專利名稱：包囊的肝細胞組合物的制作方法
包囊的肝細胞組合物本發(fā)明涉及包含肝細胞(liver cell)和促紅細胞生成素的微膠囊，制備所述微膠囊的方法，和包括對患者應用所述微膠囊的治療患者的方法。盡管健康受治療者的肝臟能通過修復或替代損傷或患病組織而自行再生，不幸的是，一旦一定量的肝細胞已經(jīng)死亡或已經(jīng)因疾病或損傷嚴重受損，整個器官就可能衰竭。這樣的衰竭(它可以是急性的或慢性的衰竭)可導致疾病和死亡。肝病的治療包括常規(guī)的方式，諸如藥物給藥。盡管如此，移植肝臟或其部分也是本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。此外，在患者中移植肝細胞群為公眾熟知，諸如在例如WO 2004/009766 A2中所述的。盡管如此，在用于治療急性或慢性肝病的療法設(shè)計中遞送肝細胞至具有相應需要的患者仍然是主要挑戰(zhàn)，根據(jù)所移植的肝細胞在靶組織中的活力、植入、增殖和分化而優(yōu)化方法。Haque 等(Biotechnology Letters 27 (5M2005)，317-322))描述了藻酸鹽-殼聚糖微膠囊作為治療肝衰竭的肝細胞移植替代物的體外研究。Chandrasekaran等(Tissue Engineering 12(7)，(2006))公開了在靜電產(chǎn)生的微珠中包埋的肝祖細胞。盡管已經(jīng)努力開發(fā)有效遞送肝細胞至患者靶組織的治療系統(tǒng)，但仍需要提供更可靠的治療方式來治療肝病，尤其是在靶機體中提供高活力和生理活性的肝細胞的方式。本發(fā)明通過提供一種微膠囊來解決所述問題，所述微膠囊包含膠囊殼，優(yōu)選生物相容性膠囊殼，所述膠囊殼包囊有與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸的治療有效量的肝細胞懸液。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種微膠囊，所述微膠囊包含膠囊殼和核，其中該膠囊殼在核中包囊治療有效量的肝細胞懸液和肝細胞刺激量的促紅細胞生成素，特別地，其中促紅細胞生成素(以下稱作ΕΡ0)與肝細胞彼此物理接觸，以便提供EPO對肝細胞的刺激效果。因而，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明預見性提供了一種微膠囊，所述微膠囊包含膠囊殼和被所述膠囊殼包囊的核，所述膠囊殼優(yōu)選由生物相容性膠囊殼材料所制。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中，該核含有與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸的治療有效量的肝細胞懸液。在另一優(yōu)選實施方式中，所述核含有基質(zhì)，所述基質(zhì)優(yōu)選由生物相容性基質(zhì)材料所制，其中所述治療有效量的肝細胞懸液包埋于所述基質(zhì)中，與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸。優(yōu)選地，基質(zhì)材料與膠囊殼材料相同。在另一實施方式中，生物相容性基質(zhì)材料可以是不同于膠囊殼材料的其他材料。因而，本發(fā)明提供了將促紅細胞生成素和肝細胞兩者一起包囊于生物相容性殼中的方法，使得促紅細胞生成素與肝細胞物理接觸以發(fā)揮其對于肝細胞的至少一種生物學功能，尤其是刺激肝細胞。本發(fā)明的一個優(yōu)點是肝細胞包囊于膠囊殼中，從而不會在患者中引發(fā)任何副反應，尤其是過敏性或免疫學反應，所述患者中優(yōu)選移植入微膠囊。進而，促紅細胞生成素與肝細胞的緊密接觸刺激所述肝細胞實施其生物學功能，以便提供給患者肝臟的生物學功能。在特別優(yōu)選的實施方式中，肝細胞以以便彼此物理接觸的濃度包含于微膠囊中，在被促紅細胞生成素刺激時提供甚至更顯著的效果。因而，在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明預見到包含于微膠囊中的肝細胞彼此物理接觸，并與促紅細胞生成素物理接觸。在本發(fā)明上下文中，表述“肝細胞與促紅細胞生成素物理接觸”是指促紅細胞生成素能對于肝細胞發(fā)揮其至少一種生物學功能，尤其是能夠到達存在于肝細胞的促紅細胞生成素受體并被其可逆地或不可逆地結(jié)合。在本發(fā)明上下文中，表述“肝細胞彼此物理接觸”是指肝細胞存在于本發(fā)明的微膠囊中，彼此緊密靠近使得細胞彼此觸及，并提供幾近類似肝臟中的天然生理狀態(tài)的穩(wěn)定環(huán)
