC蛋白測(cè)定來(lái)確定蛋白濃度。通過(guò)添加Nupage樣品還原劑(Invitrogen)來(lái)還原含有20 y g蛋白的樣品，使之熱變性并將其加載到10%NovexBis-Tris凝膠(Invitrogen)上。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Invitrogen)上，用TBS-tween-20 (0. 05%)中的5%脫脂奶封閉I小時(shí)，隨后在振蕩器上用0. 2 u g/ml的山羊多克隆抗人Pon3抗體(Lifespan Biosciences)于4°C過(guò)夜探測(cè)。用偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶的兔抗山羊二抗(DAKO)檢測(cè)抗體結(jié)合。隨后使用ECL底物(Amersham Biosciences)來(lái)使結(jié)合可視化。用Restore 蛋白質(zhì)印跡剝離緩沖液(Pierce)在室溫下對(duì)膜進(jìn)行15分鐘的剝離，隨后用0. 2 u g/ml的針對(duì)人GAPDH的兔多克隆抗體再次探測(cè)，從而確認(rèn)等量的蛋白載量。

為了分析人胎兒中的Pon3表達(dá)，將臍帶血樣品收集在肝素鋰管中，并通過(guò)在4 °C下以3000rpm離心10分鐘來(lái)進(jìn)行分離。將血清樣品以1:10稀釋在PBS中，通過(guò)添加Nupage樣品還原劑(Invitoogen)來(lái)進(jìn)行還原，隨后使之熱變性。將3 iU以1:10稀釋的樣品加載至Ij 10%Novex Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Invitrogen)上，用PBS-tween20 (0. 05%)中的5%脫脂奶封閉I小時(shí)，隨后按上文所述用抗人Pon3抗體(LifespanBiosciences, LB)進(jìn)行探測(cè)。對(duì)蛋白質(zhì)印記再次探測(cè)來(lái)確認(rèn)等量的載量并不是必要的，因?yàn)樗杏镜蓝驾d有等體積的血清。因此，并沒(méi)有與蛋白抽提效率的變化性或與蛋白濃度測(cè)量有關(guān)的干擾。通過(guò)用麗春紅S對(duì)印跡進(jìn)行染色來(lái)估算總蛋白。統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)轉(zhuǎn)錄本和皮質(zhì)醇的水平進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，隨后使用學(xué)生未配對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)平均值進(jìn)行比較。使用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)和線(xiàn)性回歸來(lái)評(píng)估兩個(gè)連續(xù)變量之間的關(guān)聯(lián)。在P〈0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，且所有的P值都是雙側(cè)的。結(jié)果總結(jié)發(fā)明人研究了大鼠和羊的肺和腸，它們?cè)诜N系發(fā)生上關(guān)系甚遠(yuǎn)。在這兩種哺乳動(dòng)物的全部?jī)煞N組織中的上調(diào)說(shuō)明該基因在哺乳動(dòng)物(通常包括人)出生的系統(tǒng)性準(zhǔn)備中很重要,例如在防御氧化應(yīng)激中很重要。發(fā)明人研究了多種不同孕齡，還研究了皮質(zhì)類(lèi)固醇在羊中的效果，這是因?yàn)檫@些因素與準(zhǔn)備出生的胎兒中多種關(guān)鍵過(guò)程的上調(diào)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)方案示于圖I中。陣列實(shí)驗(yàn)顯示了編碼對(duì)氧磷酶3的mRNA在第16天和第20天之間在肺(24倍)和腸(31倍)中的上調(diào)。使用定量TaqMan RT-PCR進(jìn)行的樣本外驗(yàn)證(out of samplevalidation)確認(rèn)了來(lái)自獨(dú)立系列的動(dòng)物的肺和腸中(圖2A和2B)以及肝中(圖2C)的相似幅度的變化。隨后，發(fā)明人克隆了羊的P0N3cDNA的片段，設(shè)計(jì)了用于RT-PCR的引物和探針，并使用定量TaqMan RT-PCR分析了四組動(dòng)物(每組有5只在孕期最后1/3期間分娩的動(dòng)物)的P0N3 mRNA水平。小腸樣品取自幽門(mén)括約肌和回腸-盲腸連接處之間的中點(diǎn)。P0N3 mRNA隨著孕齡的推進(jìn)而線(xiàn)性增加，并且全部?jī)煞N組織中的變化具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在肺和腸中(圖3A和3B)都觀察到了約5倍的上調(diào)。
