專利名稱：一種亞洲雨林蝎毒抗菌多肽基因及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種亞洲雨林蝎毒抗菌多肽基因，還涉及 該蝎毒抗菌多肽基因的制備方法，同時(shí)還涉及該蝎毒抗菌多肽基因的用途，高活性抗菌多 肽功能鑒定。具體地說，本發(fā)明涉及一種亞洲雨林蝎抗菌多肽基因的分離鑒定；涉及一種蝎 抗菌多肽的抗菌譜鑒定采用化學(xué)合成手段生產(chǎn)的亞洲雨林蝎毒抗菌多肽對(duì)真菌具有廣譜 抗性；還涉及一種蝎抗菌多肽的抗真菌功能鑒定，具有潛在抗真菌藥物開發(fā)的價(jià)值。
背景技術(shù)：
真菌對(duì)于健康人體而言是條件致病菌，但是當(dāng)機(jī)體抵抗力低，外部條件不良時(shí)，就 有可能造成系統(tǒng)或局部真菌感染。近年來，抗生素耐藥性問題已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。中 國(guó)是世界上濫用抗生素較為嚴(yán)重的國(guó)家，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)，已占到住院感染患 者總?cè)藬?shù)的百分之三十左右。耐藥菌另一個(gè)危害是可以在不同地區(qū)、國(guó)家之間的人群之間 傳播。白色念球菌是引起真菌感染的常見病源菌，近年來白色念球菌對(duì)真菌藥物的耐藥性 呈上升趨勢(shì)，是臨床感染控制中棘手的難題。大量研究表明，在感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染(注射細(xì)菌或真菌，體壁損傷等) 的情況下，昆蟲能快速合成大量抗菌肽，迅速殺滅已侵入的病菌，并阻止病菌的繼續(xù)侵染。 到目前為止，在昆蟲中已發(fā)現(xiàn)了大量的抗細(xì)菌肽，抗真菌肽，以及既抗真菌又抗細(xì)菌的抗菌 肽。這些抗菌肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜抗菌能力，對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有作用。此外， 還有作用機(jī)制獨(dú)特，對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞無(wú)害等特點(diǎn)，在面臨抗藥性和篩選新的抗生素極 端困難的情況下，昆蟲抗菌肽可能成為抗生素的新來源。蝎子是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的藥用史。明朝《本 草綱目》更詳細(xì)記載蝎主治“諸風(fēng)癮疹、中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、語(yǔ)澀、手足抽摯，小兒驚 癇風(fēng)搐”等多種疾病，具有抗腫瘤，殺蟲，抑菌和抗菌功效，其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌 的毒液。毒液的主要成分是一類由10-100個(gè)氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多 肽，它們可以選擇性、特異性的與細(xì)胞膜上的膜蛋白相互作用，從而改變細(xì)胞對(duì)離子的通透 能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、PH、膜電位、興奮性等多種細(xì)胞代謝過程和細(xì)胞分泌、激素作用和信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程。據(jù)估計(jì)，約有100000種不同生物活性肽存在于各種蝎毒腺中。因此， 蝎毒素具有重要的理論研究意義和應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。對(duì)東亞鉗蝎有實(shí)驗(yàn)研究表明，全蝎乙醇提取物在體外對(duì)8種表淺致病真 菌均有抑制作用，尤其對(duì)裴氏著色菌、中克氏孢子絲菌、石膏樣毛癬菌、絮狀表皮癬 菌較為敏感，其抗真菌作用優(yōu)于大蒜浸出液。本發(fā)明獲得的Hsl404是從亞洲雨林 蝎毒腺中分離的一新基因。同時(shí)，目前涉及東亞鉗蝎毒腺毒素基因的專利有7項(xiàng) X東亞鉗蝎毒素BmKAS在制藥中的應(yīng)用，該發(fā)明涉及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗外周傷 害藥中的應(yīng)用，以及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗痛覺過敏藥中的應(yīng)用；f: 一種含有雙價(jià) 抗蟲基因的重組桿狀病毒，該發(fā)明涉及東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因BmKIT與一種
3昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)，獲得含雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒AcNPV-BmKIT-Chi ;:t蝎抗 心律失常肽重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，該發(fā)明涉及了一種蝎抗心律失常肽BmKIM基因重 組大腸桿菌，用于大量生產(chǎn)可溶、具有抗心律失?；钚缘闹亟M肽；蝎抗心律失常肽及其 制備方法和應(yīng)用，該發(fā)明公開了一種蝎抗心律失常肽BmKIM及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明 所得到的重組BmKIM多肽具有高效抗心律失?；钚?