專利名稱：取代水飛薊賓酯用于制備治療病毒性乙肝藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽用于制備降低乙肝病毒表面抗原HBsAg藥物、抑制HBV DNA復(fù)制或治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物的用途，該黃酮木脂素具有甚為顯著的抑制HBsAg活性，在100微克/毫升濃度下其清除HBsAg強(qiáng)度超過陽(yáng)性對(duì)照藥物(10000單位/毫升的α-干擾素)2倍半；同時(shí)，在100微克/毫升濃度時(shí)該化合物對(duì)HBV DNA顯示出大于84％的抑制率。以上藥效學(xué)結(jié)果表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽可預(yù)期用于制備降低乙肝病毒表面抗原、抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物的用途。

背景技術(shù)：
乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的傳染病，HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一員，其形狀為直徑42納米的球形顆粒。HBV是奇特的病毒，在其它動(dòng)物中較少有傳染性，唯有在人體或者靈長(zhǎng)類動(dòng)物黑猩猩體內(nèi)才能得以復(fù)制。該病毒通過乙肝病毒攜帶者和乙肝病人的血液、唾液、精液、陰道分泌物進(jìn)行傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。本病在我國(guó)廣泛流行，因其分為垂直傳播、水平傳播、家庭內(nèi)傳播、醫(yī)源性傳播和性傳播等多種方式，對(duì)人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達(dá)到35％以上。據(jù)有關(guān)資料，肝炎檢測(cè)陽(yáng)性的患者已經(jīng)達(dá)到1.89億，而應(yīng)就診未就診人數(shù)(攜帶者)將近4億，是當(dāng)前危害人民健康最嚴(yán)重的傳染病之一。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少數(shù)病人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌。
乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外殼蛋白，HBsAg陽(yáng)性是判斷HBV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，HBsAg陽(yáng)性，但無(wú)肝炎癥狀出現(xiàn)者成為HBV病毒攜帶者。HBsAg滴度越大，其合并乙肝核心抗原HBeAg、HBV DNA陽(yáng)性和DNA多聚酶活性升高的幾率就越大，因而傳染性越強(qiáng)。抑制HBsAg的分泌和復(fù)制是研發(fā)抗乙肝病毒藥物中的一個(gè)重要靶標(biāo)和檢測(cè)標(biāo)的北京地壇醫(yī)院吳淑云等的報(bào)告顯示乙肝HBsAg清除和乙肝閉環(huán)共價(jià)DNA(cccDNA)存在一定相關(guān)性，清除HBsAg是cccDNA水平顯著降低的標(biāo)志。2002年，在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表研究結(jié)果之研究者認(rèn)為對(duì)于CHB患者，如在肝硬化前獲HBsAg清除，則其肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生率將降低60倍。美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)AASLD、亞太肝臟研究協(xié)會(huì)APASL和歐洲肝臟研究協(xié)會(huì)EASL的指南中均將HBsAg血清清除作為治療終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)之一。
據(jù)2008年歐洲肝臟研究學(xué)會(huì)年會(huì)報(bào)道聚乙二醇干擾素α-2a治療CHB患者48周后停藥，隨訪1、2、3、4年，其HBsAg清除率分別為3％、6％、8％和11％，而單獨(dú)用拉米夫定者對(duì)HBsAg清除率于停藥后1、2、3、4年僅為0％、0％、0％和3％。因而該干擾素被認(rèn)為是治療HBeAg陰性CHB患者最佳治療選擇，可見發(fā)現(xiàn)能夠高效清除HBsAg的藥物具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
目前，對(duì)乙肝患者的用藥主要分為保肝降酶、抗病毒、抗肝纖維化和調(diào)節(jié)免疫等數(shù)個(gè)大類，近些年來(lái)取得進(jìn)展的還是在于抗病毒藥物治療方面的研究?？共《臼歉痉椒ǎ８谓得钢皇禽o助治療，多治標(biāo)而鮮見治本。然而，目前對(duì)于病毒性乙肝臨床上的治療方案只能達(dá)到抑制HBV復(fù)制和繼發(fā)感染，最主要藥物仍是核苷類藥物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韋、阿德福韋(ADV)、替比夫定等，還有處于臨床試驗(yàn)期中的emtricitabine、tenofovir、clevuding等。在我國(guó)，拉米呋啶已經(jīng)成為醫(yī)保用薊，應(yīng)用于大批HBV患者。核苷類藥物部分優(yōu)點(diǎn)為生物利用度高，口服較安全。然而，它們雖然能有效地控制病情，但一則售價(jià)昂貴；二則長(zhǎng)期使用均可出現(xiàn)耐藥性，以及停藥后出現(xiàn)HBV DNA、ALT及肝組織學(xué)的不同程度的反彈；三是長(zhǎng)期使用核苷類藥物出現(xiàn)的較為明顯的眾所周知的不良作用，例如腎臟損傷、嬰兒致畸等。最為頭痛的是病毒耐藥的出現(xiàn)大大降低了治愈率，因?yàn)楹塑疹愃幬飳?duì)病毒復(fù)制是可逆的，所以對(duì)大部分患者若欲達(dá)到最大療效，療程必須在一年以上，如此其耐藥性隨之出現(xiàn)，就達(dá)不到預(yù)期之效果。此外，核苷類藥物還有難以清除cccDNA、治療一年后HBsAg難以陰轉(zhuǎn)等不足之處。