發(fā)明人研究了在暴露于外源合成皮質(zhì)類(lèi)固醇(地塞米松)和載質(zhì)的早產(chǎn)羊胎兒中P0N3的表達(dá)。該研究顯示出，皮質(zhì)類(lèi)固醇使肺和腸中的P0N3mRNA增加，但是由于樣本間的變化性較大，該差異在腸中不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖4A和4B)。隨后，發(fā)明人在足月(145天)分娩的動(dòng)物中檢驗(yàn)了內(nèi)源皮質(zhì)類(lèi)固醇對(duì)P0N3mRNA水平的影響。將對(duì)照動(dòng)物與在孕齡約115 118天時(shí)通過(guò)腎上腺切除術(shù)阻止了孕后期內(nèi)源皮質(zhì)類(lèi)固醇增加的動(dòng)物進(jìn)行了比較。腎上腺切除與足月時(shí)的全部?jī)煞N組織的較低P0N3mRNA相關(guān)，但是該差異也因較大的樣品間變化性而在腸中不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖5A和5B)。這些結(jié)果顯示在大鼠和羊的肺和腸中的R0N3mRNA在出生前發(fā)生上調(diào)。隨后，通過(guò)獲得臍帶血(在4個(gè)早產(chǎn)兒和4個(gè)足月出生的嬰兒出生時(shí)獲得)，發(fā)明人比較了在早產(chǎn)人胎兒和足月人胎兒中循環(huán)的P0N3的水平。足月嬰兒中的P0N3蛋白水平與成年人的相仿，但是早產(chǎn)兒的臍帶血中的P0N3表達(dá)水平卻較低(圖6)。
孕后期的大鼠胎兒中的Pon3表達(dá)肺和腸中的微陣列分析均展示在陣列上在16dGA和20dGA之間上調(diào)大于20倍的四種基因(表2):血清淀粉樣蛋白A3、對(duì)氧磷酶3 (Pon3)、溶質(zhì)運(yùn)載家族34成員2和細(xì)胞內(nèi)氯離子通道5。相比之下，Pon基因家族的另兩個(gè)成員(Ponl和Pon2)的表達(dá)沒(méi)有顯著變化。發(fā)明人通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析了陣列中所用的動(dòng)物的同胞動(dòng)物的Pon3的表達(dá)，確認(rèn)了在大鼠肺、腸和肝中Pon3mRNA在16dGA和20dGA之間的上調(diào)(圖2)。對(duì)16dGA和20dGA時(shí)的大鼠肺和腸的蛋白質(zhì)印記分析顯示出，Pon3蛋白在16dGA時(shí)檢測(cè)不到，但是在20dGA時(shí)存在具有恰當(dāng)分子量的清晰條帶(圖7)。胎羊中的Pon3表達(dá)由于綿羊P0N3基因序列尚未公開(kāi)，發(fā)明人克隆了直系同源綿羊基因的部分cDNA。發(fā)明人獲得了在核苷酸水平上與牛Pon3的同源性為96%且與人Pon3的同源性為87%的505bp序列。相比之下，該序列與牛PONl的同源性(62%)和與牛P0N2的同源性(70%)較低。使用該克隆序列設(shè)計(jì)了定量RT-PCR方案(表2)。隨后，發(fā)明人分析了 P0N3在四組動(dòng)物中的表達(dá)，其中每組具有5只在孕期最后1/3期間分娩的動(dòng)物。在肺和腸中，P0N3表達(dá)均隨著孕齡的推進(jìn)(圖3A和3B)和皮質(zhì)醇水平的增加(圖3C和3D)而線(xiàn)性增加，且所有變化都具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。隨后，發(fā)明人對(duì)暴露于外源合成皮質(zhì)類(lèi)固醇(地塞米松)或載質(zhì)的早產(chǎn)羊胎兒進(jìn)行了比較。該比較顯示出，地塞米松使肺和腸中的P0N3表達(dá)均增加，但是由于樣本間的變化性較大，該差異在腸中不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖4A和4B)。