，且可溶性好，產(chǎn)量高；甚一種人工合成 的蝎氯離子通道神經(jīng)毒素基因-rBmKCTa，該專利涉及到氯離子通道神經(jīng)毒素BmKCT基因， 采用基因工程所得的改良的重組蝎氯離子通道神經(jīng)毒素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用，可 用于制備通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以治療的疾病的藥物；:1 一種過渡型蝎毒素BmKabT的 用途，本發(fā)明公開了的過渡型蝎毒素BmKabT的用途，它可以作為一個(gè)獨(dú)特的鈉通道調(diào)制 劑，研究鈉通道組成、結(jié)構(gòu)和功能的探針，可調(diào)節(jié)和治療鈉通道相關(guān)疾病的調(diào)制劑和藥 品，可制備調(diào)節(jié)或治療高血鉀性麻痹、先天性肌強(qiáng)直及其它骨骼肌疾病、第三類長(zhǎng)QT間隔 癥(LQT3)、原發(fā)性心室纖顫及其他心臟疾病的調(diào)制劑或藥品 ’ T 一種重組蝎昆蟲毒素及其 可溶性表達(dá)和純化方法，該發(fā)明涉及一種重組蝎昆蟲毒素rBmKIT及其可溶性表達(dá)和純化 方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種從亞洲雨林蝎毒腺cDNA文庫(kù)中蝎篩選獲得抗真 菌多肽基因。該文庫(kù)毒素基因覆蓋率達(dá)到95%以上。且獲得抗真菌多肽基因的方法快速、 簡(jiǎn)便。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種亞洲雨林蝎毒抗菌多肽基因的制備方法， 該方法易行，操作簡(jiǎn)單、方便。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種亞洲雨林蝎毒抗真菌多肽基因在制備治 療或預(yù)防真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的藥物中的應(yīng)用。該亞洲雨林蝎抗真菌多肽殺菌速度快、效 果好。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施 一種亞洲雨林蝎毒抗菌多肽的制備方法，其步驟是
A、構(gòu)建亞洲雨林蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，包括其毒腺用于總RNA的分離；取500mg的蝎 尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA，再通過甲醛電泳檢測(cè)總 RNA的質(zhì)量；
B、通過A步驟制備的蝎毒腺總RNA量為3mg，采用PolyATract mRNA分離系統(tǒng)(購(gòu)自美 國(guó)Promega)分離和純化mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其獲得的蝎毒腺mRNA質(zhì)量和數(shù)量；
C、用5μ gmRNA為起始量，進(jìn)行cDNA的第一鏈和第二鏈合成；
D、繼續(xù)雙鏈cDNA與SalI銜接頭的連接，NotI消化雙鏈cDNA，去除雙鏈cDNA分子中的 過量SalI銜接頭和酶切片段；
E、雙鏈cDNA與pSPORTl載體(美國(guó)Invitrogen)的連接和轉(zhuǎn)化，毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)的 鑒定，從亞洲雨林蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)中挑選2000克隆子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)1404號(hào)克隆子為一 種蝎毒抗真菌多肽基因；
F、采用固相化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗真菌多肽Hsl404，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，Hsl404對(duì)真菌白色念球菌(最小抑菌濃度MIC為12. 5 μ g/ml)、近平滑假絲酵母(MIC為 25μ g/ml)、釀酒酵母(最小抑菌濃度MIC為25μ g/ml)具有不同濃度的抑制作用。因此蝎 毒抗真菌多肽Hsl404具有潛在抗真菌藥物開發(fā)的價(jià)值。一種構(gòu)建高質(zhì)量亞洲雨林蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)的方法，毒素基因覆蓋率達(dá)到95% 以上。構(gòu)建高質(zhì)量亞洲雨林蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)的技術(shù)路線如

圖1。包括購(gòu)買亞洲雨林蝎 經(jīng)電擊取毒后48h，其毒腺用于總RNA的分離(圖2)；取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉 末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA ；制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢 測(cè)其質(zhì)量(圖3)。通過上述方法制備的蝎毒腺總RNA量為2mg，采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(購(gòu) 自美國(guó)Promega)分離和純化mRNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其獲得的蝎毒腺mRNA量約10 μ g。 用5 μ gmRNA作為起始量，進(jìn)行cDNA的第一鏈和第二鏈合成，繼續(xù)雙鏈cDNA與SalI銜接頭 的連接，NotI消化雙鏈cDNA，去除雙鏈cDNA分子中的過量SalI銜接頭和酶切小片段，雙鏈 cDNA與pSPORTl載體(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen)的連接和轉(zhuǎn)化，毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)的鑒定等 步驟。結(jié)果獲得了一個(gè)豐度為1.8*108個(gè)克隆子/ygcDNA。