干擾素(α、β-干擾素)以及重組干擾素類等來(lái)源于人白細(xì)胞的生物工程類抗病毒藥物近期成為研究和治療CHB熱點(diǎn)藥物，其具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用。其既可通過抗病毒作用抑制病毒復(fù)制從而減輕肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞損害，延緩病情發(fā)展從而起到改善病人臨床癥狀和肝臟生理功能；又可以增強(qiáng)免疫作用，通過加強(qiáng)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的作用，尤其是可以促進(jìn)殺傷T細(xì)胞去殺傷被病毒感染細(xì)胞，因此間接起到抗病毒作用。干擾素治療CHB患者獲得的HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換比拉米呋啶更為持久，2003年《消化道》雜志上一項(xiàng)研究顯示干擾素治療組HBsAg的3年復(fù)發(fā)率顯著低于拉米呋啶組；且長(zhǎng)效干擾素可以每周使用一次，較為方便。因此，干擾素日漸成為臨床上用于治療慢性乙肝病毒的首選藥物之一，但其副作用和不良反應(yīng)報(bào)道較多，總有效率不高，價(jià)格昂貴，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)大，因而造成臨床上難以廣泛使用，且對(duì)失代償肝硬化患者不適宜應(yīng)用。
近幾年隨著肝病的研究，發(fā)展了標(biāo)準(zhǔn)化的HBV DNA的分析，大大推進(jìn)了對(duì)乙肝患者病情的了解。HBV DNA的定量分析能預(yù)測(cè)乙肝的嚴(yán)重性及其預(yù)后，因?yàn)镠BV DNA持續(xù)陽(yáng)性(即持續(xù)病毒血癥)容易使乙肝病情進(jìn)展和加重；高乙肝病毒(HBV DNA)含量容易促進(jìn)肝硬化的形成；HBV DNA持續(xù)存在是肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的高危因素，特別是病毒含量較高、病程較長(zhǎng)、年齡較大或合并其它肝病者；持續(xù)高濃度的HBV DNA存在，可導(dǎo)致失代償性肝硬化及原發(fā)性肝重癥的死亡率明顯增加。同時(shí)必須認(rèn)識(shí)到，HBV DNA水平與肝臟組織學(xué)的關(guān)系極其密切文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)抗病毒治療，肝臟纖維化的改善和消除明顯；近期國(guó)際肝病會(huì)議報(bào)導(dǎo)，強(qiáng)效和低耐藥性的抗病毒治療，隨著HBV DNA的降低和轉(zhuǎn)陰，而觀察到肝硬化可出現(xiàn)不同程度的逆轉(zhuǎn)，因此現(xiàn)在主張肝硬化也應(yīng)進(jìn)行抗病毒治療。
因此，HBV DNA指標(biāo)在抗病毒治療中的應(yīng)用也起著舉足輕重的作用HBV DNA的水平是決定慢性乙型肝炎是否需要抗病毒治療的重要指標(biāo)；根據(jù)HBV DNA的不同情況分別制定出HBeAg陽(yáng)性或HBeAg陰性的不同治療標(biāo)準(zhǔn)和要求；在抗病毒治療中，根據(jù)HBVDNA的治療反應(yīng)，判斷是否病毒學(xué)早期應(yīng)答進(jìn)而決定長(zhǎng)期用藥的策略以取得持續(xù)性的病毒學(xué)應(yīng)答，達(dá)到持續(xù)病毒抑制的目的；根據(jù)HBVDNA的病毒學(xué)的應(yīng)答情況，創(chuàng)造HBeAg血清學(xué)的轉(zhuǎn)換基礎(chǔ)和條件，以達(dá)到其良好的中間治療目標(biāo)；根據(jù)HBV DNA持續(xù)抑制情況爭(zhēng)取病毒持續(xù)陰性，以爭(zhēng)取達(dá)到抗病毒最終治療目標(biāo)；根據(jù)HBV DNA持續(xù)完全受到抑制，也顯示出了cccDNA的不同程度好轉(zhuǎn)和消失；在抗病毒治療中，以HBV DNA的變化來(lái)評(píng)估和預(yù)防抗病毒藥物所引起的病毒變異及耐藥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；一旦發(fā)生病毒變異或耐藥時(shí)，HBV DNA的變化是唯一的最先的信號(hào)和診斷依據(jù)，也是治療耐藥和改變治療策略的指導(dǎo)和依據(jù)。綜上所述，對(duì)HBV DNA的抑制程度在乙肝的進(jìn)一步診斷和治療上有著新的重大意義，對(duì)療效的觀察，對(duì)評(píng)估乙肝預(yù)后及耐藥危險(xiǎn)性均有較大的指導(dǎo)作用。
由上述因素可知抑制乙肝病毒在體內(nèi)增殖的另外一個(gè)根本環(huán)節(jié)在于抑制HBV DNA的復(fù)制。HBV DNA水平的降低或者低于檢測(cè)水平是檢驗(yàn)抗病毒藥物的另外一把金鑰匙。所以，亞太肝臟研究學(xué)會(huì)和歐洲肝臟研究學(xué)會(huì)均將HBV DNA檢測(cè)不到作為乙型肝炎病毒患者治療終點(diǎn)之一；我國(guó)新藥開發(fā)指南中也將受測(cè)化合物對(duì)于HBV DNA的抑制強(qiáng)度視為必須完成的測(cè)試項(xiàng)目之一。拉米呋啶之所以能夠成為首選核苷類藥物便是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)效的抑制HBV DNA復(fù)制之活性。因此既能抑制HBV DNA復(fù)制又能抑制HBsAg的化合物將更有希望成為治療乙肝患者的創(chuàng)新性藥物。