^Mi ο在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“刺激肝細胞”是指促紅細胞生成素增加肝細胞的生物學功能(優(yōu)選在移植了微膠囊的患者中)，增加肝細胞的活力，增加其儲存穩(wěn)定性和/或增加一旦被移植入受治療者中成功實施其生物學功能的潛能。在本發(fā)明上下文中，“生物相容性”是指材料、尤其是膠囊殼材料和/或基質(zhì)材料能保持整合的肝細胞活力并允許促紅細胞生成素與肝細胞間相互作用。在特別優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“生物相容”是指材料允許在患者中的植入、優(yōu)選長期植入，同時仍保留所包埋的肝細胞的功能，而不會在受治療者中引發(fā)任何不良的局部或全身效應，尤其是過敏性和免疫學反應。在特別優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“生物相容”是指材料能用作支持肝細胞活性的基質(zhì)，包括肝細胞與EPO間的分子和機械類似系統(tǒng)的要求(solicitation)，優(yōu)選地為了優(yōu)化肝臟再生，而不在細胞和受治療者中引發(fā)任何不良效應。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“促紅細胞生成素”指控制紅細胞生成或血細胞產(chǎn)生的糖蛋白激素，優(yōu)選的是，以適當?shù)膭┝靠刂聘杉毎?jīng)由成紅血細胞至紅細胞的生長、分化和成熟的物質(zhì)。促紅細胞生成素是具有166個氨基酸，3個糖基化位點，分子量約為34，OOODa的糖蛋白。在EPO誘導的紅細胞祖細胞的分化過程中，珠蛋白合成被誘導，血紅素復合物的合成放大，鐵蛋白受體數(shù)量增加。從而細胞可以攝取更多的鐵，并合成有功能的血紅蛋白。在成熟的紅細胞中，血紅蛋白結(jié)合氧。因而紅細胞和其中含有的血紅蛋白在為機體供應氧中起到關(guān)鍵作用。這些過程通過EPO與紅細胞祖細胞的細胞表面上的合適的受體相互作用而啟動(Graber 禾口 Krantz, Ann. Rev. Med. 29(1978)，51-56)。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“促紅細胞生成素”既包括野生型促紅細胞生成素，尤其是人促紅細胞生成素，又包括其衍生物。在本發(fā)明上下文中，促紅細胞生成素衍生物是重組促紅細胞生成素蛋白，其特征在于至少一個氨基酸出現(xiàn)偏差，尤其是與野生型EPO相比， 至少有一個氨基酸缺失、添加或置換；和/或與野生型EPO相比帶有不同糖基化模式的促紅細胞生成素蛋白。在特別優(yōu)選的實施方式中，促紅細胞生成素衍生物還是野生型促紅細胞生成素或其衍生物的融合蛋白或截短蛋白。在特別優(yōu)選的實施方式中，促紅細胞生成素衍生物還是與野生型糖基化模式相比具有不同的糖基化模式的野生型促紅細胞生成素。本文所用的術(shù)語“促紅細胞生成素”包括各種來源的ΕΡ0，特別是人或動物的ΕΡ0。 本文所用術(shù)語因而不僅包括自然存在的，或換言之，EPO的野生型形式，還包括其衍生物，也稱為變體、突變蛋白或突變體，只要它們呈現(xiàn)出野生型促紅細胞生成素的生物學效應。本發(fā)明所涉及的“衍生物”也可理解為通過一個或多個原子或分子基團或殘基的取代，特別是通過諸如乙二醇的糖鏈取代獲得的，同時保留了基本的促紅細胞生成素結(jié)構(gòu)的那些促紅細胞生成素衍生物，和/或其氨基酸序列在至少一個位置上不同于天然存在的人或動物的促紅細胞生成素蛋白的氨基酸序列，但基本上具有在氨基酸水平上的高度同源性且相當?shù)纳飳W活性的那些促紅細胞生成素衍生物?？蓱玫拇偌t細胞生成素衍生物， 例如本發(fā)明中的，可從WO 94/25055, EP 0148605 Bl或WO 95/05465中得知?！巴葱浴笔侵柑貏e是具有至少80%、優(yōu)選至少85%、特別優(yōu)選至少超過90%、 95%、97%和99%的序列同一性。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語“同源性”指兩個或多個多肽分子之間的關(guān)系的度量。這通過序列間的一致性來確定。該一致性要么可以指相同的一致性，要么可以指氨基酸的保守性置換。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“衍生物”還包括融合蛋白，其中另一蛋白的功能域存在于N末端部分或C末端部分。