專利名稱：水飛薊或水飛薊賓用于治療神經(jīng)受損的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水飛薊或水飛薊賓用以治療神經(jīng)損傷的用途。
背景技術(shù)：
水飛薊是一種由乳薊(milk thistle, Silybum marianum)分離的黃酮木脂素混合 物，常用于治療肝臟病癥。其亦具有抗發(fā)炎、細(xì)胞保護(hù)、及抗致癌活性。水飛薊賓是水飛薊 中的主要黃酮木脂素，且其已被發(fā)現(xiàn)具有上述的治療效應(yīng)。脊髓損傷(SCI)是脊髓的損害，其會(huì)造成感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)控制的喪失。其可能是由脊 髓的疾病(如，弗利德來(lái)運(yùn)動(dòng)失調(diào)(Friedreich' s ataxia))或物理創(chuàng)傷(如，挫傷)而造 成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于非可預(yù)期地發(fā)現(xiàn)水飛薊或水飛薊賓具有神經(jīng)保護(hù)活性并可改善脊 髓損傷大鼠的功能恢復(fù)。因此，本發(fā)明是關(guān)于一種治療神經(jīng)損傷(如，SCI)的方法，對(duì)需要該治療的個(gè)體投 與有效量的水飛薊或水飛薊賓。特定而言，可將水飛薊或水飛薊賓傳輸至損傷的神經(jīng)區(qū)域。 在一實(shí)施例中，可經(jīng)由注射而進(jìn)行鞘內(nèi)投與。用于本發(fā)明方法的水飛薊賓可為分離形式，亦 即，由合成方法制備或由天然來(lái)源(如，水飛薊)富集。分離的水飛薊賓化合物是指含有以 干重計(jì)至少40%該化合物的制備物。分離化合物的純度可由，如，管柱層析、質(zhì)譜、高效液相 層析(HPLC)、NMR、或任何其它適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)量。名辭“治療”在本文中是指對(duì)具有神經(jīng)損傷、該損傷的癥狀、或朝向該損傷的易感 性的個(gè)體，以治愈、療愈、減輕、緩解、改變、補(bǔ)救、改善、改良、或影響該損傷、該損傷的癥狀、 或朝向該損傷的易感性的目的，施用或投與包括一或多種活性劑的組合物。“有效量”在本 文中是指欲對(duì)該個(gè)體產(chǎn)生治療效應(yīng)所需的各種活性劑的量，其可能為單獨(dú)使用或是結(jié)合一 或多種其它活性劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，根據(jù)投與的途徑、賦形劑的選擇、以及其它藥 劑的共同使用，有效量可各有不同。本發(fā)明亦是關(guān)于一種以水飛薊或水飛薊賓增進(jìn)由SCI (如，挫傷性SCI)復(fù)原的方法。本發(fā)明亦包括水飛薊或水飛薊賓在制備用于治療神經(jīng)損傷的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明又包括水飛薊或水飛薊賓在制備用于增進(jìn)由脊髓損傷復(fù)原的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明一或多個(gè)具體實(shí)例的細(xì)節(jié)示于下文的敘述。本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點(diǎn)將可 由下文的附圖及數(shù)個(gè)具體實(shí)例的詳細(xì)敘述以及附呈的權(quán)利要求書(shū)而得悉。


上述發(fā)明內(nèi)容及以下具體實(shí)施方式
與所附附圖一并閱讀將更增了解。為達(dá)闡明本發(fā)明的目的，附圖中所示具體實(shí)例為目前較佳者。然而，應(yīng)了解本發(fā)明并不限于所示的特定 排列及結(jié)構(gòu)。在附圖中圖1顯示水飛薊及水飛薊賓在大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)于LPS及 紅藻胺酸誘發(fā)性毒性的效應(yīng)，其中(A)顯示各個(gè)處理組中每1. 5mm2的iNOS-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目 (Con =對(duì)照組；a =P < 0. 05 (LPS 對(duì)對(duì)照組)；b :P < 0. 05 (LPS+SM 對(duì) LPS)) ； (B)顯示各處 理組中iNOS及環(huán)氧合酶-2(C0X-2)的西方點(diǎn)漬分析結(jié)果(Con =對(duì)照組)；及(C)顯示各處 理組中釋入培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽量(a =P < 0. 