必須說明的是目前使用的抗病毒藥物其實(shí)只是病毒復(fù)制的抑制劑，并不能直接殺滅病毒和破壞病毒體，否則就會(huì)損傷宿主細(xì)胞。這些抗病毒藥物(多為核苷類藥物)還存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥后易反跳等缺點(diǎn)，因此開發(fā)新型抗病毒藥物是當(dāng)今藥物研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。其對(duì)于治療我國(guó)大量的乙肝患者和病毒攜帶者、控制傳染源等都有著極其重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。所以，從民族民間長(zhǎng)期使用的天然藥物中發(fā)現(xiàn)新的非核苷類乙肝病毒抑制劑及此類能夠降低HBsAg和/或抑制HBV DNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物有著很大的指導(dǎo)性意義，并有著遼闊的發(fā)展前景。
基于此目的，發(fā)明人以前曾完成多項(xiàng)抗乙肝病毒天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物的專利和文章，發(fā)現(xiàn)了多種具有抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg或乙肝病毒e抗原HBeAg活性、抑制HBV DNA復(fù)制的化合物，從而說明從天然產(chǎn)物及其合成衍生物中篩選出能夠降低HBsAg、防治乙肝病毒感染的創(chuàng)新性藥物是可行的[參見“一類對(duì)映桉烷醇類倍半萜抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、劉光明、于榮敏、李海波等；ZL 200610053827.4)；“2β-羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(李校堃、趙昱、黃可新、李海波等；ZL 200610053749.8)；“2α，3β-二羥基-5，11-(13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、張禮和、孫漢董、李海波等；ZL 200610053601.4)；“艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝病毒的用途及其藥物組合物”(趙昱、李海波、楊雷香、周長(zhǎng)新等；ZL 03153691.3)；“一種艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物及其應(yīng)用”(趙昱、周長(zhǎng)新、施樹云、王曉雨等；ZL200610053575.5)；“一種桉烷型倍半萜酸及其用途”(趙昱、劉光明、李海波、巫秀美等；ZL 200610053579.3)；“六棱菊屬植物提取物抑制單純皰疹病毒及乙肝病毒的用途”(趙昱、周長(zhǎng)新、于榮敏、白驊；CN 1989989A)；“1β-氧代-5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、李海波等；CN1927197A)；“1β-羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、巫秀美等；CN 1935131A)；“對(duì)映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的醫(yī)藥用途”(黃可新、李校堃、王曉雨、趙昱等；CN 101239054)；“1-氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利紅、巫秀美、趙昱等；CN 101293836)；發(fā)明人已發(fā)表之抑制HBsAg和HBV DNA等活性文章參見“In VitroAntiviral Activity of Three Enantiomeric Sesquiterpene Lactones fromSenecio Species Against Hepatitis B Virus”，Haibo Li(李海波)，Changxin Zhou(周長(zhǎng)新)，Xiumei Wu(巫秀美)，Yu Zhao*(趙昱)等，Antiviral Chemistry & Chemotherapy，2005，16，277-282；“Evaluation of Antiviral Activity of Compounds Isolated fromRanunculus sieboldii Miq.and Ranunculus sceleratus L”，Haibo Li(李海波)，Changxin Zhou(周長(zhǎng)新)，Xiumei Wu(巫秀美)，Yu Zhao*(趙昱)等，Planta Medica，2005，71(12)，1128-1133；“Application ofhigh-speed counter-current chromatography for the isolation of antiviraleremophilenolides from Ligularia atroviolacea”，Shi，Shu-Yun(施樹云)，Hai-Bo(李海波)，Zhao，Yu(趙昱)等，Biomedical Chromatography，2008，22(9)，985-991；“Purification and identification of antiviralcomponents from Laggera pterodonta by high-speed counter-currentchromatography”，Shuyun Shi(施樹云)，Yu Zhao(趙昱)等，Journalof Chromatography B，2007，859，119-124]。毋庸置疑，繼續(xù)從天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物中尋找能夠清除HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物是非常有必要性和緊迫性的，也因此被國(guó)家科技部列為新藥研制重大專項(xiàng)之一。
