專利名稱：抗過敏的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用在食品或醫(yī)藥中的抗過敏乳酸菌菌株組合物，及其在提高抗過敏能力中的用途。
背景技術(shù)：
近幾年來，過敏疾病有逐年增加的趨勢，不論是在異位性皮膚炎、過敏性鼻炎和支氣管性氣喘的發(fā)生率都有增加的情形。目前認為過敏疾病的發(fā)生可能與文明的進步有關(guān)，包括空氣的污染和感染的減少都是導致過敏疾病增加的一些可能原因。而目前氣喘的治療主要依靠藥物治療如使用類固醇和抑制肥大細胞釋放發(fā)炎物質(zhì)的藥物、氣管擴張劑和免疫療法等。但是，包括抗發(fā)炎藥物和氣管擴張劑在內(nèi)的藥物治療還是無法真正的改變過敏免疫反應(yīng)，所以只能說是治標的方法。而唯一能夠說是改變過敏免疫體質(zhì)的治療方式，便是所謂的減敏療法，但是減敏治療通常需要較長的一段時間，而且有時會出現(xiàn)一些副作用，因此也不能用于所有的病人。有關(guān)過敏疾病的增加，目前認為跟大環(huán)境的變化有密切關(guān)系，特別是在環(huán)境方面有更明顯的關(guān)系。人體腸道中的益生菌會刺激免疫系統(tǒng)作用，但如果在日常生活中食品所含抗生素或是類固醇的含量太高的話，都會導致腸道內(nèi)的益生菌降低，因而無法有效地刺激免疫細胞中輔助型T細胞I (Thl)的生成，而這些輔助型T細胞I的生成與輔助型T細胞2(Th2)相關(guān)過敏疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。因此，如果能利用保健食品刺激免疫系統(tǒng)，激發(fā)可以調(diào)節(jié)過敏免疫反應(yīng)中的Thl型免疫反應(yīng)來平衡過敏所引發(fā)的Th2型免疫反應(yīng)，將可達到改善過敏體質(zhì)的效果。在人類應(yīng)用微生物的歷史上，乳酸菌的應(yīng)用起源相當早。從早期乳制品的加工上發(fā)現(xiàn)，食用以乳酸菌發(fā)酵的食品，有助于改善人類腸胃道疾病的發(fā)生率以及延長平均壽命。由此，引發(fā)許多學者開始研究探討乳酸菌在促進人體健康中所起的作用。1954年提出功能性乳酸菌之后，在幾年間不斷掀起研究的熱潮，并于1965年由Lilly DM等人正式提出Probiotic-益生菌的概念,使之成為功能性乳酸菌的統(tǒng)稱。一般食用含乳酸菌(LAB)的產(chǎn)品僅具有調(diào)整腸道的健康效果，雖然有數(shù)以萬計的乳酸菌菌株存在于自然界，但僅有少數(shù)乳酸菌株具有抗過敏的特質(zhì)。少數(shù)這些細菌株所具有的耐酸與耐膽鹽能力、吸附粘膜表皮細胞的能力及在通過腸胃道后仍可存活的能力等特性，是篩選具有促進健康效果的菌株時的重要依據(jù)。時至今日，僅有少數(shù)幾株乳酸菌菌株經(jīng)證明具有抗過敏的健康效果，而乳酸菌對身體健康的功能在于菌株(strain)的特 異性而非菌種(species),這種對人類身體健康具有特殊功效的菌株被稱為功能性益生菌(Guidelines for the evaluation of probiotics in food ；Report of joint FAO/WHOworking group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food ；“食品益生菌評估指南”，F(xiàn)A0/WH0聯(lián)合工作組關(guān)于起草食品益生菌評估指南的報告，LondonOntario, Canada, 2002 年 4 月 30 日和 5 月 I 日:1_7)。過敏疾病，例如過敏性濕疹、蕁麻疹、反復發(fā)作的過敏性鼻炎及過敏性氣喘，在臺灣及其它發(fā)達國家中已成為嚴重的社會問題。導致過敏疾病流行程度的上升是有原因的，眾所皆知的衛(wèi)生學假說為嬰幼兒接觸免疫刺激病原體的機會愈少，愈容易引發(fā)過敏相關(guān)疾病(Strachan，1989)。過敏疾病發(fā)生時，人體內(nèi)的免疫反應(yīng)會使Thl細胞數(shù)量下降，連續(xù)產(chǎn)生多種細胞激素促使免疫反應(yīng)朝向Th2途徑，形成體液免疫反應(yīng)，例如IgE的產(chǎn)生及嗜伊紅細胞過多等(Romagnani, 1994 ；Holt, 1995)。在愛沙尼亞及瑞典這兩個國家的兒童人口中發(fā)現(xiàn)，患過敏疾病的兒童腸道內(nèi)的乳酸桿菌比無過敏疾病的孩童要少(Bj0__rkSten等，1999)。乳酸桿菌被認為可促進Thl的免疫反應(yīng)進而改善過敏癥狀(Cross等，2001)。再者，在以卵白蛋白誘發(fā)小鼠過敏的動物實驗模型中發(fā)現(xiàn)，讓小鼠以口服方式食用熱處理后的干酪乳酸菌Shitota株(Lactobacilluscasei strain Shitota),可抑制小鼠血清中IgE的含量(Matsuzaki等，1998)。此外，在以酪蛋白誘發(fā)小鼠過敏的動物實驗模型中證明，腹腔注射熱處理后的胚芽乳酸桿菌L-137 (Lactobacillus pi ant arum L-137),也可抑制 IgE 的產(chǎn)生(Murosaki 等，1998)。在由豕草花粉過敏引起的過敏癥狀中，口服糞腸球菌(Bnterococcus faecalis)FK-23萃取物，可使腹膜內(nèi)聚集的嗜伊紅細胞細胞量減少(Shimada等，2003)。