專利名稱：一種中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素a含量高效液相色譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥兩頭尖的檢測方法，特別涉及中藥兩頭尖及其制劑的含量檢測方法。
背景技術(shù)：
兩頭尖又名竹節(jié)香附，為兩頭尖為毛莨科植物多被銀蓮花AnemoneraddeanaRegel的干燥根莖。主要分布于東北三省及山東、河北、山西等地，以吉林省產(chǎn)量最多。藥材多夏季采挖，除去殘莖及須根，曬干。此藥首載于明朝劉文泰所著《本草品匯精要》。具有“祛風除濕，消癰腫”之功效。早在清代，王旭高的“定癌散”曾以兩頭尖治療乳癌。現(xiàn)在臨床用于風寒濕痹，手足拘攣，骨節(jié)疼痛，癰疽腫痛。多與其它藥物配伍，不單方入藥，是著名中成藥“活絡(luò)丹”和“再造丸”的主要原料。本品富含三萜皂苷類，其中三萜皂甙銀蓮花素A為抗腫瘤的主要有效成分之一。關(guān)于兩頭尖藥材中的銀蓮花素A檢測方法，在現(xiàn)有技術(shù)中均為采用高效液相色譜法使用紫外檢測器檢測進行含量測定，由于是皂苷類成分，在紫外吸收光譜上，只有末端吸收，通常紫外波長選擇為206nm左右作為測定波長，因此色譜峰響應(yīng)值低，靈敏度差，流動相及雜質(zhì)干擾較嚴重，從而使整個方法重現(xiàn)性不好，測定結(jié)果誤差很大。2010年版中國藥典一部兩頭尖項下，采用甲醇索氏提取、乙醚脫脂、水飽和正丁醇反復(fù)萃取的樣品處理方法，并輔以乙腈與0. 磷酸溶液梯度洗脫方式為流動相的色譜條件，才得以完成高效液相色譜法-紫外檢測器檢測銀蓮花素A的含量，樣品處理時間約10 15小時，由于供試品處理方法繁瑣，易導(dǎo)致測定結(jié)果誤差，梯度洗脫方式的流動相又極易使色譜峰分離基線不穩(wěn)。并且采用上述現(xiàn)有方法對成藥中兩頭尖藥材銀蓮花素A含量測定，幾乎無法進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素A含量高效液相色譜檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的操作復(fù)雜、重現(xiàn)性差、靈敏度低的問題，該方法適用于兩頭尖藥材、兩頭尖制劑的質(zhì)量控制。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是采用蒸發(fā)光散射檢測器，以外標兩點法定量，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈與水的混合液作為流動相，流動相的流速為每分鐘0. 2 Iml ；樣品預(yù)處理采用甲醇超聲處理法。本發(fā)明方法包括以下步驟1、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為80 93 20 7的乙腈-水或82 95 18 5的甲醇-水；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流動相的流速為每分鐘0. 2 Iml ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度60 130°C，空氣流速1. 0 3. lL/min。2、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；
3、供試品溶液的制備取兩頭尖粉末2 8g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理0. 5 1小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；4、測定法精密吸取對照品溶液5μ 1、15μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，以外標二點法對數(shù)方程計算，即得；有益效果本發(fā)明采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素A的含量，操作方法相比已有方法十分簡單。方法學驗證表明，該法分離效果良好，方法線性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、加樣回收率等方法學考察均符合定量測定的要求。能夠更有效地控制中藥兩頭尖及其制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。樣品處理時間約0.5小時，大大提高了檢測效率，減少了環(huán)境污染，節(jié)約了檢測成本，方法簡便、快捷、準確。本發(fā)明還適合用兩頭尖作為原料藥或原料藥之一的制劑，包括片劑、粒劑等臨床或藥學上可接受的常用劑型。


圖1是對照品竹節(jié)香附素A蒸發(fā)光散射檢測器檢測圖譜；圖2是兩頭尖藥材蒸發(fā)光散射檢測器檢測圖譜；圖3是前列通片蒸發(fā)光散射檢測器檢測圖譜。
具體實施例方式儀器日本島津LC-IOAtvp高效液相色譜儀，浙江大學2010雙通道色譜工作站；美國奧泰ELSD2000ES蒸發(fā)光散射檢測器；梅特勒.托利多AB^5_S電子天平。試藥竹節(jié)香附素A化學對照品，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，純度經(jīng)檢查符合含量測定用化學對照品的技術(shù)要求，含量為> 98% ；甲醇色譜純，水自制雙蒸水；樣品中藥兩頭尖藥材。前列通片，批號20100225(廣州中一藥業(yè)有限公司)實施例1(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以為填充劑；流動相乙腈-水80 20;蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速0. 2ml/min ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度60°C，空氣流速1. 0L/minoO)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供試品溶液的制備取兩頭尖粉末2g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理0. 5小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；(4)、測定法精密吸取對照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，以外標二點法對數(shù)方程計算，即得；實施例2
