專利名稱：腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut及構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溶瘤腺病毒生物制劑，特別是涉及一種攜帶有分子化療基因的溶 瘤腺病毒生物制劑-腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut及構(gòu)建方法和用途， 該溶瘤腺病毒生物制劑注射人體后與低濃度核苷酸化療藥配合使用，可對實體腫瘤進行靶 向殺傷，并且有效減低病毒及化療藥物帶來的副作用，是具有分子水平安全控制機制的腫 瘤靶向雙重殺傷機制的實體腫瘤分子治療制劑。
背景技術(shù)：
盡管投入巨大，腫瘤的病因?qū)W研究近50年在世界范圍內(nèi)沒有根本性突破(2006 年諾貝爾論壇瑞典)；中國工程院院士郝希山最近主持完成的“惡性腫瘤流行趨勢分析及 預(yù)防研究”發(fā)現(xiàn)59種惡性腫瘤發(fā)病率20年間升高了約50% ；然而，美國國立癌癥研究院 NCI (National Cancer Institute)的年度報告顯示腫瘤病死率連續(xù)兩年呈下降趨勢，報 告中指出病死率的下降得益于過去幾十年戒煙的普及，早期腫瘤的篩查，以及有效的新的 治療手段1 ；可見積極預(yù)防，早期發(fā)現(xiàn)，提高治療水平是目前應(yīng)對腫瘤行之有效的三項法寶。 然而，盡管隨著診斷技術(shù)的進步，越來越多的早期腫瘤被發(fā)現(xiàn)；但對于早期即發(fā)生的微轉(zhuǎn)移 病灶及晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤目前尚無根本有效的殺傷治療手段。給患者帶來巨大痛苦、及沉重 經(jīng)濟負擔的化學治療、放射治療、內(nèi)分泌治療也只能對于20-70%左右的某些組織來源的腫 瘤病人有效，且即使結(jié)合外科治療也難以達到完全根治水平2’3。盡管一些關(guān)鍵問題有待解決，腫瘤分子治療的研究正在世界范圍內(nèi)廣泛開展。國 內(nèi)外多年惡性腫瘤全方位的研究已經(jīng)明確腫瘤的發(fā)生是一個多基因，多步驟，多因素的復(fù) 雜過程2’3，針對某一致癌基因的單一基因治療往往難以奏效；然而，拋開眾多復(fù)雜的致瘤基 因，通過某種機制，從單純殺傷角度，用單一基因殺傷腫瘤細胞卻是切實可行的；其技術(shù)的 關(guān)鍵是殺傷基因的作用強度，外源基因轉(zhuǎn)入手段及腫瘤細胞的靶向殺傷。惡性腫瘤轉(zhuǎn)入編碼單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因，再輔以 GCV(ganciclovir)治療是最常見的腫瘤“自殺”基因治療策略；核苷酸激酶可以磷酸化核 苷酸類似物(癌前藥物)如GCV成毒性代謝產(chǎn)物，干擾DNA的合成復(fù)制4，從而導(dǎo)致腫瘤細胞 死亡。另外，除了表達HSV-TK的細胞，由于某種機制已磷酸化核苷酸類似物也可以進入周 圍細胞5，這種被稱做“旁觀者效應(yīng)”的現(xiàn)象可以大大增強“自殺”基因治療效果。以HSV-TK 基因為代表的自殺基因治療惡性腫瘤早已進入臨床III期試驗。然而實際臨床效果卻未能 達到實驗室及動物實驗水平，其主要原因就是自殺基因本身的酶動力活性的強度不足及其 底物的單一性6，尋找新的自殺基因或遺傳學改造現(xiàn)有基因一直是科學家努力的方向。公開號為CN1793343的中國發(fā)明專利申請《具有腫瘤靶向性和腫瘤自殺性的溶瘤 性抗癌重組腺病毒》，給出了兩組(十種)溶瘤性重組腺病毒。一組由在病毒E1A基因上定 點突變而產(chǎn)生。另一組以腫瘤專異性啟動子取代E1A啟動子而構(gòu)建成。此外，一部分重組 腺病毒因其纖維末端節(jié)加了 RGD短肽而具有感染癌細胞的靶向性。同時，一部分重組病毒攜帶有腫瘤自殺性基因HSVrtkm。但是，以上溶瘤性重組腺病毒所采用的自殺基因HSV-TK 是早在80年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用的(Intervirology. 1991 ；32(2) =76-92. Review), TK作 為自殺基因國際上早已進行三期臨床實驗，且效果不理想，所提供的溶瘤腺病毒以及類似 發(fā)明中的E1A保留的增殖性腺病毒在實際應(yīng)用中均有著共同的弊端，即腺病毒雖然能夠通 過增殖導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，起到治療作用，但之后其腺病毒在人體內(nèi)感染播散能力往往難 以控制。本申請人1999-2002年在Johansson研究小組攻讀博士期間，完成了黑腹果蠅脫 氧核苷酸激酶(Deoxyribonucleoside Kinase of DrosophilaMelanogaster Dm-dNK)作為 新的“自殺”基因在in vitro水平的評估實驗；結(jié)果表明7_9 黑腹果蠅的這一脫氧核苷酸 激酶完全可以在人類的惡性腫瘤細胞(如胰腺癌、骨肉瘤)中表達并繼續(xù)保持高的催化活 性，細胞毒性實驗證實表達基因的腫瘤細胞對一些核苷酸類似物的半數(shù)致死量(IC50)較 非轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞對照降低50-6400倍。