在本發(fā)明的一種實施方式中，這另一蛋白可以是，例如，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、PIGF、抑制素(statin)或?qū)?nèi)皮祖細胞有刺激效應的另一因子。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，該另一蛋白還可以是對肝細胞有刺激效應的因子。促紅細胞生成素衍生物和天然或野生型促紅細胞生成素之間可以出現(xiàn)差異，例如，通過突變，諸如缺失、置換、插入、添加、堿基置換和/或編碼促紅細胞生成素氨基酸序列的核苷酸序列的重組。顯然這樣的差異還可以是天然存在的序列變異體，諸如來自其他生物的序列或有天然突變的序列，或利用諸如化學試劑和/或物理試劑的本領(lǐng)域公知的方式選擇性引入編碼促紅細胞生成素的核酸序列的突變。從而，本發(fā)明所涉及的術(shù)語“衍生物”還包括突變的促紅細胞生成素分子，或換言之，促紅細胞生成素突變蛋白。根據(jù)本發(fā)明，還可以使用促紅細胞生成素的肽或蛋白類似物。本發(fā)明所涉及的術(shù)語“類似物”包括下述化合物即，沒有與促紅細胞生成素氨基酸序列相同的任何氨基酸序列，但具有極其類似促紅細胞生成素三維結(jié)構(gòu)的，使得它們具有相當?shù)纳飳W活性。促紅細胞生成素類似物可以是，例如，在合適的構(gòu)象中含有負責促紅細胞生成素結(jié)合其受體的氨基酸殘基的化合物，從而它們能模擬促紅細胞生成素結(jié)合區(qū)的必要的表面特性。例如 feighton等，Science，273 (1996)，458中所記載的此類型化合物。根據(jù)本發(fā)明所用的EPO能以各種方式產(chǎn)生，例如通過從人尿或從患有再生障礙性貧血的患者的尿或血漿(包括血清)中分離(Miyake等，J. B.C(《生物化學雜志》).252(1977)，5558)。作為示例，人EPO也能從人腎癌細胞的組織培養(yǎng)物中獲得(JA未審查的專利申請陽790/1979)，從能產(chǎn)生人EPO的人淋巴母細胞中獲得(JA未審查的專利申請40411/1982)，以及從通過人細胞系的細胞融合得到的雜交瘤培養(yǎng)物中獲得。EPO也能通過基因技術(shù)方法來生成，使用編碼合適的EPO氨基酸序列的合適DNA或RNA通過基因工程(例如，在細菌、酵母或植物、動物或人細胞系中)來產(chǎn)生所需蛋白。這樣的方法描述于例如，EP 0148605 B2 或 EP 0205564 B2 以及 EP 0411678 Bi。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所涉及的促紅細胞生成素的衍生物是有功能的而且臨床上證實的EPO衍生物，優(yōu)選選自由依泊汀(Epoetin，也稱作Procrit)、依普定 (Epogen)、依泊汀 α (Eprex)或依泊汀 β (NeoRecormon)、依泊汀 δ (Epoetin delta，也稱作Dyn印ο)、達依泊汀(Darb印oetin，也稱作Aranesp)、Pdpoetin、CERA(持續(xù)性促紅細胞生成素受體拮抗劑)和甲氧聚乙二醇-依泊汀β (也稱作Mircera)組成的組。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，微膠囊是一種由生物相容性膠囊殼材料制成的微珠，優(yōu)選球形微珠，所述微珠含有包埋其中的與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸的治療有效量的肝細胞。在本發(fā)明說明書中，微膠囊優(yōu)選為球形，優(yōu)選直徑IOym至10mm， 優(yōu)選140 μ m至10mm，優(yōu)選50 μ m至Imm,優(yōu)選60 μ m至800 μ m,優(yōu)選100至700 μ m。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的微膠囊由肝細胞、促紅細胞生成素和生物相容性膠囊殼材料組成。優(yōu)選的是，除以上三種元件外，還預知了微膠囊的包衣和/或微膠囊核中的生物相容性基質(zhì)。因而，在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種微膠囊，所述微膠囊包含包囊于生物相容性基質(zhì)材料的與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸的治療有效量的肝細胞。