專利名稱：法倔唑在誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途仓械膽眉捌湔T導方法
技術領域：
本發(fā)明屬于魚類遺傳育種技術領域，涉及芳香化酶抑制劑法倔唑(Fadrozole)在 誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途仓械膽?，以及利用法倔唑誘導羅非魚已分化卵 巢轉變?yōu)楣δ苄途驳姆椒ā?br>
背景技術：
羅非魚又稱非洲鯽魚，具有食性雜、生長快、繁殖強、味道鮮美且肌間刺少等優(yōu)良 特征，現(xiàn)已成為世界性主要養(yǎng)殖魚類之一，主要養(yǎng)殖品種有莫桑比克羅非魚、尼羅羅非魚、 奧利亞羅非魚和吉富羅非魚等。近年來，全球羅非魚養(yǎng)殖產量逐年遞增，我國羅非魚產量已 由1987年的不足3. 5萬噸增長到2007年的113萬噸，占世界產量的43. 5%，2010年還有望 達到120萬噸。目前，我國已成為全球最大的羅非魚生產國和出口國。在羅非魚的養(yǎng)殖過程中，由于雌魚3個月性腺已明顯分化為卵巢，8個月左右達到 性成熟，每15-20天就要繁殖一次，將會在池塘里產生大量小羅非魚，而小羅非魚會競爭營 養(yǎng)物質、溶氧及空間，且在年終不能長成商品規(guī)格，從而會大大影響羅非魚養(yǎng)殖的產量和效 益。因此，如果能夠在養(yǎng)殖過程中人工控制羅非魚的性別，對雌性羅非魚進行性逆轉，將大 大提高羅非魚的養(yǎng)殖產量，降低養(yǎng)殖成本，提高經濟效益。目前，對羅非魚進行性逆轉大多數是在羅非魚性別決定與分化的敏感期進行激素 處理，以誘導完全的性逆轉。但由于羅非魚性別決定與分化的敏感期非常短(通常僅孵化后 3-5天)，不容易把握，且此時魚體較小，抵抗力弱，激素處理會對魚體產生一定損害甚至導 致魚體死亡，從而使性逆轉魚的獲得率大大降低。而如何通過人為因素在雌性羅非魚性腺 已明顯分化為卵巢后，再誘導其轉變?yōu)楣δ苄途?，尚未見文獻報道。芳香化酶是類固醇激素合成的末端限速酶，直接參與調控雌激素的合成。有文獻 報道，在魚類性腺分化前，注射芳香化酶抑制劑能夠阻斷魚體內雌激素合成，將遺傳性別為 雌性的個體逆轉為表型性別為雄性的個體，使性腺發(fā)育為功能性精巢。但在雌魚性腺已分 化為卵巢后，芳香化酶抑制劑還能否誘導其已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途玻駷橹箛鴥?外尚未見報道。
發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于考察芳香化酶抑制劑是否能夠誘導羅非魚已分化卵 巢轉變?yōu)楣δ苄途?，從而建立一種誘導羅非魚由雌性個體向雄性個體性逆轉的新方法， 為研究羅非魚性別決定與分化的分子機制提供可靠的實驗模型，同時為羅非魚性別控制和 單性育種研究開辟新的技術途徑。為達到上述目的，本發(fā)明考察了芳香化酶抑制劑法倔唑(Fadrozole)對誘導尼羅 羅非魚(flreocAroffiis niloticus)已分化卵巢向功能型精巢轉化的影響，結果顯示，向性腺 已明顯分化為卵巢的3月齡雌性尼羅羅非魚投喂含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為400μβ/g，連續(xù)投喂90天，可以誘導尼羅羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途?。由此，本發(fā)明提供 如下技術方案
1、 法倔唑在誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途仓械膽?。進一步，所述羅非魚為尼羅羅非魚。2、利用法倔唑誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳姆椒?，是向性腺已分?為卵巢的雌性羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉變?yōu)楣δ苄途?。當所述羅非魚為尼羅羅非魚時，上述方法可以具體為向3月齡的雌性尼羅羅非 魚投喂含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為40(^g/g，連續(xù)投喂90天。3、用于誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其中含有法倔唑。