(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相乙腈-水86 14 ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速0. 6ml/min ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度90°C，空氣流速2. OL/min。O)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供試品溶液的制備取兩頭尖粉末5g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理0. 8小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；(4)、測定法精密吸取對照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，以外標二點法對數(shù)方程計算，即得；實施例3(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相乙腈-水93 7;蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速lml/min;蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度:130°C，空氣流速3. lL/min。O)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供試品溶液的制備取兩頭尖粉末8g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；(4)、測定法精密吸取對照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，以外標二點法對數(shù)方程計算，即得；實施例4(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相甲醇-水82 18;蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速0. 2ml/min;蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度60°C，空氣流速1. OL/min。O)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供試品溶液的制備取兩頭尖粉末2g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理0. 5小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；(4)、測定法精密吸取對照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，以外標二點法對數(shù)方程計算，即得；實施例5(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相甲醇-水95 5;蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速lml/min;蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度:130°C，空氣流速3. lL/min。
O)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供試品溶液的制備取兩頭尖粉末8g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；(4)、測定法精密吸取對照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，以外標二點法對數(shù)方程計算，即得；實施例6(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱Diamonsil C18, 250 X 4. 6mm ；5 μ ；流動相甲醇-水 85 15 ；流速0. 8ml/min ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度80°C，空氣流速2. OL/min ；柱溫室溫。O)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 42mg的溶液，即得。(3)、供試品溶液的制備取中藥兩頭尖粉末5g，過三號篩，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得；0)、測定法分別精密吸取對照品溶液各5 μ 1、15 μ 1、供試品溶液10 μ 1注入液相色譜儀。此條件下竹節(jié)香附素A與其它組分達到基線分離，分離度R > 1. 5，理論塔板數(shù)按竹節(jié)香附素A計算大于6000，竹節(jié)香附素A保留時間約為14分鐘?？疾炝思状?水和乙腈-水等不同的流動相比例及不同的流動相流速，結(jié)果流動相為乙腈-水(80 93 20 7)或甲醇-水(82 95 18 5)，流速為每1分鐘0. ^iil至lml，竹節(jié)香附素A均能分離；以流動相為乙腈-水(80 93 20 7)或甲醇-水(82 95 18 5)，流速為每1分鐘0.2ml至0.8ml，效果更優(yōu)。