Dm-dNK極有可能用作分子化療基因，從分子水平 治療惡性腫瘤。最近的研究w發(fā)現(xiàn)Dm-dNK氨基酸序列C末端的最后10位氨基酸具有與其它激酶 不同的特殊性，它不僅影響到催化活性，而且包含了核定位信號，我們用PCR堿基置換法對 Dm-dNK末10位氨基酸進行了改變，位點分別為244E，245S，和251S，并在序列最后插入了氨 基酸252R，得到了 Dm-dNK mutant (dNKmut)。通過研究發(fā)現(xiàn)，dNKmut激酶有著比Dm-dNK野 生型更高的活性，而且能夠胞漿強表達，在胞核弱表達，這樣核苷酸藥物在進入細胞后，就 可以在不同的細胞亞結(jié)構(gòu)進行磷酸化，導(dǎo)致最終的三磷酸化產(chǎn)物進入細胞核或線粒體，抑 制腫瘤DNA的合成，使癌細胞凋亡，因此分子化療基因dNKmut與Dm-dNK相比更適合于在基 因治療中的應(yīng)用。腺病毒不僅是最常用最有效的外源基因轉(zhuǎn)入載體，而且可以直接作為腫瘤細胞的 靶向生物殺傷武器1h4。0NYX-015(dll520)是研究最多的用于靶向瘤裂解的腺病毒，腺病 毒在宿主細胞中的復(fù)制會受到E1B 55Kda蛋白和p53蛋白的調(diào)控，其主要機制是p53蛋白 可抑制腺病毒在宿主細胞中的復(fù)制，而E1B 55K蛋白則通過抑制宿主細胞p53以確保腺病 毒的復(fù)制能順利進行。dll520是E1B 55K基因改變或缺失的腺病毒。由于這個缺陷，dll520不能表達E1B 55Kda蛋白，從而不能抑制p53，因此不能在 P53功能正常的細胞中復(fù)制，但可以在p53功能缺陷的腫瘤細胞中復(fù)制15’16。盡管確切機制 有待進一步探討17’18，E1B缺陷性腺病毒治療實體腫瘤已進入III期臨床試驗12’13’19。幾乎 完全相同的E1B缺陷性腺病毒H101 (中國三維生物科技有限公司)已于2005年11月在中 國獲得新藥證書，成為具有中國專利的國家創(chuàng)新藥物。然而，與復(fù)制缺陷病毒載體相比，它 的復(fù)制及傳播擴散能力大大增加了毒副作用出現(xiàn)的可能，特別是由于先前事故的發(fā)生，其 使用的安全性受到了廣泛的關(guān)注和擔心，因此病毒滴度使用的限制及單一的殺傷手段可能 是導(dǎo)致臨床治療效果不完美的根本因素。雖然dNKmut比Dm-dNK野生型及傳統(tǒng)化療基因HSV-TK有著更高的催化效率及更 廣的底物特異性，由于該基因的發(fā)現(xiàn)屬于申請人的原創(chuàng)研究，時至今日并未有人將其與靶 向瘤裂解的腺病毒(溶瘤腺病毒)相結(jié)合使用，來進一步提高腫瘤靶向治療的實用價值。而 且我們課題組的最新研究首次發(fā)現(xiàn)Dm-dNKmut基因還有另一個更重要的特性，即將核苷酸 化療藥物磷酸化后，磷酸化產(chǎn)物可以終止病毒的復(fù)制，即將安全控制機制引入可復(fù)制增殖的病毒載體，減低治療副作用，這是以往利用病毒載體進行基因治療的方法中所沒有解決 的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，將利用分子化療基因的腫瘤基 因治療與溶瘤病毒治療二者的優(yōu)勢結(jié)合起來，同時又能夠高效磷酸化多種核苷酸藥物的腫 瘤分子化療基因_病毒SG500-dNKmut.本發(fā)明另一個目的在于將安全控制機制引入可復(fù)制增殖的病毒載體可望解決病 毒使用安全性問題。Dm-dNKmut基因的一個最重要的特性就是，它即可以磷酸化抗腫瘤癌前 藥物，也可以磷酸化抗病毒的核苷酸類似物。一但這些核苷酸類似物被使用，病毒的復(fù)制將 被完全終止。本發(fā)明另一個目的在于提供了一種腫瘤靶向分子化療基因_病毒的構(gòu)建方法。本發(fā)明給出的技術(shù)解決方案是這種腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑 SG500-dNKmut，其特征在于，該病毒制劑以ElB55kda基因缺失的5型腺病毒SG500為載體， 并攜帶有分子化療基因Dm-dNKmut。本發(fā)明給出的這種腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut的構(gòu)建方法， 包括以下步驟A、將分子化療基因Dm-dNKmut克隆進載體質(zhì)粒的多克隆位點，然后用限制性內(nèi)切 酶切除基因表達框，該表達框包含CMV啟動子、分子化療基因Dm-dNKmut、SV40polyA尾巴， 插入腫瘤特異性增殖的腺病毒載體質(zhì)粒PSG500，構(gòu)建成質(zhì)粒pSG500-dNKmut ；B、將得到的質(zhì)粒pSG500-dNKmut與含有腺病毒骨架DNA的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293 細胞株，同源重組后擴增，經(jīng)過氯化銫梯度離心提純產(chǎn)生，具有感染性的含有分子化療基因 的病毒制劑SG500-dNKmut。