采用該方法構(gòu)建的蝎毒腺cDNA 文庫(kù)陽(yáng)性插入率達(dá)到95%以上(圖4)，亞洲雨林蝎的毒素基因覆蓋率達(dá)到95%以上。一種從亞洲雨林蝎毒腺cDNA文庫(kù)中篩選獲得蝎毒抗菌多肽基因。將5ng cDNA和 25ng pSPORTl載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌液800 μ 1均勻涂布于10個(gè)LB/Αρ+平板(每板80 μ 1 菌液)，37°C培養(yǎng)過夜，每個(gè)平板大約含有100個(gè)左右的菌落(克隆子)，將其逐一用牙簽接種 至含有950 μ 1的LB/Αρ+平板培養(yǎng)基的1. 5ml Ep管(并按順序編號(hào))，37°C 280rpm振搖過 夜，次日從每管取出ΙΟΟμΙ，將文庫(kù)克隆子送公司測(cè)序。結(jié)果表明1404克隆子為一個(gè)新的 亞洲雨林蝎抗真菌多肽基因，命名為Hsl404。一種分離的蝎毒抗真菌多肽基因，其基因序列 為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。一種亞洲雨林蝎毒抗菌肽。Hsl404的前體組織形式編碼69個(gè)氨基酸殘基，由 三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(23個(gè)殘基)、成熟肽(14個(gè)殘基)和前體肽(32個(gè)殘基)，見圖5。 基于蝎毒素前體C末端殘基的加工規(guī)則，Hsl404末端最后的殘基Lys被特異性羧肽酶 (Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，本發(fā)明提供一個(gè)亞洲雨林蝎蝎毒抗真菌多 肽GLLFKLQTGAKSVR，一種分離的蝎毒抗真菌多肽蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列。一種作用于真菌的蝎抗菌肽，可作為抗菌藥物開發(fā)。通過固相化學(xué)合成的方法，得 到了純度達(dá)95%以上，且與天然抗菌肽Hsl404氨基酸序列一致的合成多肽(質(zhì)譜分析分子 量和HPLC分析純度)(圖6)?？咕Y(jié)果表明對(duì)真菌白色念球菌(圖7)、釀酒酵母(圖8)、近 平滑假絲酵母(圖9)具有不同濃度的抑制作用，請(qǐng)見下表1。表1 蝎毒抗菌肽Hsl404藥物的抑制真菌效果
權(quán)利要求
一種分離的蝎毒抗真菌多肽基因，其基因序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蝎毒抗真菌多肽蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種蝎毒抗真菌多肽基因的制備方法，其步驟是A、構(gòu)建亞洲雨林蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，包括其毒腺用于總RNA的分離；取500mg的蝎 尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA ；B、通過(A)步驟制備的蝎毒腺總RNA量為3mg，采用PolyATract mRNA分離系統(tǒng)分離 和純化mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其獲得的蝎毒腺mRNA ；C、用5μ gmRNA為起始量，進(jìn)行cDNA的第一鏈和第二鏈合成；D、繼續(xù)雙鏈cDNA與SalI銜接頭的連接，NotI消化雙鏈cDNA，去除雙鏈cDNA分子中的 過量SalI銜接頭和酶切片段；E、雙鏈cDNA與pSPORTl載體的連接和轉(zhuǎn)化，毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)的鑒定，從亞洲雨林蝎 毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)中挑選2000克隆子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)1404號(hào)克隆子為一種蝎毒抗菌肽基因。
4.權(quán)利要求1所述的一種蝎毒抗真菌多肽基因在制備治療或預(yù)防真菌的藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種蝎毒抗真菌多肽基因在制備治療或預(yù)防革蘭氏陽(yáng)性菌的藥 物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種亞洲雨林蝎毒抗菌多肽基因及制備方法和應(yīng)用，其步驟是A、構(gòu)建亞洲雨林蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，包括其毒腺用于總RNA的分離；取蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA；B、通過制備的蝎毒腺總RNA量，采用PolyATractmRNA分離系統(tǒng)分離和純化mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其獲得的蝎毒腺mRNA；C、用RNA為起始量，進(jìn)行cDNA的第一鏈和第二鏈合成；D、繼續(xù)雙鏈cDNA與SalI銜接頭的連接，NotI消化雙鏈cDNA，去除雙鏈cDNA分子中的過量SalI銜接頭和酶切片段；E、雙鏈cDNA與pSPORT1載體的連接，毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)的鑒定，從亞洲雨林蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)中挑選克隆，為蝎毒抗菌肽基因。該方法易行，成本低，水溶性好。該亞洲雨林蝎抗真菌多肽殺菌速度快、效果好。
文檔編號(hào)A61P31/10GK101948842SQ20101027057
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者吳英亮, 曹志賤, 曹路揚(yáng), 李文鑫, 樊拯 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)