專利名稱：去細胞生物血管支架制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及去細胞生物血管支架的制備方法。
背景技術：
自體器官移植是治療器官缺損最有效的醫(yī)療手段，但自體器官來源不足一直是器 官移植治療過程中難以解決的實際問題。將種子細胞種植在可生物降解的支架材料上，體 外構建具有一定的生命活性和相應的生理醫(yī)學機能的組織工程化器官，用作自體器官的替 代物，來移植修復病變或缺失的組織器官，可以從根本上解決器官移植治療時所面臨的自 體器官來源不足的矛盾。支架是構建組織工程化器官的三要素(細胞、材料和生物因子)之一。支架材料 的組份、結構、界面、孔徑、強度和彈性，決定預構建組織工程化器官的生物力學特征，同時 也對種植在其上的細胞的粘附、遷移、增值和分化起著重要的調節(jié)作用。生物材料因具有良 好的組織相容性和植入安全性，以及與預構建組織器官相匹配的構型，而被廣泛地用做支 架材料，并用于組織工程化器官的構建上。膠原蛋白、彈力纖維、透明質酸和蛋白多糖等既是細胞外間質成分，也是生物支架 材料的主要組成部分，決定著生物支架材料的生物力學特征和種植在其上的種子細胞的粘 附增值和分化，但生物支架材料中原先存在的細胞成分，移植后可能誘發(fā)宿主，產生免疫排 斥反應，需從中予以除去。去細胞支架材料因保留細胞外間質的主要成分和與天然組織相類似的構型，已成 為構建組織工程化器官的首選材料之一。利用去細胞支架材料構建組織工程化血管，用作 自體血管的替代物，可以從根本上解決血管移植治療時所面臨著的自體血管來源不足的矛 盾。去細胞生物支架的方法各異，效果也不盡相同。發(fā)明一種簡便易行、去細胞效果可靠， 且能保留細胞外間質主要成份的去細胞血管生物支架是目前構建組織工程化血管首先解 決的技術瓶頸。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于構建組織工程化血管的去細胞生物血管支架的 制備方法。本發(fā)明包括去污劑單獨去細胞生物血管支架制備方法和去污劑_蛋白酶聯(lián)合去 細胞生物血管支架制備方法，其中1.去污劑單獨去細胞生物血管支架制備方法包括下列步驟①無菌條件下，取新鮮或凍存的血管管狀組織(臍血管、頸血管、腹主動脈或大隱 靜脈)。②用含有抗生素的生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液洗去管腔內外的血液。③結扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為的 十二烷基硫酸鈉和濃度為0. 02%的疊氮化鈉。
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④結扎血管得另一端，將上述血管管狀組織置于含有十二烷基硫酸鈉 +0. 02%疊氮化鈉的燒杯內。⑤在燒杯內放入攪拌棒，將燒杯置于磁力攪拌器上，啟動磁力攪拌器，調整轉速為 30轉/分鐘，室溫下連續(xù)轉動12小時。⑥取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘 留的十二烷基硫酸鈉和疊氮化鈉溶液。⑦結扎血管的一端，用注射器向血管支架注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為 0.3%的京尼平(genipin)溶液，結扎支架另一端，將血管支架置于上述京尼平溶液內，4°C 下固定4小時。⑧取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘 留的京尼平。⑨經組織學檢測合格后，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，儲存于-20°C的冰箱內備用。2.去污劑_蛋白酶聯(lián)合去細胞生物血管支架制備方法包括下列步驟①無菌條件下，取新鮮或凍存的血管管狀組織(臍血管、頸血管、腹主動脈或大隱 靜脈)。②用含有抗生素的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液洗去管腔內外的血液。③結扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0. 25%的 胰蛋白酶和0. 02%的乙二胺四乙酸或其鈉鹽的消化液，結扎血管的另一端，無菌下，將其置 于室溫下消化30分鐘。④拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖走血管內殘留的消化液。⑤將血管的兩端與蠕動泵連接，蠕動泵的連接管內事先注入濃度為的十二烷 基硫酸鈉和濃度為0. 02%的疊氮化鈉。⑥啟動蠕動泵，調整轉速為25-30轉/分鐘，持續(xù)灌流3小時。