為更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述CMV啟動子也可以用下列特異性啟動子中的一 種啟動子代替(1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子；(2)乳腺癌組織特異性啟動子；(3)癌胚抗原 啟動子；(4)前列腺特異性抗原啟動子；(5)甲胎蛋白啟動子。本發(fā)明給出的這種腫瘤靶向分子化療基因_病毒制劑SG500-Dm_dNK的用途，是用 于制備治療實體腫瘤藥物。特別是腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut可以與 下列化合物之一組成藥用組合物各種化療藥物、生物毒素、免疫抑制化合物、單克隆抗體。本發(fā)明提供的攜帶腫瘤靶向分子化療基因dNKmut的重組腺病毒，構(gòu)建方法易于 掌握，經(jīng)細胞試驗證明，分子化療基因dNKmut可以特異性的在腫瘤細胞中高表達，而在正 常細胞中表達很少，該化療基因能夠磷酸化多種嘧啶嘌呤類的核苷酸化療藥物，可用于治 療多種腫瘤；本發(fā)明提供的分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut，是一種腫瘤特異性病毒， 能選擇性地在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制增殖和表達所攜帶的分子化療基因dNKmut，故該病毒制劑具 有很高的靶向抗癌作用。本發(fā)明提供的分子化療基因-病毒制劑SG500_dNKmut，經(jīng)細胞和動物實驗證明， 低滴度病毒感染細胞或動物，與低于正常劑量100-1000倍的核苷酸化療藥配合使用，即能 有效抑制腫瘤生長，殺滅腫瘤細胞的同時而不影響正常細胞，為今后用于人類腫瘤治療打下了良好基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的分子化療基因-病毒制劑SG500_dNKmut，經(jīng)細胞和動物實驗證明， 再高效殺傷腫瘤同時能夠控制自身病毒過量增殖，限制了病毒復(fù)制及傳播擴散能力而帶來 的毒副作用，安全性得到了保障。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是(1)雙重腫瘤殺傷機制(“二次打擊”)；病毒選擇性瘤裂解機制和分子化療機制；(2)引入安全控制機制，增加了復(fù)制增殖腺病毒載體的使用安全性；(3)ElB缺陷腺病毒的腫瘤細胞選擇復(fù)制的同時也控制了 dNKmut腫瘤細胞的靶向 轉(zhuǎn)染；(4)短期基因表達即可見效，并不需要知道腫瘤的致病原因；(5)腫瘤細胞毒性代謝產(chǎn)物將同時殺傷非耐藥性及已產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞；(6)由于“旁觀者效應(yīng)”的存在，即使轉(zhuǎn)入一小部分腫瘤細胞，也可達到整體殺傷效 果，而復(fù)制增殖腺病毒載體的使用將增強“旁觀者效應(yīng)”；(7)由于病毒增殖能力和dNKmut的高催化活性，可以使用極低滴度的病毒和低濃 度的癌前藥物，將進一步增加病毒使用安全性，減少毒副作用；(8) dNKmut的多底物特性，使得有多種抗癌及抗病毒的核苷酸類似物可供選擇；(9)由于dNKmut并無毒性，只有加入核苷酸類似物(抗癌，抗病毒藥物)后方呈現(xiàn) 細胞毒性，因此可人為控制加入核苷酸類似物的時間，治療更具主動性和可操作性；并方便 觀察第一殺傷機制的效果，可能產(chǎn)生全新的殺傷腫瘤細胞、并殺滅或控制病毒復(fù)制、防止全 身播散的新策略。


圖IA為本發(fā)明的分子化療基因dNKmut氨基酸改變位點，及SG500_dNKmut結(jié)構(gòu)示意圖。圖IB為本發(fā)明的分子化療基因_病毒SG500_dNKmut構(gòu)建所用質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2為本發(fā)明的分子化療基因_病毒SG500_dNKmut靶向雙重殺傷機制示意圖。圖3A為分子化療基因-病毒SG500_dNKmut在正常細胞或腫瘤細胞中的表達位置。圖3B為分子化療基因-病毒SG500_dNKmut在正常細胞或腫瘤細胞中的表達情況。圖3C為分子化療基因-病毒SG500-dNKmut在正常細胞或腫瘤細胞中，Dm-dNK活 性，即磷酸化能力的測定。圖4為MTT法檢測腫瘤細胞和正常細胞經(jīng)IMOI (multiplicity of infection)病毒 SG500-dNKmut及對照病毒處理后，再不同濃度，不同種類核苷酸化療藥作用下，細胞的存活率。圖5Westernblot法檢測腫瘤細胞和正常細胞經(jīng)IMOI (multiplicity ofinfection)病毒SG500_dNKmut及對照病毒處理后，在低濃度核苷酸化療藥作用下，腺病 毒早期轉(zhuǎn)錄單位ElA表達下降，病毒明顯被抑制。