隨后，通過(guò)將對(duì)照足月動(dòng)物與在115 IlSdGA時(shí)進(jìn)行了胎兒腎上腺切除的足月動(dòng)物進(jìn)行比較，發(fā)明人檢驗(yàn)了對(duì)正常的孕后期內(nèi)源糖皮質(zhì)激素升高的阻斷給足月(145天)分娩的動(dòng)物的P0N3表達(dá)帶來(lái)的影響。腎上腺切除與足月時(shí)的兩種組織的較低P0N3表達(dá)均有關(guān)，但是該差異也因較大的樣品間變化性而在腸中不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖4C和4D)。人臍帶血中的Pon3蛋白使用對(duì)人臍帶血清的蛋白質(zhì)印跡,可檢測(cè)到具有適合大小的P0N3條帶。對(duì)8個(gè)早產(chǎn)兒和10個(gè)足月嬰兒的臍帶血清的P0N3水平進(jìn)行了比較。早產(chǎn)兒的平均孕齡為27周零3天，平均出生體重為986g。4個(gè)為正常分娩，4個(gè)通過(guò)剖腹生產(chǎn)術(shù)分娩。一個(gè)嬰兒在出生前已接受單劑量的倍他米松，而其余全部嬰兒則完成了出生前類(lèi)固醇療程。在8個(gè)嬰兒中，有6個(gè)的起始CRP小于5mg/l，有2個(gè)的起始CRP更高(14mg/l和68mg/l)。在出生后測(cè)試的第一個(gè)樣品中，沒(méi)有一個(gè)嬰兒具有陽(yáng)性血培養(yǎng)或陽(yáng)性CSF培養(yǎng)。足月時(shí)的P0N3水平更高，達(dá)6.3倍(圖8)。如果表達(dá)相對(duì)于總蛋白(通過(guò)麗春紅S染色來(lái)估算)的P0N3，足月時(shí)的水平高達(dá)4. 9倍，而且對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的平均值的比較結(jié)果保持了高的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P〈0. 001)。在陣列上的28，532個(gè)基因中，僅有4個(gè)在孕后期大鼠的肺和腸中的上調(diào)超過(guò)20倍，對(duì)氧磷酶3是其中之一。該上調(diào)在同胞動(dòng)物中得到了驗(yàn)證。之前的研究還顯示出，在人類(lèi)中，P0N3主要在肝中表達(dá)24，而且，發(fā)明人還觀察到了在孕后期大鼠中Pon3在該器官中的上調(diào)。蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)了蛋白水平上的上調(diào)。發(fā)明人確認(rèn)了在胎羊(種系發(fā)生上遠(yuǎn)距離的哺乳動(dòng)物物種)中P0N3 mRNA在孕期最后1/3期間發(fā)生明顯的系統(tǒng)性上調(diào)。此外，像表面活性劑一樣19，胎羊P0N3 mRNA的表達(dá)受到糖皮質(zhì)激素的控制，這可以在下述現(xiàn)象中得到證實(shí)與內(nèi)源皮質(zhì)醇水平的強(qiáng)相關(guān)性，在母體已接受了地塞米松的早產(chǎn)動(dòng)物中表達(dá)升高，在115 118dGA時(shí)接受了腎上腺切除術(shù)的足月胎兒中表達(dá)下降。P0N3在血液中與低密度脂蛋白關(guān)聯(lián)地循環(huán)25。因此，通過(guò)測(cè)量臍帶血清濃度，發(fā)明人能夠研究該蛋白是否在孕后期的 人嬰兒中也上調(diào)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管所研究的8個(gè)早產(chǎn)兒中有7個(gè)曾接受完整的出生前倍他米松療程，但足月出生的人嬰兒的P0N3水平更高，超過(guò)6倍。從這些分析中發(fā)明人得到如下結(jié)論在大鼠、羊和人的胎兒中都觀察到的P0N3上調(diào)可能是出生的系統(tǒng)性準(zhǔn)備過(guò)程，且受到糖皮質(zhì)激素的控制。對(duì)氧磷酶家族由編號(hào)為I 3的3種蛋白組成。編碼這些蛋白的基因位于人類(lèi)染色體7q21_22上的簇中，具有約65%的同源性。全部三種蛋白都是水解酶，具體而言，水解多種內(nèi)酯和羥基酸。兩項(xiàng)研究表明，P0N3作為抗氧化劑起作用。已發(fā)現(xiàn)，P0N3(而非P0N2)保護(hù)低密度脂蛋白(LDL)不發(fā)生銅誘導(dǎo)的體外氧化25。最近的研究表明，人Pon3在小鼠骨骼肌中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與四氯化碳(CCl4)的肝毒素效應(yīng)下降有關(guān)26。