在上述治療CHB藥物中，還有一類是保肝類藥物，其臨床大量使用之典型為存在于菊科植物水飛薊的種子中的水飛薊素。水飛薊已在臨床上廣泛應(yīng)用，在市場(chǎng)上其商品名為L(zhǎng)egalonTM利肝隆或FlavobionTM，其代表性化合物當(dāng)屬黃酮木脂素水飛薊賓。黃酮木質(zhì)素化合物屬于雜木質(zhì)素類，是由一分子苯丙素和一分子黃酮結(jié)合而成的一類天然產(chǎn)物。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也最高。該藥作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自由基活性水飛薊素對(duì)于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù)作用。1990年Lotteron等人報(bào)道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝引起的體外脂質(zhì)過氧化及由還原型輔酶單獨(dú)引起的過氧化作用，這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或?yàn)樽杂苫宄齽?二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，保護(hù)肝細(xì)胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和α-鵝膏蕈堿等與肝細(xì)胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對(duì)肝細(xì)胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞膜對(duì)于多種損害因素的抵抗力。(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進(jìn)入細(xì)胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝細(xì)胞的修復(fù)和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個(gè)有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora，K.等，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；Saller，R.等，Drugs，2001，61(14)，2035-2063；

R.等，Curr.Med.Chem.2007，14，315-338；

Z.等，Phytother.Res.2003，17，524-530；

R.等，Bioorg.Med.Chem.2004，12，5677-5687；Varga，Z.等；Phytothe.Res.2001，15，608-612.Singh，R.P.等，Curr.Cancer Drug Tar.2004，4，1-11)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木質(zhì)素類化合物引起了越來(lái)越多的關(guān)注，如發(fā)明人于2006-2009年間制備并報(bào)道的多個(gè)系列水飛薊賓類衍生物也具有顯著的抗氧化活性(楊雷香、趙昱等，“Design，Synthesis andExamination of Neuron Protective Properties of Alkenylated andAmidated Dehydro-Silybin Derivatives”，Journal of Medicinal Chemistry，2009，52(23)，7732-7752；汪峰，趙昱等，“Preparation of C-23esterifiedsilybin derivatives and evaluation of their lipid peroxidation inhibitoryand DNA protective properties”，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2009，17(17)，6380-6389；楊雷香，趙昱等，“Synthesis and AntioxidantProperties Evaluation of Novel Silybin Analogues”，Journal of EnzymeInhibition and Medicinal Chemistry，2006，21(4)，399-404；等等)。在發(fā)明人報(bào)道的上述文章中，經(jīng)發(fā)明人設(shè)計(jì)并合成出的多個(gè)系列之A環(huán)、B環(huán)、E環(huán)和23位取代的黃酮木脂素類化合物都顯示出強(qiáng)效捕獲DPPH自由基和超氧陰離子自由基的活性、抗氧化活性、以及保護(hù)PC12細(xì)胞的活性。但是顯而易見上述研究?jī)H集中于研究水飛薊賓類黃酮木脂素的抗氧化作用和細(xì)胞保護(hù)作用。