05 (處理組對(duì)對(duì)照組)；b :P < 0. 05 (SM/LPS 或SB/LPS對(duì)LPS) ；SM =水飛薊；SB =水飛薊賓)。圖2顯示水飛薊及水飛薊賓在混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)于細(xì)胞增殖以及對(duì)于 H2O2-誘發(fā)性自由基形成的效應(yīng)，其中㈧顯示各個(gè)處理組中每1.5mm2的BrdU-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 目；及⑶顯示水飛薊(80 μ M)及水飛薊賓(80 μ Μ)對(duì)于H2O2-誘發(fā)性自由基形成(ROS)的 有效抑制。圖3顯示水飛薊在由(A)脊髓或(B)皮質(zhì)所制備的神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中 對(duì)于H2O2-誘發(fā)性自由基形成的劑量反應(yīng)性保護(hù)效應(yīng)。圖4(A)顯示水飛薊(80 μ Μ)及水飛薊賓(80 μ Μ)在脊髓神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培 養(yǎng)物中對(duì)于H2O2-或t-ΒΟΟΗ-誘發(fā)性自由基形成的效應(yīng)。圖4⑶顯示水飛薊(80 μ Μ)及水 飛薊賓(80 μ Μ)在皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)于H2O2-或t-B00H-誘發(fā)性自由基 形成的效應(yīng)。圖4 (C)顯示水飛薊(80 μ M)在小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)于H2O2-或t-B00H-誘 發(fā)性自由基形成的效應(yīng)。(*相較于對(duì)應(yīng)DMSO組的P < 0. 05)圖5顯示水飛薊及水飛薊賓在MTT分析中的結(jié)果。圖6顯示鞘內(nèi)投與水飛薊在挫傷性SCI大鼠中的效應(yīng)，以后肢功能的恢復(fù)說(shuō)明 (SM20 = 50% PEG 中的 20 μ g/ μ 1 水飛薊，6 μ 1/ 大鼠；SM5 = 50 % PEG 中的 5 μ g/ μ 1 水 飛薊，6 μ 1/ 大鼠；* 由單因子 ANOVA 及 Student-Newman-Keuls 法的 P < 0. 05)。圖7顯示大鼠脊髓中心的西方點(diǎn)漬分析結(jié)果，其指出水飛薊(SM)可減少損傷脊髓 中心的損傷誘發(fā)性EDl及環(huán)氧合酶-2 (C0X-2)表現(xiàn)。圖8顯示在鞘內(nèi)投與水飛薊(120yg/大鼠)后不同時(shí)程時(shí)于損傷脊髓中的水飛
薊賓保留情形。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是關(guān)于使用水飛薊或水飛薊賓以治療神經(jīng)損傷或協(xié)助由此種損傷復(fù)原的 用途。在本文中，辭句“由SCI復(fù)原”是指罹患SCI病患的病理狀況的改善及/或損傷脊 髓的生理功能的恢復(fù)(至少部分)。舉例而言，在用于本發(fā)明實(shí)施例的動(dòng)物模型中，大鼠在 脊髓T9-T10區(qū)域受到挫傷性的損傷。在此種情形下，由后肢運(yùn)動(dòng)缺陷的改善可證實(shí)SCI的復(fù)原。7jC飛薊是取自乳薊(Silybum marianum Gaertn,亦稱為 Carduus marianus L) 的種子及果實(shí)的標(biāo)準(zhǔn)萃取物，其含有黃酮木脂素水飛薊賓(silybin，與silibinin同 義)為其主要組成份。水飛薊可由任何公知方法制備，參見(jiàn)例如以下文獻(xiàn)所公開(kāi)的技術(shù)
4Barreto等人，由水飛薊萃取營(yíng)養(yǎng)藥物-熱水萃取法，Appl. Biochem Biotechnol. 108 881-9，2003 ；Wallace等人，由水飛薊萃取營(yíng)養(yǎng)藥物第二部份有機(jī)溶劑萃取法，Appl. Biotechnol. 105-108 =891-903,2003)；以及Wallace等人，由水飛薊進(jìn)行黃酮木脂素的批 次溶劑萃取，Phyotchemical Analysis. 16 :7_16，2005。或者，水飛薊可由供貨商處購(gòu)得，諸 如，Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。