施用CCl4會(huì)通過(guò)肝內(nèi)誘導(dǎo)自由基而引起肝損傷。轉(zhuǎn)基因的人P0N3使脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低，并且減少了 CCl4引起的肝損傷的生物化學(xué)和組織學(xué)現(xiàn)象。此外，轉(zhuǎn)基因的人Pon3使內(nèi)源抗氧化劑谷胱甘肽和過(guò)氧化物歧化酶的正常肝內(nèi)水平得到保持，而這兩者在對(duì)照動(dòng)物中都發(fā)生了消耗。另?yè)?jù)顯示，人Pon3在小鼠中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)抑制粥樣硬化病變形成和肥胖27。P0N3在孕后期大鼠胎兒中的上調(diào)的系統(tǒng)性特征表示其具有為不同器官中的不同細(xì)胞類(lèi)型所需的某種作用。此外，Pon3在孕后期大鼠和羊中的系統(tǒng)性上調(diào)現(xiàn)象表示該上調(diào)與出生前后的各種哺乳動(dòng)物物種所共有的過(guò)程有關(guān)。出生后，在所有哺乳動(dòng)物物種中動(dòng)脈氧分壓快速上升。在羊中，胎兒動(dòng)脈血中的氧分壓為約18 28mmHg，在出生后幾分鐘內(nèi)，該分壓上升至約lOOmmHg28。出生后氧張力的升高是心血管系統(tǒng)進(jìn)行出生后適應(yīng)(例如促進(jìn)動(dòng)脈導(dǎo)管的閉合16a和提高肺血流3°)的關(guān)鍵觸發(fā)因素。然而，氧張力的快速上升能夠?qū)е庐a(chǎn)生反應(yīng)性氧物種(ROS)，可以將其定義為描述“出現(xiàn)在生理環(huán)境中的氧的所有氧化態(tài)和激發(fā)態(tài)，最高從超氧化物開(kāi)始，但不包括水”31。鑒于出生后氧分壓的急劇上升，新生兒可能暴露于出生后ROS的增量生成。鑒于Pon3的抗氧化劑效果，由于對(duì)出生后立即限制氧化應(yīng)激的共同需要，該酶在孕后期的系統(tǒng)性上調(diào)可能在多種物種中是保守性的。早產(chǎn)與死亡率和患病率的升高相關(guān)。這與以下事實(shí)有關(guān)嬰兒在新生生命的正常準(zhǔn)備性變化前出生，而這些變化出現(xiàn)在孕后期的胎兒中。表面活性劑療法是成功的臨床措施的實(shí)例，其基于為早產(chǎn)兒補(bǔ)充通常在孕后期上調(diào)的物質(zhì)。這些結(jié)果說(shuō)明，向早產(chǎn)的人類(lèi)新生兒施用P0N3可能因此改善早產(chǎn)的后果并提供抵抗上述早產(chǎn)兒并發(fā)癥的保護(hù)。P0N3的關(guān)鍵性質(zhì)是其出現(xiàn)在血清中。首先，這允許我們通過(guò)測(cè)量獲自臍帶血樣的血清中的水平來(lái)確認(rèn)人嬰兒中的上調(diào)。其次，如果P0N3在新生兒中的作用在部分上由該蛋白循環(huán)水平的升高的介導(dǎo)， 這表示向早產(chǎn)新生兒靜脈內(nèi)施用外源Pon3可以是有益的。這些解釋得到了上述小鼠中轉(zhuǎn)基因人P0N3研究的支持。Pon3在骨骼肌中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致血液中Pon3內(nèi)酯酶活性升高，這與CCl4所誘導(dǎo)的肝中自由基生成效應(yīng)的下降有關(guān)26。因此，這些觀察支持了循環(huán)中的Pon3的系統(tǒng)性效果。對(duì)不同的對(duì)氧磷酶的生物化學(xué)研究表明，雖然三種亞型具有一些相同的底物，但它們每一個(gè)還能夠水解特定的底物32。在孕后期的大鼠肺和腸中，還有另外3種基因的上調(diào)超過(guò)20倍。其中兩種是離子通道(溶質(zhì)運(yùn)載家族34成員2和細(xì)胞內(nèi)氯離子通道5)。因此，這兩者均不是潛在的候選替代性治療劑，但是它們?cè)谠泻笃诘南到y(tǒng)性的、有意義的上調(diào)表明它們可能在出生前后的適應(yīng)過(guò)程中有重要作用。另外一個(gè)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本，血清淀粉樣蛋白A3，是急性期蛋白。先前的研究已涉及了機(jī)械通氣、內(nèi)毒素和糖皮質(zhì)激素對(duì)該蛋白在胎羊中的表達(dá)的影響33_35。