以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素化合物雖然具有以上所述之抗氧化療效，然而其見報(bào)于抗病毒治療方面之文獻(xiàn)相對(duì)較少。近期(2006年)，謝軍報(bào)道了聯(lián)合應(yīng)用具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用的干擾素和保肝護(hù)肝的水飛薊賓磷脂復(fù)合物治療慢性乙肝的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對(duì)患者體內(nèi)ALT、AST值降低比單獨(dú)用干擾素效果明顯，說明水飛薊賓磷脂復(fù)合物能加強(qiáng)干擾素的治療慢性乙肝之作用。但是，類似的治療方案仍是將水飛薊賓等黃酮木脂素作為輔助用藥，且主要是用于保護(hù)肝細(xì)胞膜而非直接用其實(shí)施抗病毒作用。左國(guó)營(yíng)等(左國(guó)營(yíng)，劉樹玲，徐貴麗，世界華人消化雜志，2006年14卷13期，1241-1246頁(yè))綜述了近20年來(lái)藥用植物成分體外抗HBV活性的研究進(jìn)展，文中論及多種天然產(chǎn)物，其中并沒有報(bào)道任何黃酮木脂素類化合物具有抗HBV活性的相關(guān)記錄，尤其是水飛薊賓類天然產(chǎn)物及其衍生物，國(guó)內(nèi)幾乎無(wú)人涉及，僅由發(fā)明人團(tuán)隊(duì)對(duì)其進(jìn)行了前人未加注意的結(jié)構(gòu)改造和抗氧化活性研究。
黃酮木脂素類化合物治療DNA類病毒感染尤其是其用于抗乙肝病毒方面(包括抑制乙肝表面抗原HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制)的新用途尚未得到有效開發(fā)，故此從黃酮木脂素中尋找抗乙肝病毒領(lǐng)域的活性化合物、也即將黃酮木脂素結(jié)構(gòu)改造使其具有抗DNA類病毒活性是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。從其中發(fā)現(xiàn)抑制HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物更是前人所未嘗試過的挑戰(zhàn)。為了探索這個(gè)領(lǐng)域，我們制備了與水飛薊賓結(jié)構(gòu)有所差異的一種新的黃酮木脂素衍生物，也即在原水飛薊賓之23位連接上一個(gè)乙基丙二?；?，延長(zhǎng)了23位原羥基模塊的取代長(zhǎng)度，同時(shí)引入多個(gè)新的氫鍵受體或給體，如此設(shè)計(jì)可以生成新型空間結(jié)構(gòu)不同于水飛薊賓的一類新型木質(zhì)素二氫黃酮醇類化合物(也是一類新型黃酮木脂素化合物)，以期發(fā)現(xiàn)能降低HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制的黃酮木脂素先導(dǎo)化合物，從而將其進(jìn)一步開發(fā)成具有能清除HBsAg、或抑制HBV DNA復(fù)制治療CHB的創(chuàng)新性藥物，據(jù)此完成本發(fā)明。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了式(1)所示的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備降低乙肝HBsAg、或抑制HBV DNA復(fù)制的治療乙型病毒性肝炎藥物之新用途。

式(1)化合物的名稱為(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯。
本發(fā)明還提供了一種制備式(1)所示的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類黃酮醇木質(zhì)素類化合物的方法，其特征是用市售或者自制的水飛薊賓與乙基丙二酸在三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯存在下，進(jìn)行縮合反應(yīng)而得。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種用于降低乙肝HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎的組合物，其特征為由含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
本發(fā)明的23位乙基丙二酰基取代的水飛薊賓酯化合物(1)與天然黃酮木脂素類化合物水飛薊賓相比較，具有諸多結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)上差異化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氫鍵受體、電性、分子間范德華力、以及3D構(gòu)象、伸展方向、分子重心、電性分布中心等特質(zhì)均與水飛薊賓有著明顯不同；且化合物(1)分子量比水飛薊賓增大了114個(gè)質(zhì)量單位。上述特征都決定了式(1)所示化合物之三維構(gòu)象與HBsAg或HBV DNA之3D空間結(jié)構(gòu)相結(jié)合之配體-受體結(jié)合復(fù)合物形態(tài)和結(jié)合方式、結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式、其結(jié)合自由能等均會(huì)產(chǎn)生較大的改變，因而在抑制HBsAg或抑制HBVDNA復(fù)制方面有著意想不到的效果。