水飛薊賓(silybin，silibinin)或2，3_ 二氫-3_(4_ 羥基-3-甲氧基苯 基)-2-(羥甲基)-6- (3，5，7-三羥基-4-氧代苯并吡喃-2-基)苯并二惡烷，具有兩種非 鏡像異構(gòu)形式。該兩種異構(gòu)物皆可由天然來(lái)源分離或是可由合成方法制備。同樣地，水飛 薊賓亦可由Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)及其它供貨商處購(gòu)得。特定而言，為達(dá)成較佳效應(yīng)，可將水飛薊或水飛薊賓直接投與至損傷的神經(jīng)區(qū)域。 在一具體實(shí)例中，水飛薊或水飛薊賓由鞘內(nèi)投與，亦即，注射進(jìn)入浸泡著脊髓及腦的腦脊髓 液中。為協(xié)助傳輸，可將水飛薊或水飛薊賓與適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥可接受性載體共同調(diào)配為醫(yī)藥 組合物。在本文中，名辭“醫(yī)藥可接受性載體”是指與該組合物的活性成分相容，且較佳為 可安定該活性成分，同時(shí)不會(huì)對(duì)該待治療個(gè)體有害的載體。例示性的載體包括，但不限于， 鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。待投與至SCI區(qū)域的水飛薊或水飛薊賓的量可因諸多因素而有所不同，諸如，該 個(gè)體的狀況，以及該SCI的類型及嚴(yán)重性。在施用至罹患SCI的病患時(shí)，水飛薊或水飛薊賓 的量應(yīng)可達(dá)成所欲效應(yīng)，亦即，修復(fù)損傷區(qū)域及/或至少部分增進(jìn)該損傷脊髓的功能恢復(fù)。 適當(dāng)?shù)牧靠捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員在不須過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情形下基于本公開(kāi)內(nèi)容及常規(guī)知識(shí)與技 術(shù)判定。本發(fā)明現(xiàn)將由下列的實(shí)例而進(jìn)一步說(shuō)明。此等實(shí)例是為說(shuō)明的目的而提供，且不 以任何方式被視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例化學(xué)品水飛薊及水飛薊賓購(gòu)自Sigma-Aldrich(St. Louis, M0，產(chǎn)品編號(hào)分別為S0292及 S0417)。將水飛薊或水飛薊賓溶于二甲亞砜(DMSO)中，并以培養(yǎng)基新鮮稀釋，以進(jìn)行所有 試管內(nèi)的培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)。液相層析梯度溶劑及試劑取自E. Merck (Darmstadt, Germany)。除非另有明示，其它試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich?；旌仙窠?jīng)細(xì)胞/膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物如Hung 等人(Mol. Brain Res. 75 (2000) :330_336)及 Tsai 等人(Ann. N. Y. Acad. Sci. 1042(2005) =338-348)所述的方法，由懷孕第15天的Sprague-Dawley大鼠胚胎的皮 質(zhì)或脊柱區(qū)域，制備混合神經(jīng)細(xì)胞_膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。簡(jiǎn)言之，以木瓜蛋白酶/蛋白酶/脫 氧核糖核酸酶I的混合物(0. 1%0. 1%0. 03% )分離細(xì)胞，再將其以1-2χ105個(gè)細(xì)胞/cm2 的密度涂盤至經(jīng)聚離胺酸涂覆的培養(yǎng)盤上。將細(xì)胞維持在添加10%胎牛血清(FBS)的杜氏 改良伊氏培養(yǎng)基(Dulbecco，s modified Eagle，s medium) (DMEM)中?；旌夏z質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物如Tsai 及 Lee (Free Radical Biology&Medicine 24(1998) :705_713)所述的方法，由新生Sprague-Dawley大鼠的皮質(zhì)或脊髓，制備混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。