專利名稱：一種通過組織工程構(gòu)建的骨組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過組織工程構(gòu)建的骨組織。
背景技術(shù)：
組織工程是二十一世紀(jì)生命科學(xué)一大熱點。它的核心內(nèi)容是體外細胞三維培養(yǎng)， 它的基本方法是將種子細胞與可降解生物材料組成復(fù)合體，替代受損組織器官。目前，國內(nèi)外骨組織替代品主要采用自體骨，約占70 %。異種骨中相對成功的是一些完全去除骨有機成分的骨礦材料，如KEIL骨，BIOOSS骨，及無機骨，以及完全去除骨礦成分的有機成分材料，如脫鈣骨，骨基質(zhì)明膠等。前者不含有機成分，因而疏松易碎，不具備基本機械強度；后者缺乏骨礦，因而質(zhì)地柔軟，不具備基本力學(xué)剛度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有替代品的缺點，構(gòu)建理想的組織工程骨組織替代
P
ΡΠ O本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化骨組織步驟如下先模擬正常骨結(jié)構(gòu)對具有一定強度的各類皮質(zhì)骨替代材料按實際缺損情況進行塑形，構(gòu)成骨皮質(zhì)框架?？蚣苤锌詹课惶钊臃N有骨髓間質(zhì)干細胞(MSC)的松質(zhì)骨替代材料，替代正常骨結(jié)構(gòu)中松質(zhì)骨和骨髓細胞成分。 臨床應(yīng)用中，醫(yī)師可根據(jù)患者的CT片預(yù)先測定手術(shù)切除范圍，并按缺損部分的CT重構(gòu)數(shù)據(jù)按上述方法對組織工程化骨支架材料進行塑形，從而實現(xiàn)個體化治療。本發(fā)明所述皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨支架材料包括同種異體或異種骨脫細胞基質(zhì)、同種異體鍛燒骨、同種異體凍干骨、珊瑚、羥基磷灰石和磷酸三鈣等。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案和步驟實現(xiàn)的
A .提取并在體外擴增患者自體MSC，制成種子細胞； B .將上述種子細胞接種于柔軟的松質(zhì)骨支架材料上，構(gòu)建組織工程化松質(zhì)骨； C .構(gòu)建組織工程化骨三維計算機輔助設(shè)計(CAD )重構(gòu)模型； D .利用皮質(zhì)骨支架材料個體化構(gòu)建組織工程化骨皮質(zhì)骨框架； E .將上述組織工程化松質(zhì)骨充填入皮質(zhì)骨框架內(nèi)構(gòu)建完整的組織工程化骨組織。具體步驟如下
1 )體外分離、培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細胞
抽取患者自體骨髓Ficoll分離，提取有核細胞，PBS + E DTA清洗。置于纖維連接蛋白包被培養(yǎng)皿，加入DMEM培養(yǎng)液37°C含5 %二氧化碳培養(yǎng)箱。兩天后去除未貼壁細胞，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)
當(dāng)細胞融合到60 %-75 %密度時，用無鈣鎂PBS沖洗，經(jīng)胰酶消化后，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，離心。棄去上清液，加入含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，混勻，計數(shù)，按比例傳代培養(yǎng)。2 - 3日換培養(yǎng)液，細胞融合至60%-75 %密度時，
3再傳代培養(yǎng)。2 )將骨髓間質(zhì)干細胞接種于松質(zhì)骨支架材料，體外培養(yǎng)后，構(gòu)建組織工程化松質(zhì)骨。3 )皮質(zhì)骨骼三維重構(gòu)CT掃描得到骨骼每隔一定距離的各斷面灰度圖像。采用比利時materialise公司的重構(gòu)軟件CT MIMICS對病變骨骼進行三維計算機輔助設(shè)計重構(gòu)。通過對比度增強、閉值化、輪廓編輯、三維區(qū)域增長、平滑處理、三維編輯等處理，獲得病變骨骼皮質(zhì)骨的三維CAD重構(gòu)模型。所述模型可輸出成STL文件，供快速成型機直接加工實物模型；還可生成工GES格式，輸入三維CAD軟件中進一步分析、修改，最后生成 CNC數(shù)控指令，控制機床進行數(shù)控加工。4 )塑形支架材料
首先對各類皮質(zhì)骨替代材料置入預(yù)先制作的?？蛑校霉撬嗾澈铣梢粋€整體，得到所需的基材，包括板材和/或棒料。所得到的基材基本可保持材料固有的孔隙率，并具有較高的機械強度和可加工性能。本發(fā)明采用骨水泥作為粘結(jié)劑具有良好生物相容性、骨傳導(dǎo)作用和生物降解性。本發(fā)明根據(jù)CT重構(gòu)得到的數(shù)據(jù)可直接用CNC將基材加工成所需形狀。本發(fā)明還利用快速成形法先進行構(gòu)建模具，再將顆粒狀材料和粘和劑灌注入模具，從而得到各類不同形狀的基材。5 )將接種有MSC的松質(zhì)骨直接填塞入組織工程化皮質(zhì)骨框架中，構(gòu)建個體化的組織工程化骨。所述組織工程化骨與正常骨組織相似，具有皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨及細胞成分。按上述方法得到的組織工程化骨組織具有與正常骨組織相似的皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨及細胞成分。既保持一定的機械強度，基本力學(xué)剛度，又具有合理的孔隙率，良好的細胞相容性。是一種具有自我更新，自我修復(fù)能力的活組織。