⑦取出血管支架，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘留的十二烷 基硫酸鈉和疊氮化鈉溶液。⑧結扎血管的一端，用注射器向支架注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0. 3%的 京尼平(genipin)溶液，結扎支架另一端，將支架置于上述京尼平溶液內，4°C下固定4小 時。⑨取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘 留的京尼平。⑩經組織學檢測合格后，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，儲存在-20 V的冰箱內備用。本發(fā)明用去污劑，或去污劑與蛋白酶聯(lián)合，從臍血管、頸血管、腹主動脈、大隱靜脈 等血管組織中除去細胞成份，從而獲得保留了細胞外主要間質成分(膠原蛋白和彈力纖 維)的去細胞生物血管支架。本發(fā)明為構建具有生理醫(yī)學機能的組織工程化血管或其它管狀器官充足的生物 血管支架，提供了一種新的方法和來源。HE染色可見未經去細胞化處理的臍血管內含有大 量的細胞殘留(見圖1)，而分別經過上述去細胞化處理的臍血管內未見細胞和核殘留。同 時經京尼平固定后的去細胞化的臍血管始終呈現管狀結構，且組織內保留有大量的細胞外 間質成分膠原蛋白和彈力纖維(見圖2和圖3)。這些膠原蛋白和彈力纖維對維持血管的彈性和強度，以及種植在其上的細胞的粘附、遷移、增值、分化都將發(fā)揮重要作用。


圖1為經HE染色的臍血管照片圖2為經Masson染色的去細胞生物血管支架照片圖3為經地衣紅染色的去細胞生物血管支架照片
具體實施例方式1.去污劑單獨去細胞生物血管支架制備方法包括下列步驟①無菌條件下，取新鮮或凍存的臍血管、頸血管、腹主動脈或大隱靜脈。②用含有青霉素、鏈霉素或兩性霉素的生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液洗去管腔內外 的血液。③結扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為的 十二烷基硫酸鈉和濃度為0. 02%的疊氮化鈉。④結扎血管得另一端，將上述血管管狀組織置于含有十二烷基硫酸鈉 +0. 02%疊氮化鈉的燒杯內。⑤在燒杯內放入攪拌棒，將燒杯置于磁力攪拌器上，啟動磁力攪拌器，調整轉速為 30轉/分鐘，室溫下連續(xù)轉動12小時。⑥取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘 留的十二烷基硫酸鈉和疊氮化鈉溶液。⑦結扎血管的一端，用注射器向血管支架注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為 0. 3%的京尼平溶液，結扎支架另一端，將血管支架置于上述京尼平溶液內，4°C下固定4小 時。⑧取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘 留的京尼平。⑨經組織學檢測合格后，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，儲存于-20°C的冰箱內備用。2.去污劑_蛋白酶聯(lián)合去細胞生物血管支架制備方法包括下列步驟①無菌條件下，取新鮮或凍存的臍血管、頸血管、腹主動脈或大隱靜脈。②用含有青霉素、鏈霉素或兩性霉素的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液洗去管腔內外的 血液。③結扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0. 25%的 胰蛋白酶和0. 02%的乙二胺四乙酸或其鈉鹽的消化液，結扎血管的另一端，無菌下，將其置 于室溫下消化30分鐘。④拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖走血管內殘留的消化液。⑤將血管的兩端與蠕動泵連接，蠕動泵的連接管內事先注入濃度為的十二烷 基硫酸鈉和濃度為0. 02%的疊氮化鈉。⑥啟動蠕動泵，調整轉速為25-30轉/分鐘，持續(xù)灌流3小時。⑦取出血管支架，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘留的十二烷 基硫酸鈉和疊氮化鈉溶液。