圖6A為分子化療基因_病毒SG500_dNKmut與低濃度化療藥物配合在裸鼠體內(nèi)治療腫瘤細胞移植瘤的結(jié)果示意圖。圖6B為免疫組化方法，檢測分子化療基因_病毒SG500_dNKmut與低濃度化療藥 物配合，在裸鼠腫瘤細胞移植瘤內(nèi)使腺病毒早期轉(zhuǎn)錄單位ElA表達下降，活體內(nèi)抑制病毒 增殖情況。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。實施例1、分子化療基因-病毒SG500_dNKmut結(jié)構(gòu)及靶向雙重殺傷原理Dm-dNK與dNKmut氨基酸序列對比圖，如圖1所示，與Dm-dNK野生型相比，dNKmut 最后10位氨基酸發(fā)生了隨機改變，位點分別為244E，245S，和251S，并在序列最后插入了氨 基酸252R。SG500溶瘤腺病毒為病毒E1，E3區(qū)保留，ElB55_kDa基因缺失的靶向病毒，其中 dNKmut的表達框(CMV啟動子，his-tag組氨酸標簽，ATG起始密碼，dNKmut序列，SV40polyA 尾)被插入到E3區(qū)的多克隆位點處，產(chǎn)生重組腺病毒SG500-dNKmut。ITR，腺病毒末端重復(fù) 序列；Ψ，5型腺病毒包裝信號；Ad5 fiber，5型腺病毒骨架。
感染SG500-dNKmut病毒后，dNKmut激酶能夠在癌細胞內(nèi)靶向表達，加入極低濃 度的核苷酸化療藥后，由于dNKmut激酶的高催化效率，核苷酸類的化療藥物仍能磷酸化成 為單磷酸鹽，經(jīng)人體內(nèi)內(nèi)源性細胞激酶作用，使其轉(zhuǎn)化成高度毒性的三磷酸鹽，抑制癌細胞 DNA合成致細胞凋亡；另一方面溶瘤病毒SG500(購自上海醫(yī)元生物公司)能夠在瘤細胞 內(nèi)靶向增殖，致瘤裂解，直接殺傷癌細胞，實現(xiàn)雙重殺傷。隨著實際應(yīng)用過程中核苷酸藥物 濃度不斷下調(diào)，表達有dNKmut的癌細胞由于dNKmut激酶的高催化效率仍能催化核苷酸成 為高毒性的三磷酸形式，殺傷癌細胞并產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)9 ；而正常細胞或未感染dNKmut的 癌細胞由于自身激酶效率低，對低濃度的藥物不敏感，藥物未能磷酸化，因此細胞毒性不明 顯，實現(xiàn)了分子水平安全控制機制的實體腫瘤靶向雙重殺傷，如圖2。實施例2、腫瘤靶向分子化療基因-病毒SG500_dNKmut的構(gòu)建本發(fā)明給出的腫瘤靶向分子化療基因_病毒制劑SG500_dNKmut的構(gòu)建方法，包括 以下步驟將分子化療基因Dm-dNK克隆進載體質(zhì)粒的多克隆位點，然后用限制性內(nèi)切酶切 除基因表達框，該表達框包含CMV啟動子、分子化療基因dNKmut、SV40poIyA尾巴，插入腫瘤 特異性增殖的腺病毒載體質(zhì)粒PSG500，構(gòu)建成質(zhì)粒pSG500-dNKmut ；將得到的質(zhì)粒pSG500-dNKmut與含有腺病毒骨架DNA的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293 細胞株，同源重組后擴增，經(jīng)過氯化銫梯度離心提純產(chǎn)生，具有感染性的含有分子化療基因 的病毒制劑SG500-dNKmut。具體的構(gòu)建方法如下1、PUC19載體的酶切回收PUC1920. OulEcoR I3. OulBamH I3. OulNEB 2 Buffer 10. Oul
10XBSA10. OulH2O54. Oul_總體系100. Oul37°C水浴6h后，直接用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction)回收PUC19線 性化條帶2665bp。2、dNKmut目的基因獲得Plxsn-dNKmut 1. OulGT1601. OulGT1611. OulKOP PLUS1. OuldNTP5. OulMgS042. OulKOD Buffer5. OulH2O34. Oul_總體系50. Oul1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction)回收dNKmut 基因779bp。dNKmut目的基因酶切回收dNKmut30. OulEcoR I3. OulBamH I3. OulNEB 2 Buffer 10. Oul10XBSA10. OulH2O44. Oul_總體系100. Oul37°C水浴6h后，直接用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction)回收753bp條 帶。3、連接PUC19/EcoR I+BamH I2uldNKmut/EcoR I+BamH I8ulSolution IIOul_總體系20. Oul12°C連接12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板(含AMP) 后，37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長的細菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB溶液 中，37°C搖床擴增12h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后命名為PUC 19_dNKmut。