具體實施例方式實施例1
1 )體外分離、培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細胞抽取患者自體骨髓5 - 10 ml, Ficoll分離，提取有核細胞，PBS + EDTA清洗兩次。加入DMEM (購于GIBC0BRL公司。含有20%胎牛血清)培養(yǎng)培養(yǎng)液，放置于纖維連接蛋白包被培養(yǎng)皿，37°C含5 %二氧化碳培養(yǎng)箱。兩天后去除未貼壁細胞，條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)
當(dāng)細胞融合到60 75 %密度時，用IOml無鈣鎂PBS沖洗，經(jīng)0.25 %胰酶37 V消化5分鐘，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。棄去上清液，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液IOml，混勻，計數(shù)，按1 3的比例傳代培養(yǎng)。2 - 3日換一次培養(yǎng)液，直到細胞融合至60 75 % 密度時，再傳代培養(yǎng)。本發(fā)明采用的體外分離、培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細胞的方法是已知方法。2 )將骨髓間質(zhì)干細胞接種于IXlcm全脫鈣豬骨脫細胞基質(zhì)，接種密度為IO5 -IO8，體外培養(yǎng)后，構(gòu)建成組織工程化松質(zhì)骨。3 )骨骼的三維重構(gòu)CT掃描得到骨骼每隔一定距離的各斷面灰度圖像。對病變骨骼進行三維CAD重構(gòu)， 重構(gòu)軟件采用比利時materialise公司的CT MIMICS。通過對比度增強、閏值化、輪廓編輯、三維區(qū)域增長、平滑處理、三維編輯等處理，獲得病變骨骼的三維以D重構(gòu)模型。所述模型可輸出成STL文件，供快速成型機直接加工實物模型。4 )塑形支架材料
首先對一般不規(guī)則的小塊片狀材料進行初步預(yù)處理，切割成基本規(guī)則的長方體，再置入預(yù)先制作的長方形模框中，用骨水泥粘合成一個整體。得到所需的一定規(guī)格的基材，包括板材和/或棒料。根據(jù)CT重構(gòu)得到的數(shù)據(jù)直接用CNC將基材加工成所需形狀。5 )將上述接種有MSC的松質(zhì)骨直接填塞入組織工程化皮質(zhì)骨框架中，構(gòu)建成個體化的組織工程化骨組織。
權(quán)利要求
1.一種通過組織工程構(gòu)建的骨組織，其特征在于先對皮質(zhì)骨支架材料進行塑形，構(gòu)建骨皮質(zhì)框架，其中空部位填塞松質(zhì)骨替代品；皮質(zhì)骨支架材料的塑形是根據(jù)所需修復(fù)骨缺損的具體形態(tài)進行，皮質(zhì)骨支架材料是同種異體或異種骨脫細胞基質(zhì)，同種異體鍛燒骨，同種異體凍干骨，珊瑚，羥基磷灰石和磷酸三鈣；松質(zhì)骨替代品是同種異體或異種骨脫細胞基質(zhì)，同種異體鍛燒骨，同種異體凍干骨，珊瑚，羥基磷灰石和磷酸三鈣等，松質(zhì)骨替代品種植有骨髓間質(zhì)干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過組織工程構(gòu)建的骨組織，其特征在于通過下述方法制備A.提取并在體外擴增患者自體MSC，制成種子細胞；B.將上述種子細胞接種于柔軟的松質(zhì)骨支架材料上，構(gòu)建組織工程化松質(zhì)骨；C.構(gòu)建組織工程化骨三維計算機輔助設(shè)計(CAD)重構(gòu)模型；D.利用皮質(zhì)骨支架材料個體化構(gòu)建組織工程化骨皮質(zhì)骨框架；E.將上述組織工程化松質(zhì)骨充填入皮質(zhì)骨框架內(nèi)構(gòu)建完整的組織工程化骨組織。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過組織工程構(gòu)建的骨組織。本發(fā)明根據(jù)所需修復(fù)骨缺損具體形態(tài)對組織工程化骨支架材料進行塑形。所得組織工程化骨外層為骨皮質(zhì)框架，其中間部位由接種有骨髓間質(zhì)干細胞的松質(zhì)骨替代品替代正常骨結(jié)構(gòu)中松質(zhì)骨和骨髓成分。本發(fā)明組織工程化骨組織具有與正常骨組織相似的皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨及細胞成分。臨床應(yīng)用中，醫(yī)師可根據(jù)患者的CT片預(yù)先測定手術(shù)切除范圍，并按缺損部分的CT重構(gòu)數(shù)據(jù)對組織工程化骨支架材料進行塑形，從而實現(xiàn)個體化治療。
文檔編號A61L27/36GK102475912SQ20101055355
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者杜沖 申請人:大連創(chuàng)達技術(shù)交易市場有限公司