專利名稱：一種治療骨損傷細(xì)胞注射劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療骨損傷注射劑及其制備方法，適用于骨科對(duì)骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死、骨折延遲愈合或不愈合的治療，屬于組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)人均壽命的延長(zhǎng)以及飲食結(jié)構(gòu)的變化、生活水平的日益提高，骨損傷患者也越來越多。目前諸如關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死、骨折延遲愈合或不愈合等最為常見，病發(fā)率每年都是呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，這些疾病給人民群眾的生活帶來了很大的影響，但是從目前的治療的手段來看，效果也都不是很明顯。第一類骨損傷關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性疾病，最常見的是骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩種，我國(guó)目前關(guān)節(jié)炎患者估計(jì)有1億以上，且人數(shù)還在不斷增加，同時(shí)人到老年都患有不同程度的骨關(guān)節(jié)炎。骨性關(guān)節(jié)炎是一種最常見的關(guān)節(jié)病變，骨關(guān)節(jié)炎的名稱極多，如肥大性骨關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、變性性關(guān)節(jié)炎、增生性骨關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)病，均指一種病，國(guó)內(nèi)統(tǒng)一使用骨關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎病發(fā)原因主要有1、組織老化關(guān)節(jié)軟骨退化；2、關(guān)節(jié)受傷導(dǎo)致軟骨損壞；3、過度肥胖使關(guān)節(jié)承受力增加，軟骨隨之發(fā)生缺損；4、工作習(xí)慣引起，如長(zhǎng)期坐姿導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨磨損；5、個(gè)體基因發(fā)生變化引起軟骨病變。其患病率隨著年齡而增加，女性比男性多發(fā)。骨性關(guān)節(jié)炎最常發(fā)病的部位是膝、手指、頸、腰椎等處，癥狀主要為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬(經(jīng)輕微活動(dòng)后會(huì)覺疼痛減輕)，重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、肌肉萎縮等。第二類股骨頭壞死，股骨頭壞死全稱股骨頭無菌性壞死，或股骨頭缺血性壞死，是由于多種原因?qū)е碌墓晒穷^局部血運(yùn)不良，從而引起骨細(xì)胞進(jìn)一步缺血、壞死、骨小梁斷裂、股骨頭塌陷的一種病變。自1888年世界醫(yī)學(xué)界首次認(rèn)識(shí)股骨頭壞死這一疾病至今，股骨頭壞死已由少見病轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟l(fā)病、常見病。尤其是激素的問世及其廣泛應(yīng)用以來，股骨頭壞死的發(fā)病率逐漸上升。加之交通工具變革后交通事故的增多，人們生活方式的改變均使得該病患者數(shù)量劇增。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前全世界股骨頭壞死3000萬人，我國(guó)約有400萬人。股骨頭壞死可發(fā)生于任何年齡但以31-60歲最多，無性別差異，任何年齡均可患病，而有過激素應(yīng)用史、髖部外傷史、酗酒史、相關(guān)疾病史者發(fā)病的機(jī)率明顯增多，開始多表現(xiàn)為髖關(guān)節(jié)或其周圍關(guān)節(jié)的隱痛、鈍痛，活動(dòng)后加重，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)的功能障礙，股骨頭壞死嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和勞動(dòng)能力，若治療不及時(shí)，還可導(dǎo)致終身殘疾。第三類骨折延遲愈合和骨折不愈合。骨折延遲愈合指骨折在預(yù)期的時(shí)間內(nèi)沒有完全愈合。骨折間隙內(nèi)主要充滿著肉芽組織或不成熟的骨組織。如后繼治療恰當(dāng)，骨折仍可能愈合。延遲愈合的病人局部有壓痛和間接叩擊痛，伴不同程度腫脹，局部皮溫可升高。延遲愈合病人局部可呈現(xiàn)異常活動(dòng)，可伴有成角或短縮畸形。骨折不愈合指骨折在預(yù)期的時(shí)間內(nèi)沒有愈合，骨折處的細(xì)胞活動(dòng)及愈合進(jìn)程已完全停止，骨折間隙內(nèi)為致密纖維組織。除非采取干預(yù)措施，否則骨折處將無法連接。治療以上骨損傷目前主要通過(1)非藥物治療；(2)藥物治療；(3)手術(shù)治療；(4) 自體軟骨/成骨細(xì)胞移植等4種方法。