在特別優(yōu)選的實施方式中，肝細胞以懸液形式、優(yōu)選細胞培養(yǎng)懸液形式，包埋在膠囊殼中。肝細胞懸液優(yōu)選為包含在細胞培養(yǎng)基中或包含在生理學上可接受的水溶液中的肝細胞的形式。肝細胞懸液優(yōu)選為在細胞培養(yǎng)基中的肝細胞的懸液。在特別優(yōu)選的實施方式中，肝細胞以懸液形式、優(yōu)選細胞培養(yǎng)懸液形式、優(yōu)選包含在細胞培養(yǎng)基中或包含在生理學上可接受的水溶液中的肝細胞的形式包埋在殼中含有的基質(zhì)中。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中肝細胞選自由肝祖細胞、肝干細胞、肝母細胞和肝細胞O^patocyte)組成的組。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中肝細胞選自由肝祖細胞、肝干細胞、肝母細胞、肝細胞和內(nèi)皮細胞組成的組。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中肝細胞從成人肝臟、胚肝、胎肝、新生肝或肝細胞培養(yǎng)物中獲得。優(yōu)選的是，肝細胞為活的肝細胞。在優(yōu)選的實施方式中， 肝細胞可以從活或死供體、特別是新近死亡的供體中獲得。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中肝細胞是人肝細胞、非人靈長類肝細胞、豬肝細胞、狗肝細胞、貓肝細胞、兔肝細胞、小鼠肝細胞或大鼠肝細胞。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中微膠囊平均直徑為100至 700 μ m,優(yōu)選 200、300、400、500、600 或 650 至 700 μ m。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中治療有效量的肝細胞是IO4至 108、優(yōu)選IO5至IO7個肝細胞/ml懸液。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中肝細胞平均直徑為8至 14 μ m，優(yōu)選 9 至 12 μ m。在另外優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中促紅細胞生成素的肝細胞刺激量為ΙΟ"7至10_2U/ml懸液，優(yōu)選ΙΟ"7至10_3U/ml懸液，優(yōu)選10_7至10_5U/ml懸液以及優(yōu)選 10_6 到 10_5U/ml 懸液。在另外優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中EPO是野生型促紅細胞生成素或重組促紅細胞生成素。在另外優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中膠囊殼材料選自由藻酸鹽、 藻酸鹽-殼聚糖(AC)、藻酸鹽-聚L賴氨酸(APA)、熱膠凝(thermogelation)-聚合物和 PEG-水凝膠組成的組。在另外優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中基質(zhì)材料選自由藻酸鹽、藻酸鹽-殼聚糖(AC)、藻酸鹽-聚L賴氨酸(APA)、熱凝膠(thermogelation)-聚合物和PEG-水凝膠組成的組。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中除肝細胞外，還有至少一種另外的細胞類型存在于微膠囊中。在特別優(yōu)選的實施方式中，存在于微膠囊中的至少一種另外的細胞類型選自由肝臟星狀細胞、膽細胞、造血細胞、單核細胞、巨噬細胞系細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞組成的組。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，預見到，除肝細胞和EPO外，微膠囊還包括至少一種另外的生長因子，優(yōu)選選自HGH (人生長因子)、VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)、CSF (集落刺激因子)、促血小板生成素(thrombopoietin)、SCF復合物(包含Skpcollien、F-box的復合物)，SDF(間質(zhì)細胞衍生因子-1)、NGF (神經(jīng)生長因子)、PIGF (磷脂酰肌醇聚糖錨生物合成，F(xiàn)類)、HMG輔還原酶抑制劑、ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑、AT-I抑制劑和NO 供體組成的組。