簡(jiǎn)言之，使經(jīng) 研磨的皮質(zhì)或脊髓通過(guò)尼龍布(80及10 μ m)，涂盤在75cm2培養(yǎng)瓶中，并將其維持在含有 5. 5mM葡萄糖及添加10%胎牛血清(FCS)的DMEM中。使細(xì)胞在5% C02、95%空氣的水飽 和大氣中于37°C進(jìn)行培育。為使培養(yǎng)物不含污染細(xì)胞，在第10天，以ISOrpm隔夜震蕩除去 懸浮細(xì)胞以純化培養(yǎng)物。將燒瓶中的培養(yǎng)物再次涂盤于多孔培養(yǎng)盤上。培養(yǎng)物顯示針對(duì)膠 質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)有90%以上的陽(yáng)性染色。小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物由大鼠混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物純化出小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(Tzeng and Huang, J. .Cell Biochem. 90(2) (2003) :227_33)。簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng)10至14天后，借著震蕩燒瓶而 分離漂浮細(xì)胞及輕微黏附的細(xì)胞。將所得的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至多孔培養(yǎng)盤(Corning，USA) 中，并使其在37°C下黏附。在30分鐘后除去未黏附的細(xì)胞，分離出強(qiáng)力黏連形式的微膠質(zhì) 細(xì)胞。藉由離子鈣結(jié)合性適應(yīng)分子-1(IBA1，Wako Chemicals, Japan)或ED-1 (Serotec，UK) 的免疫染色，測(cè)定出微膠質(zhì)細(xì)胞的純度為大于96%。動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠取自國(guó)立陽(yáng)明大學(xué)(NYU)或國(guó)家科學(xué)委員會(huì)的動(dòng)物中 心(臺(tái)灣)。使用介于240-280g的間的成年雌性SD大鼠作為誘發(fā)性挫傷性SCI模型。動(dòng) 物的處理及實(shí)驗(yàn)流程皆經(jīng)臺(tái)北榮民總醫(yī)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)仔細(xì)審核通過(guò)。脊髓挫傷使用NYU落重裝置(weight-drop device)誘發(fā)挫傷性SCI。麻醉成年雌性SD大 鼠。在第九胸(T)椎位置進(jìn)行背側(cè)椎板切除術(shù)。由50mm高度落下IOg短柱而損傷T9-T10 脊髓的背側(cè)表面。硬膜保持機(jī)械完整，而落重?fù)p傷造成了蛋形壞死區(qū)域的特征，在首尾方向 延伸至數(shù)個(gè)脊髓節(jié)段(Grossman et al.，Exp Neurol. 168(2) (2001) 283-9 ；Widenfalk et al.，JNeurosci. 21 (10) (2001) :3457_75)。實(shí)施例1 水飛薊不會(huì)影響脊髓神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞類型在種下細(xì)胞后第二天，使混合神經(jīng)細(xì)胞/膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物與水飛薊(40 μ Μ)共置 培育3天。接著處理細(xì)胞以進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的免疫組織化 學(xué)分析。將原代神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物涂盤至經(jīng)聚離胺酸涂覆的培養(yǎng)盤上，并以 4%多聚甲醛溶液固定20分鐘。以0.2% Triton X-100透化細(xì)胞。接著以初級(jí)抗體染 色細(xì)胞，包括抗-βΙΙΙ 微管蛋白(Covance MMS-435P)、抗-GFAP (Chemicon AB 5804)、 及抗-EDl (Serotec MCA 341)抗體，再以其個(gè)別的熒光標(biāo)記性次級(jí)抗體(Jackson ImmunoResearch Inc.)染色。β III微管蛋白是一種神經(jīng)元專一性標(biāo)記，GFAP是星形膠質(zhì) 細(xì)胞標(biāo)記、而EDl是小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記。