非藥物治療、藥物治療和手術(shù)治療的方法均不能從根本上改善軟骨損傷，藥物治療只能短時(shí)間內(nèi)減輕病患者的痛苦，而手術(shù)治療的方法不僅價(jià)格昂貴，多數(shù)病患難以承受，同時(shí)手術(shù)治療給病患帶來的創(chuàng)傷大，另外手術(shù)技術(shù)含量要求較高，一般醫(yī)院因條件不足難以實(shí)施。自體軟骨/成骨細(xì)胞移植對(duì)軟骨損傷能夠起到一定的修復(fù)作用，但是因?yàn)槿榆浌?成骨來自病患自身，這樣就不可避免地對(duì)原有的健康部位造成一定的損傷，同時(shí)骨損傷的病發(fā)原因不僅僅是軟骨/成骨受損，還與骨損傷部位局部微環(huán)境、血供不足等有關(guān)。自體軟骨/成骨細(xì)胞植入術(shù)無法改變?nèi)睋p部位的局部微環(huán)境， 勢(shì)必不能對(duì)損傷部位進(jìn)行根本性的治愈。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上骨損傷治療方法的缺陷，本發(fā)明的目的是提供了一種安全、可靠、有效的治療骨損傷產(chǎn)品。本發(fā)明所選用的種子細(xì)胞來源于患者骨髓，骨髓抽取手術(shù)簡(jiǎn)單快速，一般的臨床醫(yī)生均能夠單獨(dú)操作。抽取一定量的骨髓對(duì)患者自身的影響很小，一般術(shù)后一兩天內(nèi)即可出院恢復(fù)正常工作。本發(fā)明所采用的自體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞為多潛能干細(xì)胞，能夠在體外誘導(dǎo)或者體內(nèi)微環(huán)境的作用下分化為多種類型的細(xì)胞，包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，同時(shí)本發(fā)明在擴(kuò)增骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的過程中，未添加任何動(dòng)物血清，有效的避免了異種病毒的傳染，減小了細(xì)胞移植的風(fēng)險(xiǎn)。骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞在移植到病變部位后，可以分泌大量的細(xì)胞因子如血管生長(zhǎng)因子等，這樣就可以促使病變部位血管再生，進(jìn)而改善病變部位的血液循環(huán)。本發(fā)明利用組織工程技術(shù)將溫敏型凝膠和自體骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞按照 IX IO5 IO8個(gè)細(xì)胞與1 5ml生物材料相結(jié)合形成移植復(fù)合物，同時(shí)在復(fù)合物內(nèi)添加一定量的自體血清營(yíng)養(yǎng)因子，這樣就可以有效的控制病患部位移植細(xì)胞的濃度，并提高了移植細(xì)胞的存活率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用自體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合生物材料組織工程技術(shù)治療骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死、骨折延遲愈合或不愈合等臨床病例，避免了免疫排斥，安全有效。以注射劑的方式回注治療骨損傷部位，手術(shù)時(shí)間短，實(shí)施簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，對(duì)病人造成的痛苦小。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞提取分離、培養(yǎng)與鑒定1.骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞提取分離與培養(yǎng)(1)患者骨髓抽取采用髂前上棘取骨髓術(shù)的方法抽取患者骨髓。常規(guī)消毒、鋪單，一側(cè)或雙側(cè)髂前上棘處局部麻醉后，用骨穿刺針于雙側(cè)髂前上棘穿刺，經(jīng)不同方向用IOml注射器取骨髓。(2)患者血液營(yíng)養(yǎng)因子提取與保存采集骨髓的同時(shí)，收集患者一定量的血液，并于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離其中的營(yíng)養(yǎng)成分 (血小板和血漿)，將分裝完畢的血液營(yíng)養(yǎng)因子置于_20°C冷凍保存，并對(duì)保存信息進(jìn)行實(shí)時(shí)登記。
(3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取分離將新鮮的患者骨髓用DMEM稀釋后，將懸液加于Percoll分離液液面上。20°C， 2500r/min，離心 30min。去上清，吸取白膜層，PBS 洗 2 遍，20°C，1 800r/min，離心 lOmin。 用含10%病患自體血清提取的營(yíng)養(yǎng)成分的DMEM懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)至2X IO5/ ml，接種于75mL培養(yǎng)瓶中。置于C02培養(yǎng)箱中，37°C、飽和濕度、5% C02條件下培養(yǎng)。每隔 3天換液一次。待兩周后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合時(shí)，加入含0. 25% Trypsin-O. 02% EDTA消化液消化，中止消化后反復(fù)吹打細(xì)胞，洗滌后以一定比例分瓶接種，擴(kuò)增細(xì)胞。