然而，本文首次顯示出在孕后期大鼠胎兒中的轉(zhuǎn)錄本水平上的生理上調(diào)。因此，血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)也代表了早產(chǎn)新生兒中的候選新型療法。參考文獻(xiàn)(I)Steer P. 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1141 aaactgataa ttgtatgata agtggcactg taagtaaata gcaaacacca aaaaaaaaaa1201 aSEQ ID NO:l(Genbank NM_000940. 2 GI:94538355)I mgklvalvll gvglslvgem flafrervna srevepvepe nchlieeles gsedidilps61 glafissglk ypgmpnfapd epgkiflmdl neqnpraqal eisggfdkel fnphgisifi121 dkdntvylyv vnhphmkstv eifkfeeqqr slvylktikh ellksvndiv vlgpeqfyat181 rdhyftnsll sffemildlr wtyvlfyspr evkvvakgfc sangitvsad qkyvyvadva 241 aknihimekh dnwdltqlkv iqlgtlvdnl tvdpatgdil agchpnpmkl lnynpedppg301 sevlriqnvl sekprvstvy anngsvlqgt svasvyhgki ligtvfhktl ycelSEQ ID N0:2(Genbank NP_000931. IGI:29788996)ATGGGGAAGCTCGTGGCGCTGGTCCTGCTGGGGGTCGGCCTGTCCTTAGTCGGGGAGATGTTTCTGGCGTTTAGAGAAAG 80GGTGAATGCCTCTCGAGAAGTGGAGCCAGTAGAACCTGAAAACTGCCACCTTATTGAGGAACTTGAAAGTGGCTCTGAAG 160ATATTGATATACTTCCTAGTGGGCTGGCTTTTATCTCCAGT
G Tes&mmaTtte&mumcaamMmmmm mmSG8C*TCCSCCT E*IQJWSS GATTAAAATATCCAGGCATGCCAAACTTTGCGCCAGATGAACCAGGAAAAATCTTCTTGA 400 TGGATCTGAATGAACAAAACCCAAGGGCACAAGCACTAGAAATCAGTGGTGGATTTGACAAAGAATTATTTAATCCACAT 480GGGATCAGTATTTTCATCGACAAAGACAATACTGTGTATCTTTATGTTGTGAATCATCCCCACATGAAGTCCACTGTGGA 560GATATTTAAATTTGAGGAACAACAACGTTCTCTGGTATACCTGAAAACTATAAAACATGAACTTCTCAAAAGTGTGAATG 640ACATTGTGGTTCTTGGACCAGAACAGTTCTATGCCACCAGAGACCACTATTTTACCAACTCCCTCCTGTCATTTTTTGAG 720ATGATCTTGGATCTTCGCTGGACTTATGTTCTTTTCTACAGCCCAAGGGAGGTTAAAGTGGTGGCCAAAGGATTTTGTAG 800TGCCAATGGGATCACAGTCTCAGCAGACCAGAAGTATGTCTATGTAGCTGATGTAGCAGCTAAGAACATTCACATAATGG 880AAAAACATGATAACTGGGATTTAACTCAACTGAAGGTGATACAGTTGGGCACCTTAGTGGATAACCTGACTGTCGATCCT 960GCCACAGGAGACATTTTGGCAGGATGCCATCCTAATCCTATGAAGCTACTGAACTATAACCCTGAGGACCCTCCAGGATC 1040AGAAGTACTTCGCATCCAGAATGTTTTGTCTGAGAAGCCCAGGGTGAGCACCGTGTATGCCAACAATGGCTCTGTGCTTC 1120AGGGCACCTCTGTGGCTTCTGTGTACCATGGGAAAATTCTCATAGGCACCGTATTTCACAAAACTCTGTACTGTGAGCTC 1200TAG 1203SEQ ID N0:3P0N3長(zhǎng)異構(gòu)核苷酸序列(額外序列以黑體示出)MGKLVALVLLGVGLSLVGEMFLAFRERVNASREVEPVEPENCHLIEELESGSEDIDILPSGLAFIS