線性關(guān)系考察精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml中含竹節(jié)香附素AO. 42mg的溶液，作為對照品溶液。分別精密吸取4、8、12、16、20μ 1，注入高效液相色譜儀，按上述條件測定，以峰面積的自然對數(shù)為縱坐標，竹節(jié)香附素A進樣量的自然對數(shù)為橫坐標，線性回歸，得回歸方程為LnA = 60243LnC+l. 531,r = 0. 9993?？捎猛鈽藘牲c法對數(shù)方程進行測定和計算。精密度試驗取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，計算精密度。穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液，每隔一定時間進樣一次，比較測定結(jié)果的穩(wěn)定性。重現(xiàn)性試驗取同一批號樣品，進行5次平行測驗(即η =幻，計算相對標準偏差(RSD % )，比較重現(xiàn)性?；厥章试囼灡驹囼灢捎眉訕踊厥辗ǎ芊Q取已知含量的樣品5份，分別精密加入一定量竹節(jié)香附素A對照品，按含量測定法進行測定，計算竹節(jié)香附素A的回收率。結(jié)果實驗結(jié)果表明竹節(jié)香附素A的檢測限為10ng，竹節(jié)香附素A的線性范圍為1.68 8.4118;精密度為0. 23% ；竹節(jié)香附素A在12小時內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.21% ；本測定方法具有良好的重現(xiàn)性，RSD為1.02% ；竹節(jié)香附素A的加樣回收率為99. 01%，RSD為1. 55% ；經(jīng)測定中藥兩頭尖藥材中竹節(jié)香附素A含量為0. 34%。實施例7 前列通片含量測定(1)、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱Diamonsil C18, 250 X 4. 6mm ；5 μ ；流動相甲醇-水 85 15，流動相的流速0. 8ml/min ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度80°C，空氣流速2. OL/min ；柱溫室溫。O)、對照品溶液的制備精密稱取竹節(jié)香附素A對照品適量，加甲醇制成每Iml含0. 42mg的溶液，即得。(3)、供試品溶液的制備，取前列通片，研細，混勻，取約6g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理0. 5小時，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；量取續(xù)濾液10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至IOml量瓶并稀釋至刻度，搖勻，用0. 45 μ m的微孔濾膜濾過，即得。陰性樣品溶液的制備陰性樣品溶液是按處方比例稱取除中藥兩頭尖外其余輔料，按制法制成中藥兩頭尖陰性樣品，再取此陰性樣品按上述“供試品溶液的制備”方法制備不含中藥兩頭尖的陰性樣品溶液。0)、測定法分別精密吸取對照品溶液5 μ 1、15 μ 1、供試品溶液及不含中藥兩頭尖的陰性樣品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀。此條件下竹節(jié)香附素A與其它組分達到基線分離，分離度R > 1. 5，理論塔板數(shù)按竹節(jié)香附素A計算大于6000，竹節(jié)香附素A保留時間約為14分鐘，陰性樣品溶液色譜在相應(yīng)位置無吸收峰，可見陰性無干擾。檢測結(jié)果經(jīng)測定前列通片中竹節(jié)香附素A含量為2. 9aiig/片。
權(quán)利要求
1.一種中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素A含量的高效液相色譜檢測的方法，其特征在于采用蒸發(fā)光散射檢測器，以外標兩點法定量，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈與水的混合液作為流動相，流動相的流速為每分鐘0. 2 Iml ；樣品預(yù)處理采用甲醇超聲處理法。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素A含量的高效液相色譜檢測的方法，其特征在于流動相為80 93 20 7的乙腈-水或82 95 18 5的甲醇-水。
3.如權(quán)利要求1所述的中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素A含量的高效液相色譜檢測的方法，其特征在于流動相的流速為每分鐘0. 2 Iml ；蒸發(fā)光散射檢測器檢測的漂移管溫度60 130°C，空氣流速1. 0 3. lL/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥兩頭尖中竹節(jié)香附素A含量的高效液相色譜檢測方法，屬于中藥兩頭尖的檢測方法，該方法采用蒸發(fā)光散射檢測器，以外標兩點法定量，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇或乙腈與水的混合液作為流動相，流動相的流速為每分鐘0.2～1ml；樣品預(yù)處理采用甲醇超聲處理法。優(yōu)點是靈敏度高、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，能夠有效地控制中藥兩頭尖藥材及其制劑的質(zhì)量。
文檔編號A61P35/00GK102379934SQ20101027509
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者于江波, 仲崇琳, 楊美林 申請人:仲崇琳