以配備熒光鏡片的熒光顯微鏡取得脊髓神經(jīng)元或非 神經(jīng)元細(xì)胞的影像。以CXD相機(jī)拍攝神經(jīng)元或免疫反應(yīng)性細(xì)胞的影像。根據(jù)該等結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，水飛薊并不會(huì)影響脊髓培養(yǎng)物中的神經(jīng)元存活以 及非神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)施例2 水飛薊可保護(hù)脊髓神經(jīng)細(xì)胞_膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)抗LPS及紅藻胺酸誘 發(fā)的毒性在種下細(xì)胞后第二天，在有或無(wú)內(nèi)毒素脂多醣(LPS，1.2yg/ml)或興奮性神經(jīng)毒素紅藻胺酸(ΚΑ，150μΜ)的存在下，以水飛薊(40 μ Μ)處理混合神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 物2天。收集培養(yǎng)基以進(jìn)行釋出的硝酸鹽/亞硝酸鹽的分析，并收集細(xì)胞以進(jìn)行免疫組織 化學(xué)及西方點(diǎn)漬分析。在多聚甲醛(paraformaldehyde)固定及Triton X-100透化后，使細(xì)胞與初級(jí)抗 體抗-IL-Ιβ (Chemicon)隔夜共置培育(4 °C )，并接著在室溫下與驢抗山羊488 (Alexa)或 驢抗小鼠cy3 (Jackson Lab)共置培育90分鐘。根據(jù)該等結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，LPS或KA 的處理在該等脊髓培養(yǎng)物中誘發(fā)IL-I β表現(xiàn)。亦處理細(xì)胞，以進(jìn)行可誘發(fā)性一氧化氮合成酶(iNOS)及環(huán)氧合酶-2(C0X_2)表現(xiàn) 的西方點(diǎn)漬分析。簡(jiǎn)言之，將等量的細(xì)胞裂解物蛋白加樣至SDS-PAGE凝膠上并進(jìn)行分離。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行電泳。在電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Millipore，USA)，并在4°C 下與對(duì)抗iN0S(BDtransduction，USA)或C0X-2 (Cayman)的抗體隔夜共置培育。將點(diǎn)漬膜 與驢抗兔IgG HRP (辣根過(guò)氧化物酶)-綴合性次級(jí)抗體(Santa Cruz)或山羊抗小鼠IgG HRP-綴合性次級(jí)抗體(Santa Cruz)共置培育1小時(shí)，再使用超訊息化學(xué)冷光基質(zhì)(Pierce， USA)進(jìn)行HRP偵測(cè)。NO的產(chǎn)生是以Griess反應(yīng)試劑進(jìn)行比色反應(yīng)偵測(cè)培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽積累而予 以分析。簡(jiǎn)言之，在LPS處理2天后，收集培養(yǎng)物上清液(150 μ 1)，并與50 μ 1的含有 磺胺/0. 萘基乙二胺二鹽酸鹽/2%磷酸的Griess反應(yīng)試劑混合，再在室溫下共置培育 10分鐘。在540nm測(cè)量吸收值。使用亞硝酸鈉(NaNO2)作為標(biāo)準(zhǔn)物以計(jì)算二氧化氮(NO2)。如圖1㈧至(C)所示，LPS誘發(fā)C0X-2及iNOS表現(xiàn)、iNOS-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目、以及一 氧化氮(NO)釋出的增加，以硝酸鹽/亞硝酸鹽含量表示。水飛薊可有效降低LPS或KA的 刺激。水飛薊賓可顯著降低LPS誘發(fā)的NO釋出。實(shí)施例3 水飛薊及水飛薊賓可抑制混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞增殖5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)是一種在有絲分裂S期納入遺傳物質(zhì)中的胸苷類似物， 以其處理細(xì)胞，進(jìn)行混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物增殖活性的研究。將水飛薊或水飛薊賓(20-80 μ Μ)加入未匯合的膠狀細(xì)胞中2天。