人體的臨床試驗中，于孕婦待產(chǎn)期間服用糖和鼠李糖乳桿菌菌株GG(Lactobacillus rhamnosus strain GG),發(fā)現(xiàn)在嬰兒出生后兩年(Kallioma "ki等，2001)及嬰兒期后(Kalliomaki等，2003)，可降低嬰幼兒發(fā)生過敏性濕疹的風險及發(fā)生率。鼠李糖乳桿菌19070-2及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)DSM122460也可以適度地改善患有異位性皮膚炎的兒童的嚴重濕疹過敏癥狀(Rosenfeldt等，2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面廣義上包括由下列任一種生物性純培養(yǎng)物與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑組成的組合物嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株，二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號M 207038 ;加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株,二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號 M 207039 ;唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)PM_A0006 菌株，二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號M 207040 ;約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii) PM-A0009菌株,二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號 M 207041 ;嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus) PM-A0013 菌株,二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號M 207042。在本發(fā)明的一項具體實施方式
中，該組合物含有一種或一種以上所述菌株，優(yōu)選的生理上可接受的賦形劑或稀釋劑是一種食品，該食品可以是酸酵乳、酸乳酪(yogurt)、乳酪、乳制飲品、乳粉、茶飲料或咖啡中的任何一種?；蛘?，該組合物是藥物組合物，且其賦形劑或稀釋劑應(yīng)為藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。在另一項具體實施方式
中，采用了具有增強抗過敏能力的、生理上可接受的下列任一種菌株的同種或突變種的生物性純培養(yǎng)物嗜酸乳桿菌PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌PM-A0006菌株、約氏乳酸桿菌PM-A0009菌株或嗜酸乳桿菌PM-A0013 菌株。此外，在另一項具體實施方式
中，本發(fā)明可廣義包括通過促進白介素-12(IL_12)、或干擾素Y調(diào)控Thl型免疫反應(yīng)而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反應(yīng)過度的過敏現(xiàn)象的方法，所述方法包括給予哺乳動物可達到刺激Th I型免疫效果劑量的任一種前述生物性純培養(yǎng)物。再者，在另一項具體實施方式
中，采用了前述所定義菌株中一種以上生物性純培養(yǎng)物，優(yōu)選以組合物的形式給予該培養(yǎng)物與生理上可接受的賦形劑或稀釋劑，其中所述生理上可接受的賦形劑或稀釋劑優(yōu)選為食品，該食品優(yōu)選是酸酵乳、酸乳酪、乳酪、乳制飲品、乳粉、茶飲料或咖啡中的任一種?；蛘?，該組合物是藥物組合物，且其賦形劑或稀釋劑應(yīng)為藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。在另一項具體實施方式
中，提供了上述任一或多種生物性純培養(yǎng)物在制備用于刺激免疫細胞分泌抗過敏相關(guān)細胞激素的藥物中的用途。
本發(fā)明亦可廣義的包括本申請說明書中單獨或總合說明的部分、其構(gòu)成要件與特征，及任何包含這些部分、構(gòu)成要件與特征中任何一種或多種的任何組合或其全部的組合，且若本文所述及的明確完整事物已在與本發(fā)明有關(guān)之相關(guān)技術(shù)中出現(xiàn)已知的同等物時，這些已知的同等物將視為獨立事項并入本文中。