(4)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)根據(jù)患者的癥狀決定細(xì)胞的需求量，不斷擴(kuò)增細(xì)胞直至達(dá)到手術(shù)需求量。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定將第3、4、5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用0. 25%胰酶消化，PBS洗滌2次，制備106/ml 單細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記的⑶四、⑶90、⑶106、⑶105、⑶44、⑶71、⑶34、⑶45單克隆抗體，置4°C孵育30min，PBS洗滌2遍，加入500 μ IPBS混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立同型IgG對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞⑶四、⑶44、⑶106、⑶71、 ⑶90、⑶105等多種表面抗原陽(yáng)性，而抗原⑶34、⑶45陰性。
具體實(shí)施方式
二 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無外源動(dòng)物血清的培養(yǎng)方法為了有效避免動(dòng)物血清可能存在的病毒對(duì)細(xì)胞造成污染，本發(fā)明在培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過程中，所使用的培養(yǎng)基中的添加物是從患者的血液中分離得到有效的營(yíng)養(yǎng)成分血小板和血漿，并按照一定的比例與低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合制備成完全培養(yǎng)基。
具體實(shí)施方式
三骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與凝膠材料復(fù)合物安全性檢測(cè)收集第三代至第五代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按照IX IO5 IO8個(gè)細(xì)胞與1 5ml 生物凝膠混合形成可注射型復(fù)合物，在其中添加一定量血液提取的生長(zhǎng)因子。按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)細(xì)胞的成活率、菌類、病毒、致瘤性，主要參照的標(biāo)準(zhǔn)有《中國(guó)藥典》2005版第三部附錄XII A第73頁(yè)和《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第12部分細(xì)胞、組織、器官的加工指南》相關(guān)規(guī)定；《中國(guó)藥典》2005版第三部附錄規(guī)定；人的體細(xì)胞治療申報(bào)臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例等。結(jié)果顯示培養(yǎng)擴(kuò)增的第三代到第五代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與凝膠材料結(jié)合形成的復(fù)合物未受到任何微生物及病毒的污染，動(dòng)物致瘤性實(shí)驗(yàn)未觀察到動(dòng)物體表及體內(nèi)器官發(fā)生癌變。具體實(shí)施例方式四骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與凝膠材料復(fù)合物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選取成年雄性Wistar大鼠若干只，利用半月板切除術(shù)誘發(fā)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。 骨關(guān)節(jié)炎大鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(藥物組和安慰劑組)，實(shí)驗(yàn)組利用大鼠同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射劑(方法同本發(fā)明)治療，藥物對(duì)照組和安慰劑對(duì)照組分別使用治療骨關(guān)節(jié)炎藥物和生理鹽水。在治療的第1周、第2周、第4周、第6周、第8周觀察骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)處局部活動(dòng)狀況，并于第4周、第8周解剖，病理切片觀察，結(jié)果表明骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)組在接受細(xì)胞移植后的活動(dòng)狀況明顯好于藥物組，安慰劑組最差。實(shí)驗(yàn)組損傷的骨關(guān)節(jié)處有移植的異體細(xì)胞存在，軟骨恢復(fù)明顯好于藥物組和安慰劑組。具體燒傷例五自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床實(shí)驗(yàn)1.病例選擇根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)選擇病例。優(yōu)先選擇關(guān)節(jié)腫大和關(guān)節(jié)僵硬的病患，所選病例均進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查(血常規(guī)、蛋白電泳、免疫復(fù)合物及血清補(bǔ)體等)和X線檢查(觀察非對(duì)稱性關(guān)節(jié)間隙變化情況及有無關(guān)節(jié)邊緣增生和關(guān)節(jié)積液)。2.治療方法抽取患者骨髓后，提取分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外擴(kuò)增培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞， 同時(shí)按照具體實(shí)施方式