⑧結扎血管的一端，用注射器向支架注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0. 3%的 京尼平溶液，結扎支架另一端，將支架置于上述京尼平溶液內，4°C下固定4小時。⑨取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘 留的京尼平。⑩經組織學檢測合格后，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，儲存在-20 V的冰箱內備用。由圖1可以看出經HE染色的臍血管內有大量的細胞核殘留。由圖2可以看出經Masson染色的去細胞生物血管支架內留有大量的膠原蛋白。由圖3可以看出經地衣紅染色的去細胞生物血管支架內留有大量的彈力纖維。
權利要求
去細胞生物血管支架制備方法，其特征在于包括去污劑單獨去細胞生物血管支架制備方法和去污劑-蛋白酶聯(lián)合去細胞生物血管支架制備方法，其中(1)去污劑單獨去細胞生物血管支架制備方法包括下列步驟①無菌條件下，取新鮮或凍存的血管管狀組織。②用含有抗生素的生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液洗去管腔內外的血液。③結扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為1％的十二烷基硫酸鈉和濃度為0.02％的疊氮化鈉。④結扎血管得另一端，將上述血管管狀組織置于含有1％十二烷基硫酸鈉+0.02％疊氮化鈉的燒杯內。⑤在燒杯內放入攪拌棒，將燒杯置于磁力攪拌器上，啟動磁力攪拌器，調整轉速為30轉/分鐘，室溫下連續(xù)轉動12小時。⑥取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘留的十二烷基硫酸鈉和疊氮化鈉溶液。⑦結扎血管的一端，用注射器向血管支架注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0.3％的京尼平溶液，結扎支架另一端，將血管支架置于上述京尼平溶液內，4℃下固定4小時。⑧取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘留的京尼平。⑨經組織學檢測合格后，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，儲存于-20℃的冰箱內備用。(2)去污劑-蛋白酶聯(lián)合去細胞生物血管支架制備方法包括下列步驟①無菌條件下，取新鮮或凍存的血管管狀組織。②用含有抗生素的生理鹽水或磷酸鹽緩沖液洗去管腔內外的血液。③結扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙二胺四乙酸或其鈉鹽的消化液，結扎血管的另一端，無菌下，將其置于室溫下消化30分鐘。④拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖走血管內殘留的消化液。⑤將血管的兩端與蠕動泵連接，蠕動泵的連接管內事先注入濃度為1％的十二烷基硫酸鈉和濃度為0.02％的疊氮化鈉。⑥啟動蠕動泵，調整轉速為25-30轉/分鐘，持續(xù)灌流3小時。⑦取出血管支架，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘留的十二烷基硫酸鈉和疊氮化鈉溶液。⑧結扎血管的一端，用注射器向支架注入以磷酸鹽緩沖液配制的濃度為0.3％的京尼平溶液，結扎支架另一端，將支架置于上述京尼平溶液內，4℃下固定4小時。⑨取出血管支架，拆除結扎線，用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水沖洗整個管腔，洗去殘留的京尼平。⑩經組織學檢測合格后，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，儲存在-20℃的冰箱內備用。
2.按權利要求1所述的去細胞生物血管支架制備方法，其特征在于所述的血管管狀組 織為臍血管、頸血管、腹主動脈或大隱靜脈。
全文摘要
去細胞生物血管支架制備方法屬生物技術領域，本發(fā)明包括去污劑單獨去細胞生物血管支架制備方法和去污劑-蛋白酶聯(lián)合去細胞生物血管支架制備方法，經去細胞化處理的血管管狀組織內未見細胞殘留，同時經京尼平固定后的去細胞化的血管管狀組織始終呈現管狀結構，且組織內保留有大量的細胞外間質成分膠原蛋白和彈力纖維，這些膠原蛋白和彈力纖維對維持血管的彈性和強度，以及種植在其上的細胞的粘附、遷移、增值、分化都將發(fā)揮重要作用，本發(fā)明為構建具有生理醫(yī)學機能的組織工程化血管或其它管狀器官充足的生物血管支架，提供了一種新的方法和來源。
文檔編號A61L31/00GK101879333SQ201010201440
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月17日 優(yōu)先權日2010年6月17日
發(fā)明者劉晉宇, 李玉林 申請人:吉林大學