圖I 顯不分別將 IO6 至 IO8 個 cfu 嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0002菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006 菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009 菌株或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013 菌株與 IO5 至 IO7 個人類外周血單核細胞(PBMC)共同培養(yǎng)48小時后，收取細胞上清液，以酶聯(lián)免疫分析法檢測干擾素Y (IFN-gamma)在上清液中的含量。其中，以無抗過敏功能的乳酸菌(干酪乳酸菌BCRC12249，Lactobacillus casei BCRC12249-臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所)為陰性對照組，PHA為陽性對照組，檢測干擾素Y的受刺激濃度。結(jié)果顯示試驗組可以顯著的刺激人類外周血單核細胞(PBMC)分泌干擾素Y，與陰性對照組有顯著性差異。圖2顯示分別將熱滅活的IO6至IO8個cfu嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005 菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)PM-A0006 菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillusjohnsonii)PM-A0009 菌株或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013 菌株與IO5至IO7個人類樹突狀細胞(dendritic cell)共同培養(yǎng)48小時，收取細胞上清液，以酶聯(lián)免疫分析法檢測白介素IL-12在上清液中的含量。其中，以無抗過敏功能的乳酸菌(干酪乳酸菌BCRC12249-臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所)為陰性對照組，PHA為陽性對照組，檢測白介素-12(IL-12)的受刺激濃度。結(jié)果顯示試驗組可以顯著的刺激人類樹突狀細胞分泌白介素-12 (IL-12)，與陰性對照組有顯著性差異。圖3顯示試驗結(jié)果顯示市售抗過敏乳酸菌在培養(yǎng)基的活化后，經(jīng)由酸性緩沖溶液及膽鹽處理后，菌數(shù)明顯下降；而本發(fā)明具有調(diào)節(jié)過敏作用的保藏乳酸菌株在培養(yǎng)基活化后，用酸性緩沖溶液及膽鹽處理，PM-A0006、PM-A0009、PM-A0013菌數(shù)并不受胃酸膽堿改變影響而急劇下降，PM-A0002及PM-A0005不受胃酸影響(菌數(shù)證明其對胃酸具有耐受性)，而將菌株經(jīng)由膽鹽處理時，雖然菌數(shù)有些許的下降，但對膽鹽仍有耐受性，證明這五株抗過敏的乳酸菌株可以通過人體消化系統(tǒng)嚴格環(huán)境的考驗。圖4顯示依據(jù)Jacobsen等學者(1999)的分析方法，當每個視野的平均菌數(shù)少于40個時，判定為“不附著(nonadhesive) ”；當每個視野的平均菌數(shù)介于41個至100個時，判定為“附著(adhesive)”；當每個視野的平均菌數(shù)大于100個時，判定為“強烈附著(strongly adhesive)”。結(jié)果顯不嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus) PM-A0002 菌株、加氏乳酸桿菌(Lac tobacillus gasseri)PM-A0005菌株、唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006 菌株、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009 菌株等四株抗過敏菌株均判定“強烈附著”，而嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)PM-A0013菌株則判定為“附著”。圖5顯示抗過敏乳酸菌改善過敏實驗的設(shè)計流程，將管飼抗過敏乳酸菌的階段分為四期第一期為0 22天；第二期為23 36天；第三期為37 50天；第四期為51 53天。其間以腹腔注射卵白蛋白(OVA)致敏小鼠，分四次致敏，第一次為開始管飼的第2天；第二次為開始管飼的第16天；第三次為開始管飼的第30天；第四次為開始管飼的第44天。對通過腹腔注射卵白蛋白(ovalbumin ;0VA)致敏的小鼠進行隔周抽血，檢查小鼠體內(nèi)IgE含量的變化。于處死小鼠前4天(第54天)以鼻粘膜吸入方式致敏小鼠連續(xù)2天后，檢測小鼠的肺呼吸阻力反應(yīng)，隔天處死小鼠進行其它生化值的檢測。圖6顯示為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM-A0006乳酸菌株時，以卵白蛋白致敏的小白鼠血清中卵白蛋白(OVA)特異性抗體效價部分，隨著喂食劑量增加，卵白蛋白(OVA)致敏小鼠血清中的卵白蛋白(OVA)特異性IgE抗體有減少的趨勢。圖7顯示為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM-A0006乳酸菌株時，以卵白蛋白致敏的小白鼠肺呼吸阻力部分，相對于對照組，均可在高濃度乙酰甲膽堿(methacholine)刺激下顯著減低小鼠Penh值。圖8顯示為小白鼠補充唾液乳酸桿菌PM-A0006乳酸菌株時，以卵白蛋白致敏的小白鼠肺沖洗液中細胞組成部分，相對于對照組，有顯著較低的嗜伊紅細胞(eosinophil)浸潤比例。圖9顯示相對于對照組，喂食PM-A0006乳酸菌可顯著降低肺沖洗中嗜酸粒細胞趨化因子(eotaxin)的分泌量。圖10顯示相對于對照組，喂食PM-A0006乳酸菌可顯著降低肺沖洗中PGE2分泌量。圖11顯示脾臟細胞經(jīng)ConA或卵白蛋白(OVA)刺激培養(yǎng)48小時后，在ConA刺激下，喂食PM-A0006乳酸菌組的脾臟細胞分泌的干擾素Y顯著高于對照組。