在細(xì)胞固定前 2小時(shí)，將5-溴-2-脫氧尿苷(Βιχ υ,ΙΟμΜ，其可由增殖細(xì)胞攝入)加入培養(yǎng)的細(xì)胞中。以 4%多聚甲醛溶液固定(30分鐘，室溫)后，以2M HCl (10分鐘，37°C)處理細(xì)胞以使其DNA變 性。接著以PBS重復(fù)清洗細(xì)胞，直到pH值到達(dá)6.5或以上。接著以小鼠抗-Brdua 100， Chemicon，Temecula，CA)及兔抗-GFAP(1 300，Chemicon)抗體進(jìn)一步進(jìn)行重復(fù)處理 (40C，隔夜)，再與FITC-及羅丹明(rhodamine)-綴合性次級(jí)抗體(室溫，90分鐘)共置培 育。在各孔隨機(jī)選取7個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)含有BrdU的細(xì)胞。計(jì)算出BrdU/總細(xì)胞的比例。如圖2㈧所示，水飛薊及水飛薊賓兩者皆可有效降低膠質(zhì)細(xì)胞的增殖(由 BrdU (+) /GFAP (+)的比例表示)。實(shí)施例4 水飛薊及水飛薊賓可減少脊髓星狀膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、及神經(jīng)細(xì) 胞_膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物以及皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞_膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的毒素誘發(fā)性自由基形成抗氧化活性是神經(jīng)保護(hù)劑的一種重要作用機(jī)制，因?yàn)樽杂苫膫υ诟鞣N不同物 質(zhì)的神經(jīng)毒性效應(yīng)以及諸如發(fā)炎、缺血及再灌注、動(dòng)脈粥狀硬化、及老化過(guò)程的致病機(jī)制中 皆扮演重要角色。自由基的含量(氧化壓力)可借由H2O2或第三丁基過(guò)氧化氫(t-B00H) (參見(jiàn)圖3(C)、圖4(A-B)、及圖5(A-C)中的“對(duì)照組”)的挑戰(zhàn)在細(xì)胞中誘發(fā)。
在本實(shí)施例中，以各種不同的自由基產(chǎn)生物處理混合膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、或是 混合神經(jīng)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物而誘發(fā)氧化壓力，并以經(jīng)改良而可使用熒光微試驗(yàn)盤視 讀器的DCF分析檢驗(yàn)水飛薊及水飛薊賓的抗氧化活性。細(xì)胞內(nèi)的活性氧分子(reactive oxygen species) (ROS)的形成是以非熒旋旋旋光性的2‘，7' -二氯二氫熒光素二乙酸酯 (DCF-DA)偵測(cè)，其為用于偵測(cè)胞內(nèi)氧化物生成的靈敏且廣泛使用的探針。DCF-DA可自由 進(jìn)入細(xì)胞，并由胞內(nèi)酯酶修飾成為親水性(并因此“受困”)、即非熒旋旋旋光性的報(bào)導(dǎo)分子 DCF。DCF的氧化會(huì)產(chǎn)生高度熒旋旋旋光性的DCF，其可由流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或其它熒光偵測(cè)方 法偵測(cè)。為進(jìn)行DCF分析，首先在培養(yǎng)物中加入無(wú)血清培養(yǎng)基中(DMEM+N2)的40 μ M DCF-DA(Molecular Probe D-399 ；Invitrogen, Carlsbad, CA)處理 1 小時(shí)。接著以含有毒 素(包括H2O2 (ImM用于神經(jīng)元；3mM用于非神經(jīng)元細(xì)胞)以及t_B00H(0· 75mM))的生長(zhǎng)培 養(yǎng)基置換該培養(yǎng)基處理2小時(shí)。在毒素處理起始后10分鐘內(nèi)，加入不同劑量(介于自20 至160 μ M)的水飛薊或水飛薊賓。以熒光試驗(yàn)盤視讀器，在485nm/538nm的激發(fā)/發(fā)射波 長(zhǎng)，測(cè)量所得的熒光DCF含量。如圖2(B)、圖3㈧及(B)、及圖4㈧至(C)所示，水飛薊及水飛薊賓兩者皆為強(qiáng) 力的抗氧化劑，因其在所有試驗(yàn)的培養(yǎng)物中，包括脊髓混合膠狀細(xì)胞培養(yǎng)物(圖2(B))、脊 髓混合神經(jīng)細(xì)胞-膠狀細(xì)胞培養(yǎng)物(圖3(A)；圖4(A))、皮質(zhì)混合神經(jīng)細(xì)胞-膠狀細(xì)胞培 養(yǎng)物(圖3(B)；圖4(B))、以及脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(圖4(C))，皆可顯著降低H202-或 t-ΒΟΟΗ-誘發(fā)性自由基形成。