4、PUC19_dNKmut載體的酶切回收PUC19-dNKmut20.OulEcoR I3. OulBamHI3. Oul
Buffer 210. Oul10XBSA10. OulH2O54. Oul_總體系100. Oul37 V水浴6h后，1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳.用膠回收試劑盒(QIAquick GelExtraction)回收 dNKmut 基因 755bp。5、PENTER12載體的酶切回收PENTER123. OulEcoRI3. OulBamHI3. OulBuffer 210. Oul10XBSA10. OulH2O71. Oul_總體系100. Oul37 V水浴6h后，1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳.用膠回收試劑盒(QIAquick GelExtraction)回收線性化載體3025bp。6、連接PUC19-dNK/EcoR I+BamH I 8ulPENTER12/EcoR I+BamH I2ulSolution IIOul_總體系20. Oul12°C連接12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板(含AMP) 后，37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長的細菌單克隆，在含KAN的LB溶液中，37°C 搖床擴增12h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后命名為PENTER12-dNKmut。7、LR 重組PENTER12-dNKmut (150ng/ul) IulPPE3-RC(150ng/ul)IulLR 重組酶2ulIXTE6ul_總體系10. Oul25°C連接12h。第二日轉(zhuǎn)化前加入Iul的蛋白酶K.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板(含AMP)后，37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長的細菌單 克隆，在含AMP的LB溶液中，37°C搖床擴增12h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確 后命名為 PPE3-mCMV-dNKmut。8、重組腺病毒將質(zhì)粒PPE3-mCMV-dNKmut 與 SG502 用 Lipof ectamine2000 共轉(zhuǎn)染至 293 細胞。共 轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，應(yīng)用QIAGEN DNA Blood Mini Kit (QIAGEN公司)提取腺病 毒DNA，應(yīng)用PCR進行鑒定。應(yīng)用氯化銫梯度離心純化病毒。經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為 SG500-dNKmut,即mCMV調(diào)控的帶dNKmut基因的腫瘤特異性增殖型腺病毒。附試劑材料PENTRl2, PENTRl3, PPE3-RC 載體，SG500 上海新基因公司Xbal、BamHI、EcoRI、Hind III、Seal NEB 公司Taq酶申能博彩公司DNA 連接酶 SolutionITakaRa 公司蛋白酶K、RNA酶PR0MEGA公司胎牛血清、小牛血清、dNKMGIBCO BRL公司瓊脂糖、溴化乙錠GENE公司瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物UNIPATH公司膠回收試劑盒QIAGEN公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒QIAGEN公司質(zhì)粒DNA制備試劑盒QIAGEN公司病毒DNA提取試劑盒QIAGEN公司LipofectAmine2000 試劑盒GIBCO BRL 公司引物 GT160 5，CCGGAATTCACCATGGCGGAGGCA 3，GT161 5’ CGCGGATCCTCATTATCTGGCGAC 3’實施例3、病毒SG500-dNKmut感染正常細胞或腫瘤細胞后化療基因Dm_dNK表達及 活性情況免疫熒光觀察dNKmut表達位置及表達量，1 X IO5的乳腺癌細胞系Bcap37、胃癌細 胞系SGC-7901和正常肺成纖維細胞系MRC-5 (細胞系均購于上海中科院細胞庫)鋪于24孔 板中，感染MOI = 1的SG500-dNKmut及AchdNKmut (非增殖型腺病毒攜帶dNKmut基因)48h 后，用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗細胞后，4%多聚甲醛固定25分鐘，孵育一抗(鼠抗人組氨 酸標簽抗體購于Merck，德國)2個小時后，Hochest33258染細胞核15分鐘后，孵育二抗(羅 丹明標記的羊抗鼠購于Santa Cruz Biotechnology，美國)，標記的蛋白dNKmut在熒光顯 微鏡下觀察(Olympus Tokyo,日本)。