具體實施例方式本發(fā)明可廣義的包括下列任一種生物性純培養(yǎng)物嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)PM-A0002菌株,二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號M 207038 ;加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)PM-A0005菌株，二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號M 207039 ;唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)PM-A0006菌株,二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號M 207040 ;約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009菌株，二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號M 207041 ;嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)PM-AOO13菌株,二〇〇七年四月六日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號 M 207042。許多文獻指出增加輔助型T細胞I的細胞激素包括白介素-12(IL_12)、干擾素Y (IFN-gamma)的分泌增加,可以有效改善過敏癥狀；進一步的研究也指出特定的乳酸菌株和樹突狀細胞上Toll樣受體(Toil-like receptor)結(jié)合，活化細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)譯蛋白移至核內(nèi)而釋放大量細胞激素，屬于先天免疫的一個環(huán)節(jié)，因此某些特定的乳酸菌菌種借由其細胞壁多糖類物質(zhì)如肽聚糖(peptidoglycan)、脂多糖(Iipopolysaccharide)、多糖(polysaccharide)等,經(jīng)先天免疫系統(tǒng),確實能活化T細胞的發(fā)育。該五株細菌菌株的冷凍干燥培養(yǎng)物已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢市武漢大學。保藏的詳細資料如表I所示表I
權(quán)利要求
1.ー種食品組合物，其包含 刺激免疫細胞分泌抗過敏相關(guān)細胞激素濃度的約氏乳酸桿菌(Lactobacillusjohnsonii)PM-A0009 =CCTCC NO :M207041，及生理上可接受的賦形劑與稀釋劑中的任何一種。
2.如權(quán)利要求I所述的食品組合物，其特征在于，所述菌株是活菌或死菌。
3.如權(quán)利要求I所述的食品組合物，其特征在于，所述的生理上可接受的賦形劑或稀釋劑為ー種食品。
4.如權(quán)利要求I所述的食品組合物，其特征在于，所述的食品為發(fā)酵乳、乳酪、乳制飲品、乳粉、茶或咖啡中的任ー種。
5.如權(quán)利要求4所述的食品組合物，其特征在于，所述的乳酪為酸乳酪。
6.一種用于抗過敏的藥物組合物，其包含刺激免疫細胞分泌抗過敏相關(guān)細胞激素濃度的約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009 CCTCC NO :M207041，及藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述菌株是活菌或死菌。
8.—種生物性純培養(yǎng)物在制備用于刺激免疫細胞分泌抗過敏相關(guān)細胞激素的藥物中的用途，其特征在于該生物性純培養(yǎng)物是約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)PM-A0009 CCTCC NO :M207041。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的乳酸菌菌株，及含一種或多種所述菌株的組合物，其中所述菌株具有現(xiàn)有技術(shù)中未知的可用于增進抗過敏的能力，且該組合物為食品或藥物組合物形式。本發(fā)明還公開了篩選測定乳酸菌菌株的方法，以及通過增進Th1型免疫反應(yīng)來調(diào)控因過敏而反應(yīng)過度的Th2型免疫反應(yīng)的方法。
文檔編號A61P37/08GK102657260SQ20101053531
公開日2012年9月12日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者吳奇璋, 楊瓊英, 蘇偉志, 蔡宜鈞, 謝佩珊, 郭仲偉, 陳怡君 申請人:東宇生物科技股份有限公司