當所述羅非魚為尼羅羅非魚時，上述餌料中法倔唑的含量為40(^g/g。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用芳香化酶抑制劑法倔唑誘導羅非魚已分化 卵巢轉變?yōu)楣δ苄跃?，這是在整個脊椎動物除了天然性逆轉種類外，首次通過人為因素 實現(xiàn)已分化卵巢再分化為功能型精巢，建立了誘導羅非魚由雌性個體向雄性個體性逆轉的 新方法，不僅為研究羅非魚性別決定與分化的分子機制提供了可靠的實驗模型，而且為羅 非魚性別控制和單性育種開辟了新的技術途徑，適宜在羅非魚以及其他養(yǎng)殖魚類上推廣應 用，對養(yǎng)殖魚類性別控制和單性育種具有重要意義和應用價值。
圖1為投喂含有法倔唑的餌料誘導3月齡雌性尼羅羅非魚性逆轉過程中不同階 段的性腺組織學觀察(H. E染色)，其中圖A為3月齡正常雌魚卵巢結構；圖B為3月齡正常 雄魚精巢結構；圖C為3月齡正常雌魚經法倔唑誘導70天后的性腺結構；圖D為3月齡正 常雌魚經法倔唑誘導90天后的性腺結構；圖A和圖B的標尺為20Mm，圖C和圖D的標尺為 IOMm0
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明的優(yōu) 選實施例進行詳細的描述。1、含有法倔唑的餌料的配制
稱取法倔唑0. 5g，用無水乙醇50ml溶解制成濃度為10mg/ml的母液，再吸取上述母液 8ml，用無水乙醇稀釋至100ml，再加至尼羅羅非魚養(yǎng)殖餌料200g中，攪拌混勻，自然晾干或 37°C烘干，即得含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為40(^g/g。同時配制空白對照餌料，向尼羅 羅非魚養(yǎng)殖餌料200g中加入無水乙醇100ml，攪拌混勻，自然晾干或37°C烘干，即得。2、投喂誘導尼羅羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄跃?br>
將尼羅羅非魚假雄魚(XX 與正常尼羅羅非魚雌性(XX早)繁殖，獲得全雌尼羅羅非 魚種群，投喂正常餌料在水溫27°c的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中將其養(yǎng)至3月齡，隨機分為空白對 照組和實驗組，空白對照組投喂上述制備的空白對照餌料，實驗組投喂上述制備的含有法 倔唑的餌料，連續(xù)投喂90天。3、尼羅羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)榫驳臋z測 (1)顯微鏡下鏡檢精液取經法倔唑誘導性逆轉90天后的實驗組尼羅羅非魚，輕壓其腹部，收集精液，采用平 板載片法，滴1滴實驗液于平板載片上，用解剖針針尖蘸取少許精液與實驗液調勻，在低倍 鏡下觀察。結果顯示，實驗組尼羅羅非魚精液中含有大量精子，說明雌性尼羅羅非魚的卵巢 已轉變?yōu)榫病?br>
(2)組織學觀察性腺結構
分別在法倔唑誘導性逆轉前以及誘導性逆轉70天和90天后，解剖取出空白對照組和 實驗組尼羅羅非魚的性腺，Bouin's液固定，石蠟切片，經各級乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟 包埋，作連續(xù)橫切5Mm切片，H. E染色，光學顯微鏡下觀察其性腺結構。結果如圖1所示，3 月齡正常雌性尼羅羅非魚的性腺中含有大量的卵原細胞和各級卵母細胞，說明性腺已明顯 分化為卵巢(圖1A)；對比3月齡正常雄性尼羅羅非魚的性腺，可見其性腺中含有大量的精 原細胞、各級精母細胞、精子細胞和精子性腺，說明性腺已明顯分化為精巢(圖1B);3月齡正 常雌性尼羅羅非魚經法倔唑誘導性逆轉70天后，其性腺大部分轉變?yōu)榫步Y構，含精原細 胞、各級精母細胞和精子細胞，僅在性腺的背部與身體連接處存在正在退化的卵母細胞(圖 1C);經法倔唑誘導性逆轉90天后，其性腺完全轉變?yōu)榫步Y構，含精原細胞、各級精母細胞 和精子細胞(圖1D)。4、性逆轉雄魚的精巢功能性驗證 (1)人工授精驗證性逆轉雄魚的精巢功能
取上述法倔唑誘導的性逆轉雄魚，輕壓其腹部，收集精液；另外，收集正常發(fā)育即將產 卵的雌性尼羅羅非魚卵子；將收集的精液和卵子混合，采用干法授精技術進行人工授精，將 受精卵在水溫27°C的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行孵化。結果發(fā)現(xiàn)，上述受精卵可以孵化出正常 發(fā)育的子代尼羅羅非魚，表明經法倔唑誘導的由卵巢轉變而來的精巢具有正常功能，產生 的精子能夠正常受精。(2)與正常雌魚混養(yǎng)雜交驗證精巢功能