綜上所述，我們合成的該水飛薊賓酯類黃酮木脂素既有結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性，又有抗病毒作用方面研究的新穎性，并在抗乙肝病毒活性測(cè)試中發(fā)現(xiàn)了不尋常的抑制HBsAg的活性，有望成為降低HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制及治療CHB之先導(dǎo)化合物。我們測(cè)試了該化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)測(cè)試了其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型HBsAg及對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中合成得到的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯即(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型HBsAg具有顯著的抑制活性，在100微克/毫升濃度下其清除HBsAg強(qiáng)度超過陽(yáng)性對(duì)照藥物(10000單位/毫升的α-干擾素)2倍半；更遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另一陽(yáng)性對(duì)照一線用藥拉米呋啶；同時(shí)，在100微克/毫升濃度時(shí)該化合物對(duì)HBV DNA顯示出大于84％的抑制率。以上均說明式(1)化合物有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預(yù)期其可以作為降低乙肝HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎之活性先導(dǎo)化合物繼續(xù)開發(fā)。經(jīng)本發(fā)明人詳細(xì)的文獻(xiàn)查閱，到目前為止，尚無(wú)有關(guān)該化合物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道。黃酮木脂素式(1)化合物對(duì)于HBsAg和HBVDNA強(qiáng)效抑制均屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)，有著確切的原創(chuàng)性。
本發(fā)明有益之處在于首次發(fā)現(xiàn)式(1)所示之23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類黃酮木脂素具有降低乙肝HBsAg、抑制HBVDNA復(fù)制的功效，并在防治乙肝病毒方面的成藥潛力，為開發(fā)成為治療乙肝病毒創(chuàng)新藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明再一特點(diǎn)為本發(fā)明之合成起始物來(lái)源方便，合成方便。其制備方法簡(jiǎn)單易行、原料來(lái)源方便易得、成本低、污染小、利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化前景十分明確。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明人通過多步簡(jiǎn)單合成，并通過層析手段得到該既能強(qiáng)效抑制乙肝HBsAg的分泌又能有效抑制HBV DNA復(fù)制活性的一個(gè)23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類黃酮木脂素類活性化合物，又經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振波譜等綜合解析推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，而對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙肝HBsAg的分泌和HBV DNA的復(fù)制具有顯著的抑制作用，提示該化合物具有用藥安全、強(qiáng)效降低HBsAg及抑制HBV DNA復(fù)制高效的特點(diǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明人的研究，發(fā)明人所設(shè)計(jì)并合成的式(1)所示之黃酮木脂素化合物可以用于制備治療乙肝病毒感染性疾病的藥物和用于治療乙肝病毒感染性疾病。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用式(1)化合物的制備及其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用以及對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg及HBV DNA復(fù)制之抑制作用試驗(yàn)的結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。實(shí)施例給出了式(1)化合物的部分合成、結(jié)構(gòu)鑒定和活性數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1式(1)化合物(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯的制備 1.1儀器與試劑 紫外光譜用Shimadzu UV-240紫外分光光度計(jì)測(cè)定；核磁共振氫譜1H-NMR由INOVA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARIAN INOVA-400MHz)測(cè)定(四甲基硅醚TMS為內(nèi)標(biāo))；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS由BrukerEsquire 3000+質(zhì)譜儀測(cè)定，柱層析用硅膠(100-200，200-300和300-400目)以及薄層層析用硅膠GF254(10-40目)均由青島海洋化工廠生產(chǎn)；所用試劑均為分析純，其中石油醚沸程為60-90℃；薄層制備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔硅膠板；柱色譜用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司產(chǎn)品；反相硅膠RP-18采用日本Fuji Silysia Chemical公司的Chromatorex產(chǎn)品；MCI為日本三菱化工公司產(chǎn)品，薄板(TLC)檢測(cè)用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10％硫酸-乙醇以及磷鉬酸溶液。