S wmsasmsMtc 80GLKYPGMPNFAPDEPGKIFLMDLNEQNPRAQALEISGGFDKELFNPH 160GISIFIDKDNTVYLYVVNHPHMKSTVEIFKFEEQQRSLVYLKTIKHELLKSVNDIVVLGPEQFYATRDHYFTNSLLSFFE 240
MILDLRWTYVLFYSPREVKVVAKGFCSANGITVSADQKYVYVADVAAKNIHIMEKHDNWDLTQLKVIQLGTLVDNLTVDP 320ATCDILAGCHPNPMKLLNYNPEDPPGSEVLRIQNVLSEKPRVSTVYANNGSVLQGTSVASVYHGKILIGTVFHKTLYCEL 400SEQ ID NO:4P0N3長(zhǎng)異構(gòu)氨基酸序列(額外序列以黑體示出)I aacttgaaac agaatgtgta ttatccttgg ttgtgtttcc ttggccctgc agcaggatga61 agctctcctc tggcatcatt ttctgctccc tggtcctggg tgtcagcagc caaggatggt121 taacattcct caaggcagct ggccaaggga ctaaagacat gtggaaagcc tactctgaca181 tgaaagaagc caattacaaa aaattcagac aaatacttcc atgcttgggg gaactatgat241 gctgtacaaa gggggcttgg ggctgtctgg gctacagaag tgatcaggta atgcacattc301 ctgatgttgc caggaatgag tgagcagagc ttgactgcct tggacagtca ggagagagcg361 atgccagaga gaacgtccag agactcacag gagaccatgc agaggattcg ctggctggcc421 aggctaccaa caaatggggc cagagtggca aagaccccaa tcacttccga cctgctggcc481 tgccagagaa atactgagct tccttttcaa tctgctctca ggagacctgg ctgtgagccc541 ctgagggcag ggacatttgt tgacctacag ttactgaatt ctatatccct agtacttgat601 atagaacaca taaaaatgct taataaatgc ttgtgaaatc caaaaaaaaa aaaaaSEQ ID N0:5 人 SAA3 核苷酸序列(AY209188. IGI: 28864697)lmklssgiifc slvlgvssqg wltflkaagq gtkdmwkays dmkeanykkf rqilpclgelSEQ ID NO: 6 人 SAA3 氨基酸序列(AA048437. IGI: 28864698)Ovine Pon3 CCCTAGTOGGGGAGAGATTTTTGACATTTAGAGAAAGAATGAATGCATATOGRGAAGTGG 60Bovine Pon3 CCCTAGTOGGGGAGAGATTTTTGACACTTCGAGAAAGAATGAATGCATATOGAGAAGTGG 60Human Pon3 CCTTAGTOGGGGAGATGTTCCTGGOGTTTAGAGAAAGGGTGAATGCCTCTOGAGAAGTGG 60Ovine Pon3 AGTCAGTAGM(XCCAGAACTGCCACCTTATTGAGGGAATTGAAAATGGCTCTGAAGATA 120Bovine Pon3 AGTCAGTAGMTCCCAGAACTGCCACCTTATTGAGGGAATTGAAAATGGCTCTGAAGATA 120Human Pon3 A(XTAGTAGM(XTGAAMCTGCCACCTTATTGAGGMCTTGAAAGTGGCTCTGAAGATA 120Ovine Pon3 TTGATATCCTTCCTAGTGGGCTGGCTTTCATCTCCAGTGGATTAMATATCCAGGCATGC 180Bovine Pon3 TTGATATCCTTCCTAGTGGGCTGGCTTTCATCTCCMTGGATTAMATATCCAGGCATGC 180Human Pon3 TTGATATACTTCCTAGTGGGCTGGCTTTTATCTCCAGTGGATTAMATATCCAGGCATGC 180
權(quán)利要求