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及微膠囊，其中所述微膠囊被包衣包覆。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，包衣是聚合物包衣、糖包衣、糖醇包衣和/或脂或蠟包衣。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種用于制備上文所述的微膠囊的方法， 該方法包括a)提供治療有效量的肝細胞懸液和肝細胞刺激量的促紅細胞生成素，b)混合所述肝細胞懸液和促紅細胞生成素以使它們彼此物理接觸，和c)將所述肝細胞懸液和促紅細胞生成素包囊于膠囊殼材料中以形成所述微膠囊。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中將步驟C)中獲得的所述微膠囊冷凍保存。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種用于預防性或治療性治療具有相應需要的受治療者中的肝臟疾病的方法，該方法包括將本發(fā)明的所述微膠囊給藥至所述受治療
者ο在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中肝臟疾病是肝炎、肝硬化、先天性代謝缺陷、急性肝衰竭、急性肝感染、急性化學毒性、慢性肝衰竭、膽管炎 (cholangiocitis)、膽汁性肝硬化、Alagille綜合征、α 1_抗胰蛋白酶缺乏癥、自身免疫性肝炎、膽道閉鎖、肝癌、肝臟囊性疾病、脂肪肝、半乳糖血癥、膽結(jié)石、吉爾伯特綜合征 (Gilbert' s syndrome)、血色素沉著癥、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和其他肝炎病毒感染、嚇啉病(poryphyria)、原發(fā)性硬化性膽管炎、瑞氏綜合征(Reye’ s syndrome)、結(jié)節(jié)病、 酪氨酸血癥、I型糖原貯積癥或威爾森氏病(Wilson’ s disease)。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中通過在肝包膜下將微膠囊導入脾臟、肝臟、肝漿(liver pulp)或脾動脈或門靜脈而進行給藥。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及用于將肝細胞導入受治療者的方法，該方法包括將本發(fā)明的微膠囊給藥至所述受治療者。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，通過導入具有相應需要的受治療者來進行給藥，其中所述給藥是局部、腸道或胃腸外給藥。在優(yōu)選的實施方式中，局部給藥是表皮、吸入、陰道或鼻內(nèi)給藥。在優(yōu)選的實施方式中，腸道給藥是通過口腔、胃飼管或直腸。在優(yōu)選的實施方式中，胃腸外給藥是通過注射或輸液，優(yōu)選靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、心臟內(nèi)、皮下、 骨內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腹腔或膀胱內(nèi)給藥。在另外的優(yōu)選實施方式中，胃腸外給藥是透皮、透黏膜或吸入給藥。在另外的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝細胞的方法，優(yōu)選在體外，該方法包括在合適的培養(yǎng)基和在適于維持或增加肝細胞活力的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的微膠囊。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種在培養(yǎng)基中維持或增加肝細胞能量狀態(tài)的方法，優(yōu)選在體外，該方法包括在合適的培養(yǎng)基和在適于維持或增加肝細胞能量狀態(tài)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的微膠囊。本發(fā)明的另外的優(yōu)選實施方式是從屬權(quán)利要求的主題。附圖