如圖3A所示，羅丹明標記的紅色熒光顯示了 dNKmut的表達位置，漿內(nèi)表達明顯， 核內(nèi)亦有少許，而且從熒光深淺程度可以看出表達量多少，增殖型的SG500-dNKmut比非增 殖型的在癌細胞內(nèi)表達要多，在正常細胞內(nèi)差不多。將1 X IO6的乳腺癌細胞系Bcap37、胃癌細胞系SGC-7901和正常肺成纖維細胞系 MRC-5鋪于25cm2培養(yǎng)瓶中，感染MOI = 1的SG500_dNKmut及SG500 (空載體對照組)48h 后，Trizol 收集細胞，提取 RNA，采用 RT-PCR Kit (TaKaRa，Japan)及引物 Sense 5'CCG GAATTC ACC ATG GCG GAG GCA 3，，Antisense 5' CGCGGA TCC TCA TTA TCT GGC GAC 3'確定 Dm-dNK在細胞內(nèi)表達情況。結(jié)果如圖3B所示(a) SG500_dNKmut (b) SG500感染的細胞系中，乳腺癌細胞系 Bcap37、胃癌細胞系SGC-7901中分子化療基因Dm_dNK表達量高，而正常細胞系MRC-5表達 量低，可見病毒SG500-dNKmut的靶向性。放免法測定dNKmut活性酶活性測定見上述文獻7概括為3. 0 μ mol/L[methyl 3H] dThd及2 μ mol/L非標記的dThd用于酶促反應(yīng)中。24°C恒溫水浴30min。加入含2mmol/ LEDTA的20mmol/L HEPES反應(yīng)停止液中，Dowex AG層析，液閃方法測定[3H]_dThd的放射 活性。結(jié)果如圖3C所示，病毒SG500_dNKmut在癌細胞系中酶活性很高，有很強磷酸化 能力，由于病毒的選擇性在正常細胞系中弱表達，而沒有攜帶分子化療基因的空載體病毒 SG500基本無活性。實施例4、病毒SG500_dNKmut與低濃度核苷酸藥物配合對腫瘤殺傷能力及誘導(dǎo)凋 亡情況的檢測乳腺癌細胞系Bcap37、胃癌細胞系SGC-7901和正常細胞系MRC- 5以3000/孔鋪入 96孔板，培養(yǎng)24小時后，分別加入分別加入MOI = 1的病毒SG500-dNKmut，及對照用空載 病毒SG500，非增殖型病毒Ad-dNKmut，及空載的Ad-blank，感染四種細胞系，感染48h后，梯 度濃度加入核苷酸藥物 gemcitabine (dFdC，2，，2，-difluoro-deoxycytidine)，商品名為健 澤，作用3天后做MTT實驗(Cancer Research，1989，49 (17) :4785_90)，通過比較癌細胞及 正常細胞細胞存活率，病毒SG500-dNKmut殺傷效果及安全性。如圖4所示病毒SG500-dNKmut在極低濃度藥物0. ΟΟΙμΜ gemcitabine配合下， 即可殺傷80%以上的癌細胞，而對正常細胞MRC-5毒性很小，具有腫瘤靶向性，實現(xiàn)治療目 的，非增殖型病毒Ad-dNKmut則沒有選擇性。實施例5、病毒SG500-dNKmut與低濃度核苷酸藥物配合控制病毒自身復(fù)制的情況乳腺癌細胞系Bcap37、胃癌細胞系SGC-7901和正常細胞系MRC-5以IX IO6/孔鋪 于6孔板，培養(yǎng)24小時后，分別加入分別加入MOI = 1的病毒SG500-dNKmut，及對照用空 載病毒SG500，非增殖型病毒Ad-dNKmut，野生5型腺病毒W(wǎng)tAd，，感染四種細胞系，感染48h 后，分別加入低濃度的核苷酸藥物gemcitabine，對照病毒組不加藥物處理，作用3天后，6 孔板內(nèi)的細胞收集后，加入蛋白裂解液提取蛋白，Westernblot法檢測腺病毒早期轉(zhuǎn)錄單位 ElA表達量的變化。結(jié)果如圖SWesternblot結(jié)果所示病毒SG500_dNKmut聯(lián)合核苷酸藥物 gemcitabine處理的癌細胞，病毒早期轉(zhuǎn)錄單位ElA的表達與其他治療組相比，下降了 1000 倍以上，正常細胞內(nèi)的病毒復(fù)制能力下降更為明顯，ElA表達量幾乎測不出來，安全性得到 了控制。實施例6、病毒SG500_dNKmut與低濃度核苷酸藥物配合在裸鼠體內(nèi)治療腫瘤細胞 移植瘤及對活體內(nèi)對病毒的抑制作用將4-5周齡的裸鼠皮下接種乳腺癌細胞系Bcap37，10天后進行動物分組。