1.一種治療早產(chǎn)新生兒的方法，所述方法包括 向所述早產(chǎn)新生兒施用對(duì)氧磷酶3 (P0N3)多肽。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述治療降低了所述新生兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)和/或患病的程度、嚴(yán)重性或風(fēng)險(xiǎn)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述P0N3多肽與SEQID NO: 2的序列同一性為至少80%。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述PON3多肽配制在藥物組合物中。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述PON3多肽胃腸外施用。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述PON3多肽靜脈內(nèi)施用。
7.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述PON3多肽腸內(nèi)施用。
8.一種用于治療早產(chǎn)新生兒的PON3多肽。
9.PON3多肽在制造用于治療早產(chǎn)新生兒的藥物中的應(yīng)用。
10.一種治療早產(chǎn)新生兒的方法，所述方法包括 向所述早產(chǎn)新生兒施用血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述治療降低了所述新生兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)和/或患病的程度、嚴(yán)重性或風(fēng)險(xiǎn)。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，所述SAA3多肽與SEQID NO:6的序列同一性為至少80%。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述SAA3多肽配制在藥物組合物中。
14.如權(quán)利要求10 13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述SAA3多肽胃腸外施用。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述SAA3多肽靜脈內(nèi)施用。
16.如權(quán)利要求10 13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述SAA3多肽腸內(nèi)施用。
17.如權(quán)利要求10 16中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括向所述早產(chǎn)新生兒施用對(duì)氧磷酶3(PON3)多肽。
18.一種用于治療早產(chǎn)新生兒的SAA3多肽，或用于治療早產(chǎn)新生兒的組合的SAA3多肽與PON3多肽。
19.SAA3多肽或組合的SAA3多肽與PON3多肽在制造用于治療早產(chǎn)新生兒的藥物中的應(yīng)用。
20.如權(quán)利要求I 7和10 17中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法包括在所述施用前，鑒定所述早產(chǎn)新生兒為缺乏PON3和/或SAA3。
21.一種鑒定有患病和/或死亡風(fēng)險(xiǎn)的早產(chǎn)新生兒的方法，所述方法包括 確定從所述新生兒獲得的樣品中的PON3和/或SAA3的水平或活性； 其中，與對(duì)照相比PON3和/或SAA3的水平或活性降低表明該早產(chǎn)新生兒具有患病和/或死亡風(fēng)險(xiǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用對(duì)氧磷酶3(PON3)或血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)對(duì)早產(chǎn)新生兒的治療，以減小或防止與早產(chǎn)相關(guān)的患病率和死亡率。
文檔編號(hào)A61K38/46GK102740876SQ201080054902
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者D·S·查諾克-瓊斯, 戈登·史密斯 申請(qǐng)人:劍橋企業(yè)有限公司