重要的是，介于自20 μ M至160 μ M)的水飛薊可在脊髓或皮質(zhì) 混合神經(jīng)細(xì)胞_膠狀細(xì)胞培養(yǎng)物中有效減少H2O2-誘發(fā)性自由基(圖3㈧及(B))。使用ΜΤΤ(3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑)的還原程度，測(cè)量細(xì) 胞存活或是測(cè)定活細(xì)胞的代謝活性。MTT可由存活細(xì)胞的粒線體酵素還原成為藍(lán)色的甲 暨(formazan)產(chǎn)物，其與代謝功能的完整性成正比(Edmondson et al.，J. Tiss. Cult. Meth. 11(1998) :15_17)。為進(jìn)行MTT分析，如上所述以毒素以及水飛薊或水飛薊賓處理該 等培養(yǎng)物2小時(shí)。在處理后，由孔中除去培養(yǎng)基，并以添加葡萄糖(5mM)的PBS中的0. 5mg/ mL MTT置換。在37°C下共置培育2hrs后，除去此溶液，并以酸化的異丙醇溶解該等藍(lán)色的 甲暨晶體。以分光光度計(jì)在570nm測(cè)量該所得溶液的光學(xué)密度。如圖5所示，水飛薊及水飛薊賓可強(qiáng)效增進(jìn)MTT的還原。MTT還原分析取決于代謝 活性細(xì)胞將MTT四唑餘丨鹽還原成為甲暨的能力。還原的吡啶核苷酸輔因子NADH與大部分 的MTT還原作用有關(guān)。此種結(jié)果指出水飛薊及水飛薊賓的強(qiáng)抗氧化特性。實(shí)施例5 水飛薊的鞘內(nèi)投與對(duì)于挫傷性SCI的效應(yīng)由于高濃度(純)DMSO的直接注入可能會(huì)造成細(xì)胞毒性，因此使用替代性 的較安全試劑聚乙二醇(PEG;麗2000Da)溶解水飛薊以進(jìn)行鞘內(nèi)注射(intrathecal injection)。PEG是一種親水性的聚合物，已被證實(shí)為安全且對(duì)急性脊髓損傷具有神 經(jīng)保護(hù)作用(Shi and Borgens, J. Neurophysiol. 81 (1999) 2406-2414 ；Shi et al.， J. Neurotrauma 16(1999) 727-738 ；Shi and Borgens, J. Neurocytol.29 (2000) 633-644)。以鹽水制備PEG溶液(50 % )。接著將水飛薊以5至20mg/ml的濃度溶于PEG 溶液中。在誘發(fā)挫傷性損傷的后30分鐘內(nèi)，將6μ 1含或不含水飛薊的PEG由鞘內(nèi)投與至 損傷脊髓的中心?？p合皮膚，并如上所述在脊髓損傷后的第二天及每周監(jiān)測(cè)后肢功能(BBB量表)。如圖6所示，水飛薊的鞘內(nèi)注射(20yg/yl)可顯著有助于SCI大鼠的功能恢復(fù)， 而PEG(水飛薊的載劑)則不具神經(jīng)保護(hù)性。在損傷5周后，麻醉大鼠，并以4%多聚甲醛進(jìn) 行血管灌注。接著矢狀切片脊髓(ΙΟμπι厚)，并加以處理以使用抗神經(jīng)絲蛋白(針對(duì)神經(jīng) 元)或抗-EDl (針對(duì)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。根據(jù)該等結(jié)果(數(shù)據(jù)未 示)，在經(jīng)水飛薊處理的脊髓中，其脊髓軸突(神經(jīng)絲蛋白陽(yáng)性)獲得較佳的保存，并可見(jiàn)較 低程度的小膠質(zhì)細(xì)胞活化(ED-I)。創(chuàng)傷性的脊髓損傷具有破壞性，并會(huì)起動(dòng)一系列的細(xì)胞及分子事件，包括初級(jí)及 次級(jí)的損傷級(jí)聯(lián)。脊髓的損傷會(huì)引發(fā)發(fā)炎反應(yīng)，該發(fā)炎反應(yīng)一開(kāi)始便會(huì)造成進(jìn)一步的組織 損傷。降低對(duì)于脊髓損傷的早期發(fā)炎反應(yīng)，因此可能限制組織損傷的范圍，并因此限制后續(xù) 的失能。在損傷3天后犧牲有或無(wú)鞘內(nèi)投與水飛薊的SCI大鼠?？焖偃〕黾顾璧膿p傷中心， 并以冰冷的萃取緩沖液(7Μ尿素、2Μ硫脲、4% CHAPS,40mM Tris緩沖液(pH7. 5)及蛋白酶 抑制劑(Roche 11836145001))予以均質(zhì)化。使用 Bradford 法(Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories)測(cè)量蛋白濃度。將等量的蛋白加樣至8% SDS-PAGE凝膠上并進(jìn)行 分離。