治療 組分別瘤體原位注射IX IO9Pfu的病毒SG500-dNKmut、Ad-dNKmut、空載體溶瘤病毒SG500， 同時腹腔注射低濃度藥物ara-T，每天給藥一次；對照組為PBS(緩沖液)處理組、單病毒Ad-blank及SG500處理組，每種處理因素8只裸鼠，每天測量瘤體大小，死亡情況，連續(xù)觀察 兩個月后，剝離瘤體，做免疫組化觀察不同治療方法下E1A表達變化，即對病毒增殖的抑制 作用。實驗結(jié)果如圖6A所示腫瘤生長曲線顯示SG500-dNKmut治療效果最好，治療2個 月后，腫瘤細胞移植瘤基本完全消除，治療效果明顯優(yōu)于溶瘤病毒治療及藥物治療，生存曲 線分析也顯示經(jīng)SG500-dNKmut聯(lián)合gemcitabine治療后的裸鼠存活時間最長。免疫組化 結(jié)果如圖6B，E1A于核內(nèi)表達呈棕色，在SG500、SG500聯(lián)合gemcitabine、SG500_dNKmut聯(lián) 合gemcitabine、分別治療2個月后，可以看出SG500_dNKmut聯(lián)合gemcitabine治療使E1A 弱表達，控制了腺病毒的傳播擴散，起到安全保障作用，而其他處理組均無法抑制病毒增殖 導(dǎo)致E1A強表達，非增殖型病毒Ad-blank感染為陰性對照。參考文獻1. Jemal A, Thun MJ, Ries LAG, Howe HL, Weir HK, Center MM, Ward E, ffu X， EhemanC, Anderson R, Ajani U, Kohler B, Edwards BK. Annual Report to the Nation on theStatus of Cancer,1975—2005, Featuring Trends in Lung Cancer, Tobacco Use and TobaccoControl. Journal of the National Cancer Institute ；Published online Nov. 25,2008 ；Print issue Dec. 2,2008. Vol. 100, No. 23.2. Lefferts JA, Bartels CL, Tsongalis GJ. Molecular oncology :current trendsin diagnostics. Future Oncol. (2008) Feb ；4 (1) :61_70.3. Croce CM. Oncogenes and cancer. N Engl J Med. (2008) Jan 31 ；358 (5) 502-11.4. Reardon, J. E. (1989). Herpes simplex virus type 1 and human DNA polymeraseinteractions with 2' -deoxyguanosine 5' -triphosphate analogues. Kinetics ofincorporation into DNA and induction of inhibition. J Biol Chem,264, 19039-44.5. Freeman, S. M.，Abboud, C. N.，ffhartenby, K. A.，et al. (1993). The" bystandereffect" tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res,53,5274-83.6.Erbs P, Findeli A, Kintz J et al. (2008)Modified vaccinia virus Ankara asa vector for suicide gene therapy. Cancer Gene Ther.15 (1) 18-28.7. Zheng, X. , Johansson, M. & Karlsson, A. (2000) Retroviral transduction ofcancer cell lines with the gene encoding Drosophila melanogaster multisubstr atedeoxyribonucleoside kinase. J Biol Chem,275,39125-9.8. Zheng, X. , Johansson, M. & Karlsson, A. (2001). Bystander effects of cancercell lines transduced with the multisubstrate deoxyribonucleoside kinase ofDrosophila melanogaster and synergistic enhancement by hydroxyurea. Mol Pharmacol,60,262-6.9. ZhenR, X. ， LundberR, M. , Karlsson, A. & Johansson, M. (2003). Lipid-mediatedprotein delivery of suicide nucleoside kinases. Cancer Res,63, 6909-13.