三的方法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和凝膠復(fù)合物進(jìn)行安全性檢測(cè)。根據(jù)病患的癥狀制備一定量的注射劑，手術(shù)實(shí)施前，取20 50μ 1的復(fù)合物對(duì)臨床試驗(yàn)患者進(jìn)行皮試檢測(cè)，觀察有無免疫反應(yīng)出現(xiàn)。經(jīng)皮試后，患者未出項(xiàng)典型的免疫排斥反應(yīng)。骨關(guān)節(jié)炎部位局部消毒麻醉后，注射本發(fā)明注射劑，注射部位為骨關(guān)節(jié)腔。手術(shù)結(jié)束后，冰敷注射部位1小時(shí)，病人留院觀察2 3小時(shí)，注意病人注射部位有無紅腫、疼痛等癥狀發(fā)生。3.效果分析患者接受手術(shù)后的第1周、第4周、第6周、第8周、第M周來院復(fù)診，觀察骨關(guān)節(jié)炎部位癥狀變化情況。并于第8周和第M周對(duì)注射部位進(jìn)行X線觀察。結(jié)果顯示通過本發(fā)明注射劑治療后，患者日常生活逐漸得到恢復(fù)，運(yùn)動(dòng)時(shí)的疼痛感有顯著緩解。通過X線觀察發(fā)現(xiàn)通過自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與凝膠復(fù)合物的治療，不但有效阻止了軟骨缺損的發(fā)展趨勢(shì)，同時(shí)原有軟骨缺損部位也得到了一定程度的修復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種治療骨損傷注射劑及其制備方法，其特征在于取患者自體骨髓，經(jīng)過分離提取、培養(yǎng)擴(kuò)增后得到自體多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合可降解、生物相容性好的溫敏型凝膠材料形成可注射型復(fù)合物，注射部位主要為骨損傷部位，如骨關(guān)節(jié)腔、股骨頭壞死處、骨折未愈合的腔隙處等。
2.如權(quán)利要求書所述治療骨損傷注射劑，其特征在于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于自體，避免了免疫排斥和倫理問題，在其培養(yǎng)過程中利用自體血液有效營(yíng)養(yǎng)成分作為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)添加物，無外源動(dòng)物血清，提高了細(xì)胞移植安全性；自體細(xì)胞植入骨損傷部位后能夠分化為軟骨或成骨細(xì)胞，修復(fù)骨缺損部位；
3.如權(quán)利要求書1所述治療骨損傷注射劑制備的方法，其特征在于1X IO5 IO8個(gè)細(xì)胞與1 5ml生物支架材料混合形成復(fù)合物。
4.如權(quán)利要求書1所述骨損傷注射劑制備的方法，其特征在于生物材料為相容性好、 可降解的溫敏型凝膠支架，主要為泊洛沙姆(poloxamer)凝膠，凝膠一細(xì)胞復(fù)合物內(nèi)添加一定量的來源于自體的血清有效營(yíng)養(yǎng)因子。
5.如權(quán)利要求書1所述的骨損傷注射劑制備的方法，其應(yīng)用范圍為骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死、骨折延遲愈合或骨折不愈合的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種治療骨損傷細(xì)胞注射劑及其制備方法，屬于組織工程領(lǐng)域。該注射劑是由自體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和溫敏型凝膠及自體血液分離提取的有效營(yíng)養(yǎng)因子組成的復(fù)合物。其制備方法是抽取患者骨髓后，分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)的過程中不添加任何動(dòng)物源血清，按照1×105～108個(gè)細(xì)胞與1～5ml生物支架材料混合形成可注射型復(fù)合物。本發(fā)明的主要使用范圍為骨損傷的治療，包括骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死及骨折延遲愈合和不愈合，使用方便，無免疫排斥現(xiàn)象，效果顯著，能緩解病人因骨損傷所帶來的巨大痛苦。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102232970SQ20101015246
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者董運(yùn)海 申請(qǐng)人:董運(yùn)海