顯示了包囊有EPO或未以EPO包囊的肝細胞培養(yǎng)后ATP/ADP比值(作為對于細胞能量狀態(tài)的測量)。實施例1在EPO (5 X 10_3單位/ml)存在的條件下，用藻酸鹽以IO4到IO8個細胞/ml的濃度包囊至平均直徑為100至700 μ m的微珠中的肝細胞將優(yōu)于除無EPO外同樣地包囊的肝細胞。ATP/ADP比值用作細胞能量狀態(tài)的測量。在實驗過程中，如果ATP/ADP比值以較快速率增加或保持高于未處理的細胞，則該證據(jù)可支持推論。肝細胞的包囊利用靜電微珠產(chǎn)生裝置從冷凍保存的人肝細胞的單個原種實施肝細胞的細胞包囊。在常規(guī)培養(yǎng)基中懸浮肝細胞，并以1 1的比例將其與2%藻酸鈉混合。將所得到的含4 百萬個細胞/ml濃度的肝細胞的藻酸鹽溶液吸入裝有M號血管導管(angiocatheter) 的1-cc注射器中。在靜電鑄造過程中，使用23號針頭將血管導管穿在針座上作為正電極。 注射器裝在注射器泵(Braintree Scientific BS-8000，Braintree，ΜΑ)上，使得從留置針噴出的液滴垂直落在250ml玻璃燒杯中的125mM氯化鈣(CaCl2)溶液表面上(含人白蛋白的常規(guī)緩沖液或Cytonet緩沖液，含5 X 10_3和5 X 10_6U/ml的EPO或不含ΕΡ0)。自留置針頂端至CaCl2表面的距離固定在大約2. 5cm。泵流速設(shè)在0. 75至1. 5ml/分鐘范圍內(nèi)。 接地電極浸入CaCl2接收槽中。利用3.8至6kV范圍內(nèi)的高電壓DC電源(Spellman model RHR30PF30, Hauppauge, NY)形成跨留置針頂端和CaCl2槽的靜電勢。通過調(diào)節(jié)所用電勢控制微珠直徑(500μπι)。當在高靜電電勢存在條件下開啟注射器泵時，擠壓出的藻酸鈉溶液被拉成細小的液滴，所述液滴當接觸CaCl2溶液時立即聚合形成固體藻酸鈣。在包囊肝細胞后，將藻酸鹽微珠保持在補有10%血清、244單位/ml青霉素、 0. 244mg/ml、5. 5mM 谷氨酰胺、0. 195 單位 /ml 胰島素、0. 017ug/ml 胰高血糖素、0. 73ug/ml 潑尼松龍、0.5^g/ml地塞米松的威廉姆斯E培養(yǎng)基(William’ s Ε)中，并培養(yǎng)2小時。通過將微珠置于IOOmM檸檬酸中來進行去包囊化。當藻酸鹽溶解時，用PBS洗滌細胞兩遍，并通過200 XG離心1分鐘沉淀細胞。通過將4%高氯酸置于細胞上，并用手持微勻漿器勻漿20秒來提取代謝物。然后以14，000XG離心樣品3分鐘，并去除含代謝物的上清液。用KOH中和高氯酸，并通過離心去除不溶解的高氯酸鉀。然后用記載于“哺乳動物
巾白勺 ATPiiJfi (Measurements of ATP in Mammalian Cells)” (Manfredi ^,Methods2002(4),317-326)的用于ATP、ADP分析的HPLC方法分析樣品。三個平行的平板用于實施 ATP/ADP水平測定。結(jié)果ATP/ADP比值是細胞能量的測量并代表基于細胞的代謝狀態(tài)的所有生物化學通路的效果。所看到的包囊有EPO的肝細胞中的ATP/ADP比值(見附圖)的維持清楚地顯示， 細胞能維持細胞的各個功能所需的能量產(chǎn)生通路。在該實驗中，在EPO處理組中維持ATP/ ADP比值，但在未處理對照中沒有維持ATP/ADP比值。當EPO處理組能維持ATP/ADP比值時，對照中的ATP/ADP比值下降至0. 5以下。這表明EPO可以通過非EPO受體驅(qū)動的通路來信號傳導以賦予細胞營養(yǎng)刺激。
權(quán)利要求
1.一種微膠囊，其包含膠囊殼，所述膠囊殼包囊有與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸的治療有效量的肝細胞懸液。
2.如權(quán)利要求1所述的微膠囊，其中，所述肝細胞選自由肝祖細胞、肝干細胞、肝母細胞、內(nèi)皮細胞和肝細胞組成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的微膠囊，其中，所述肝細胞從成人肝臟、胚肝、胎肝、新生肝或肝細胞培養(yǎng)物中獲得。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的微膠囊，其中，所述肝細胞是人肝細胞、非人靈長類肝細胞、豬肝細胞、狗肝細胞、貓肝細胞、兔肝細胞、小鼠肝細胞或大鼠肝細胞。