將上述法倔唑誘導的性逆轉雄魚與已性成熟且性腺發(fā)育正常的雌性尼羅羅非魚混合 飼養(yǎng)，投喂正常餌料，水溫26-27°C，自然光周期。結果發(fā)現(xiàn)，上述混養(yǎng)的雌、雄魚可以繁殖出 正常發(fā)育的子代尼羅羅非魚，表明經法倔唑誘導的由卵巢轉變而來的精巢所產生的精子能 夠正常受精，繁育后代。綜合上述實驗結果，可以得出如下結論芳香化酶抑制劑法倔唑能夠用于誘導尼 羅羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄跃?，鑒于不同品種羅非魚之間性質相似，因此，本領域 技術人員根據本發(fā)明的記載，可以推知本發(fā)明也適用于其它品種的羅非魚，即法倔唑能夠 用于誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄跃玻湔T導方法是向性腺已分化為卵巢的雌性 羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉變?yōu)楣δ苄途?。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權利要求
1.法倔唑在誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途仓械膽谩?br>
2.根據權利要求1所述的法倔唑的應用，其特征在于所述羅非魚為尼羅羅非魚。
3.利用法倔唑誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳姆椒?，其特征在于向性?已分化為卵巢的雌性羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉變?yōu)楣δ苄途病?br>
4.根據權利要求3所述的利用法倔唑誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳姆?法，其特征在于所述羅非魚為尼羅羅非魚。
5.根據權利要求4所述的利用法倔唑誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳姆?法，其特征在于向3月齡的雌性尼羅羅非魚投喂含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為400μβ/ g，連續(xù)投喂90天。
6.用于誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其特征在于含有法倔唑。
7.根據權利要求6所述的用于誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其 特征在于所述羅非魚為尼羅羅非魚。
8.根據權利要求7所述的用于誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其 特征在于所述餌料中法倔唑的含量為40(^g/g。
全文摘要
本發(fā)明屬于魚類遺傳育種技術領域，涉及法倔唑(Fadrozole)在誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途仓械膽茫€涉及利用法倔唑誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄途驳姆椒?，即向性腺已分化為卵巢的雌性羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉變?yōu)楣δ苄途?；本發(fā)明利用芳香化酶抑制劑法倔唑誘導羅非魚已分化卵巢轉變?yōu)楣δ苄跃?，這是在整個脊椎動物除了天然性逆轉種類外，首次通過人為因素實現(xiàn)已分化卵巢再分化為功能型精巢，建立了誘導羅非魚由雌性個體向雄性個體性逆轉的新方法，不僅為研究羅非魚性別決定與分化的分子機制提供了可靠的實驗模型，而且為羅非魚性別控制和單性育種開辟了新的技術途徑。
文檔編號A61P5/32GK102068429SQ20101060941
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權日2010年12月28日
發(fā)明者劉智皓, 孫運侶, 楊世杰, 王德壽, 黃寶鋒 申請人:西南大學