1.2式(1)化合物的制備
在干燥的反應(yīng)瓶中加入1克水飛薊賓(購(gòu)自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測(cè)純度98％)，0.56克丙二酸單乙酯和1.6克三苯基膦，用20毫升無(wú)水四氫呋喃溶解，加入1克偶氮二甲酸二乙酯，加完后于室溫?cái)嚢?0小時(shí)，減壓蒸餾除去溶劑，加入5毫升氯仿，過濾除去白色固體，母液經(jīng)柱層析，得淺黃色粉末0.46克，收率37％。Rf(氯仿/醋酸乙酯/乙酸＝50/1/0.25)0.11；核磁共振氫譜1HNMR(400MHz，氘代氯仿)δ1.28(三重峰，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.41(單峰，2H，COCH2CO)，3.76(單峰，3H，OCH3)，4.08(多重峰，1H，H-23a)，4.22(多重峰，2H，H-3，10)，4.30(多重峰，2H，OCH2CH3)，4.36(多重峰，1H，H-23b)，4.90(雙峰，J＝7.6Hz，1H，H-11)，4.98(雙峰，J＝10.8Hz，1H，H-2)，5.99(單峰，1H，H-6)，6.07(單峰，1H，H-8)，6.82～8.25(多重峰，9H，芳香環(huán)Ar-H)，11.19(單峰，1H，5-OH)；電噴霧質(zhì)譜ESI-MSm/z 595[M-H]+。
實(shí)施例2式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用 2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素，100微克/毫升G418的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.2采用MTT法測(cè)定式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1×105個(gè)/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物(1)，濃度分別為1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對(duì)照孔。抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照孔OD值×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
測(cè)定化合物對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1×105/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100毫升，在37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的樣品，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測(cè)樣品。用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中HBsAg濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽(yáng)性對(duì)照1(測(cè)試濃度100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)；以α-干擾素為陽(yáng)性對(duì)照2(測(cè)試濃度10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單位/毫升)。
2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，式(1)化合物有顯著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，但對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg在第八天時(shí)高劑量下抑制活性高于拉米呋啶和α-干擾素。
表1.樣品對(duì)HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原抑制率(％)
該實(shí)施例結(jié)果說明式(1)所示之黃酮木脂素化合物(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有顯著的抑制作用，其在較高濃度(100微克/毫升)時(shí)對(duì)HBsAg抑制活性即遠(yuǎn)超過拉米呋啶360％，且比α-干擾素最高測(cè)試濃度10000單位/毫升濃度下相應(yīng)的HBsAg抑制活性高2.5倍多；可見該黃酮木脂素有很強(qiáng)的抑制病毒分泌表面抗原活性。
HBsAg清除是臨床上最接近治愈的狀態(tài)，對(duì)于乙肝患者，其HBsAg清除成為非常有價(jià)值的CHB治療終點(diǎn)。因而式(1)所示之黃酮木脂素化合物可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的藥物。