在轉(zhuǎn)移后，以抗C0X-2、抗ED-1、及抗肌動(dòng)蛋白抗體探測(cè)所得的PVDF膜。與圖6的結(jié) 果相符，鞘內(nèi)投與水飛薊可在損傷3天后的損傷脊髓中，降低C0X-2( —種促發(fā)炎酶)的表 現(xiàn)，并抑制ED-I (+)小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，如圖7所示。鞘內(nèi)水飛薊的分布可能與全身性sc投與者不同。對(duì)SCI大鼠鞘內(nèi)投與水飛薊 (120μ g/6y 1/大鼠)。在損傷1、2、7、及14天后，取出脊髓中心，并以5倍體積的50mM Tris-HCKpH 7.4)予以均質(zhì)化。以等體積的溶劑(丁醇甲醇，95 5 ；ν/ν)進(jìn)一步萃取 組織均質(zhì)物。離心后，收集所得的有機(jī)層，濃縮，再直接注射至具有UV偵測(cè)的HPLC裝置中。 圖8顯示脊髓中所達(dá)成的水飛薊素接觸時(shí)程(藥物動(dòng)力學(xué))。水飛薊素的分布僅限于損傷 的脊髓中心。在注射2周后，仍保留約8 μ g/g組織的水飛薊素。因此，水飛薊素藥物動(dòng)力 學(xué)的差異可能可說(shuō)明鞘內(nèi)水飛薊素注射的有效結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可明了，可對(duì)上述的具體實(shí)例進(jìn)行變化而不偏離其廣泛的發(fā)明 概念。因此，咸可明了，本發(fā)明并不限于所公開(kāi)的特定具體實(shí)例，其是欲涵括由附呈的權(quán)利 要求書(shū)所定義的本發(fā)明精神及范圍中的修飾。
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權(quán)利要求
一種水飛薊(silymarin)或水飛薊賓(silybin)在制備用于治療神經(jīng)損傷的藥劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是投與至損傷的神經(jīng)區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述神經(jīng)損傷是脊髓損傷(SCI)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是經(jīng)鞘內(nèi)投與。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是經(jīng)鞘內(nèi)投與。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是投與至損傷的神經(jīng)區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述SCI是挫傷性SCI。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是經(jīng)鞘內(nèi)投與。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是投與至損傷的神經(jīng)區(qū)域。
10.一種水飛薊(silymarin)或水飛薊賓(silybin)在制備用于增進(jìn)由脊髓損傷 (SCI)復(fù)原的藥劑中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是經(jīng)鞘內(nèi)投與。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是投與至損傷的神經(jīng)區(qū)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征是所述SCI是挫傷性SCI。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是投與至脊髓的損傷區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征是所述藥劑是投與至脊髓的損傷區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明提供一種水飛薊(silymarin)或水飛薊賓(silybin)在制備用于治療神經(jīng)損傷的藥劑中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/357GK101961365SQ20101023845
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者蔡美娟, 鄭宏志 申請(qǐng)人:鄭宏志;蔡美娟