5.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述微膠囊具有100至700μ m的平均直徑。
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的微膠囊，其中，所述肝細胞具有8至14μ m的平均直徑。
7.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述治療有效量的肝細胞為IO4至IO8 個肝細胞/ml懸液。
8.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述肝細胞刺激量的促紅細胞生成素為10_7至10_2U/ml懸液，優(yōu)選為10_7至10_3U/ml懸液。
9.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述促紅細胞生成素是野生型促紅細胞生成素或重組促紅細胞生成素。
10.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述膠囊殼由選自藻酸鹽、藻酸鹽-殼聚糖(Ac)、藻酸鹽-聚L賴氨酸(APA)、熱膠凝-聚合物和PEG-水凝膠組成的組中的生物相容性材料制成。
11.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，除所述肝細胞外，還有至少一種另外的細胞類型存在于所述微膠囊中。
12.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述微膠囊被包衣包覆。
13.如上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊，其中，所述微膠囊含有包埋所述肝細胞和所述促紅細胞生成素的生物相容性基質(zhì)。
14.一種制備上述權(quán)利要求任一項所述的微膠囊的方法，其包括a)提供治療有效量的肝細胞懸液和肝細胞刺激量的促紅細胞生成素，b)混合所述肝細胞懸液和所述促紅細胞生成素以使它們彼此物理接觸，和c)將所述肝細胞懸液和所述促紅細胞生成素包囊于生物相容性膠囊殼材料中以形成所述微膠囊。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，將步驟c)中獲得的所述微膠囊進行冷凍保存。
16.一種預防性或治療性治療具有相應需要的受治療者中的肝臟疾病的方法，其包括將權(quán)利要求1至13任一項所述的微膠囊給藥至所述受治療者。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述肝臟疾病是肝炎、肝硬化、先天性代謝缺陷、 急性肝衰竭、急性肝感染、急性化學毒性、慢性肝衰竭、膽管炎、膽汁性膽硬化、Alagille綜合征、α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥、自身免疫性肝炎、膽道閉鎖、肝癌、肝臟囊性疾病、脂肪肝、半乳糖血癥、膽結(jié)石、吉爾伯特綜合征(Gilbert's syndrome)、血色素沉著癥、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和其他肝炎病毒感染、嚇啉病、原發(fā)性硬化性膽管炎、瑞氏綜合征(Reye’ ssyndrome)、結(jié)節(jié)病、酪氨酸血癥、I型糖原貯積癥或威爾森氏病。
18.如權(quán)利要求15至17任一項所述的方法，其中，通過在肝包膜下將所述微膠囊導入脾臟、肝臟、肝漿或脾動脈或門靜脈而進行給藥。
19.一種在受治療者中導入肝細胞的方法，其包括將權(quán)利要求1至13任一項所述的微膠囊給藥至所述受治療者。
20.一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)肝細胞的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1至 13任一項所述的微膠囊。
全文摘要
一種微膠囊，其包含膠囊殼，所述膠囊殼包囊有與肝細胞刺激量的促紅細胞生成素物理接觸的治療有效量的肝細胞懸液。
文檔編號A61K9/50GK102413820SQ201080018844
公開日2012年4月11日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日
發(fā)明者克拉希米拉·亞歷山大德羅娃, 彼得·佩迪亞迪塔基斯, 沃爾夫?qū)味「? 約·薩里斯布瑞 申請人:齊托內(nèi)兩合公司