實(shí)施例3式(1)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)復(fù)制的抑制作用 3.1細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例2。
3.2采用MTT法測(cè)定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用方法同實(shí)施例2。
3.3測(cè)定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)復(fù)制的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1×105個(gè)/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)所示之黃酮木脂素化合物，濃度分別為100微克/毫升、20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2，100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測(cè)樣品。第8天時(shí)用HBV DNA定量PCR試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中HBV DNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽(yáng)性對(duì)照1(測(cè)試濃度100微克/毫升、20微克/毫升和4微克/毫升)，以α-干擾素為陽(yáng)性對(duì)照2(測(cè)試濃度10000單位/毫升、5000單位/毫升、1000單位/毫升)。
3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果舉例說明如表2所示，黃酮木脂素式(1)化合物具有強(qiáng)效的抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸復(fù)制的作用。
表2樣品對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制的抑制率(％)

該實(shí)施例結(jié)果說明式(1)所示之黃酮木脂素化合物對(duì)乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的復(fù)制具有比較強(qiáng)的抑制作用，其在較高劑量(100微克/毫升)時(shí)對(duì)HBV DNA的復(fù)制抑制活性達(dá)到84％，超過陽(yáng)性對(duì)照1拉米呋啶；而陽(yáng)性對(duì)照α-干擾素在第8天最高測(cè)試濃度(10000單位/毫升)時(shí)對(duì)HBV DNA僅有38.2％的抑制活性。因此該化合物屬于顯著有效的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物，值得進(jìn)一步關(guān)注和深入研究，并可預(yù)期進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)展為抑制HBV DNA復(fù)制的藥物。
在上述說明書闡述本發(fā)明時(shí)，同時(shí)提供了實(shí)施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實(shí)際操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的23位乙基丙二酰基取代的水飛薊賓酯類
黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途；
式(1)
式(1)化合物的名稱為(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯。
2.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg藥物之用途；
式(1)化合物的名稱為(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯。
3.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBV DNA復(fù)制藥物之用途；
式(1)化合物的名稱為(±)-丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基乙酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及取代水飛薊賓酯用于制備治療病毒性乙肝藥物的用途，具體而言，本發(fā)明涉及一個(gè)23位乙基丙二?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽用于制備降低乙肝病毒表面抗原HBsAg、抑制HBVDNA復(fù)制的治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物的用途，該黃酮木脂素具有甚為顯著的抑制HBsAg活性，在100微克/毫升濃度下其清除HBsAg強(qiáng)度超過陽(yáng)性對(duì)照藥物α-干擾素2倍半；同時(shí)該化合物對(duì)HBV DNA顯示出較強(qiáng)的抑制活性。以上藥效學(xué)結(jié)果表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽可預(yù)期用于制備降低乙肝病毒表面抗原、抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物的用途。
文檔編號(hào)A61P31/20GK101829083SQ20101018134
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者彭芳, 陳海永, 楊月娥, 胡明輝, 于榮敏, 巫秀美, 趙昱, 郝小江 申請(qǐng)人:大理學(xué)院