10. Munch-Petersen B，Knecht W，Lenz C，Sondergaard L，Piskur J. (2000). Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase fromDrosophila melanogaster and its C—terminal deletion mutants. J Biol Chem， 275 :6673-9.11. Zheng X，Rao XM, Gomez-Gutierrez JG，Hao H，McMasters KM，Zhou HS. AdenovirusElB55K region is required to enhance cyclin E expression for efficient viral DNAreplication. J Virol. (2008)Jan 30 ； [Epuh ahead of print]PMID 1823479612. Kirn, D. ， Hermiston, T. & McCormick, F. (1998). 0NYX-015 :clinical data areencouraging. Nat Med，4，1341—2.13. Wodarz D，Komarova N(2009) Towards predictive computational models ofoncolytic virus therapy :basis for experimental validation and model selection. PLoSONE. 2009 ；4 (1) :e4271.Epub 2009 Jan 30.14. Haseley A,Alvarez-Breckenridge C,Chaudhury AR，Kaur B (2009). Advances inoncolytic virus therapy for glioma. Recent Pat CNS Drug Discov. 2009 Jan ；4(1) 1-13.15. Tai CK，Kasahara N. (2008) Replication-competent retrovirus vectors forcancer gene therapy. Front Biosci. 13 :3083-95.16. Samp son-Johannes, A.，F(xiàn)attaey，A. & McCormick，F(xiàn). (1996) . An adenovirusmutant that replicates selectively in p53_deficient human tumor cells.Science，274，373_6.17. Zheng X，Rao XM，Snodgrass CL，et al. (2006) Selective replication ofElB55K_deleted adenoviruses depends on enhanced E1A expression in cancer cells. Cancer Gene Ther. Jun ； 13 (6) :572_83.18.Zheng X，Rao XM，Snodgrass CL,et al. (2005). Adenoviral Ela Expression LevelsAffect Virus-Selective Replication in Human Cancer Cells. Cancer Biol Ther. Nov30 ；4 (11) :1255_1262.19. Galanis, E. ， Okuno, S. H. ， Nascimento, A. G. ， et al. (2005). Phase I—II trialof 0NYX-015 in combination with MAP chemotherapy in patients with advanced sarcomas. Gene Ther，12，437—45.
權(quán)利要求
一種腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut，其特征在于，該病毒制劑以E1B55kda基因缺失的5型腺病毒SG500為載體，并攜帶有分子化療基因Dm-dNKmut。
2.權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut的構(gòu)建方法，其 特征在于包括以下步驟A、將分子化療基因Dm-dNKmut克隆進載體質(zhì)粒的多克隆位點，然后用限制性內(nèi)切酶切 除基因表達框，該表達框包含CMV啟動子、分子化療基因Dm-dNKmut、SV40polyA尾巴，插入 腫瘤特異性增殖的腺病毒載體質(zhì)粒PSG500，構(gòu)建成質(zhì)粒pSG500-dNKmut ；B、將得到的質(zhì)粒pSG500-dNKmut與含有腺病毒骨架DNA的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細 胞株，同源重組后擴增，經(jīng)過氯化銫梯度離心提純產(chǎn)生，具有感染性的含有分子化療基因的 病毒制劑 SG500-dNKmut。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut的構(gòu)建方 法，其特征在于所述CMV啟動子也可以用下列特異性啟動子中的一種啟動子代替(1)端粒 酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子；(2)乳腺癌組織特異性啟動子；(3)癌胚抗原啟動子；(4)前列腺特異 性抗原啟動子；(5)甲胎蛋白啟動子。
4.權(quán)利要求1所述的腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut的用途，其特征 在于用于制備治療實體腫瘤藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut的用途，其 特征在于所述的治療實體腫瘤藥物是指腫瘤靶向分子化療基因_病毒制劑SG500-dNKmut 與下列化合物之一組成藥用組合物各種化療藥物、生物毒素、免疫抑制化合物、單克隆抗 體。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤靶向分子化療基因-病毒制劑SG500-dNKmut及構(gòu)建方法和用途，其特點是該病毒制劑以E1B55kda基因缺失的5型腺病毒SG500為載體，并攜帶有分子化療基因Dm-dNKmut。本發(fā)明注射人體后與低濃度核苷酸化療藥配合使用，可對實體腫瘤進行靶向殺傷，并且將安全控制機制引入可復(fù)制增殖的病毒載體，解決了病毒使用安全性問題，有效減低病毒及化療藥物帶來的副作用，是具有分子水平安全控制機制的腫瘤靶向雙重殺傷機制的實體腫瘤分子治療制劑。
文檔編號A61P35/00GK101822844SQ20101015378
公開日2010年9月8日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者徐惠綿, 朱志, 秦光遠, 谷明, 賀安寧, 趙蕾, 鄭新宇, 錢其軍 申請人:鄭新宇