專利名稱：：一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物與它們的用途的制作方法一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物與它們的用途
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于一種藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物，還涉及所述組合物的用途。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代社會不斷發(fā)展進(jìn)步，人們的生活節(jié)奏日益加快、工作壓力越來越大，加之工業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的破壞，使得人類免疫系統(tǒng)功能降低，亞健康狀態(tài)日趨嚴(yán)重，它常以疲勞、失眠、胃口差、情緒不穩(wěn)定等為主癥，處于亞健康狀態(tài)的人群約占整個人群的25%-28%。從臨床檢測來看，這個人群體集中地表現(xiàn)出三高一低傾向，即存在著接近臨界水平的高血月旨、高血糖、高血粘度和免疫功能偏低。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展使人們認(rèn)識到免疫系統(tǒng)的紊亂不僅會產(chǎn)生多種疾病，而且與人體衰老與老年人發(fā)病有關(guān)。艾滋病的危害更使人們對免疫缺損的嚴(yán)重后果有了更深刻的認(rèn)識。其中，機(jī)體免疫狀態(tài)失常更是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要因素，免疫功能抑制或紊亂，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)對其的殺傷作用。對于腫瘤傳統(tǒng)的治療方法一般都是應(yīng)用化療及放療將腫瘤組織及細(xì)胞殺滅，但在化療和放療的同時會不可避免地造成機(jī)體免疫功能的抑制，使腫瘤病人的生活質(zhì)量明顯下降。因此，目前迫切需要一種能夠增強(qiáng)人體體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的藥物，改進(jìn)人們的身體健康狀況，增強(qiáng)人體抵抗力，消除一些與免疫功能低下相關(guān)的疾病。竹節(jié)參(rhizomaPanaxjaponicus)又名竹節(jié)三七、竹節(jié)人參、白三七等，系五加科人參屬植物，竹節(jié)參干燥呈竹鞭狀根莖，是我國西南地區(qū)土家族、苗族民族聚居區(qū)民間常用中草藥，為1977年以后各版《中國藥典》所收載。其性甘、微苦，溫，歸肝、脾、肺經(jīng)，功能滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血散瘀、消腫止痛，臨床上主要用于病后虛弱，勞嗽咯血，咳嗽痰多，跌撲損傷等癥。竹節(jié)參的主要活性成分是竹節(jié)參皂苷(chikusetsusaponin)、人參皂苷(ginsenoside)和多糖(polysaccharides)等。此外，還分離出少量的揮發(fā)油、含氮化合物、無機(jī)元素、維生素C、丁二酸等。劉桂林等人在《第八屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會與第五屆全國藥用植物和植物藥學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集》，2005年中公開了采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選竹節(jié)參的提取工藝，優(yōu)選的提取工藝為8倍量60%乙醇回流提取回流2次，每次1.5小時。人參皂苷Rgl在0.5760-1.418μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9997(η=5)，平均回收率為97.7%,RSD=2.94%(η=9)。結(jié)論優(yōu)選后的提取工藝可用于鄂產(chǎn)竹節(jié)參人參皂苷Rgl的提取。黃志萍等人在CN101265301A與CN101265302A公開了一種竹節(jié)參多糖的制備方法，并發(fā)現(xiàn)其在體外能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。本發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)并制備了一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物，它是由有效組分或有效組分與在保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料上可接受的載體組成的，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供所述組合物的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物。所述的組合物是由有效組分或有效組分與在保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料上可接受的載體組成的，其特征在于所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷200-400份竹節(jié)參多糖125-250份所述的有效組分竹節(jié)參皂苷是采用下述方法制備得到的稱取竹節(jié)參粉10重量份，按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為10-14添加50-70體積％乙醇水溶液，浸泡1-3小時，然后進(jìn)行加熱回流提取1-3小時，這樣加熱回流提3-5次，提取液合并，濾過，得到粗竹節(jié)參皂苷提取液；然后，得到的提取液在減壓下去除溶劑，直到無醇味，其殘留物加水稀釋后進(jìn)行離心分離，得到的上清液再按照所述上清液與正丁醇的體積比11使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到的萃取液再減壓蒸去正丁醇，得到粗竹節(jié)參皂苷；以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1-2倍的80-90體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入4-5倍的丙酮，靜置4-6小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在60-80°C下進(jìn)行干燥1-2小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷；所述的有效組分竹節(jié)參多糖是采用下述方法制備得到的稱取竹節(jié)參粉10重量份，然后加入80-120重量份水，在室溫下進(jìn)行提1_3小時，提取完后進(jìn)行過濾，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行2-4次，得到的濾液合并，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/4至1/6，得到濃縮提取液；然后，往所述的濃縮提取液中添加90-100體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到50-體積重量％，在室溫下進(jìn)行醇沉過夜，然后進(jìn)行過濾分離得到竹節(jié)參多糖溶液，再經(jīng)真空噴霧干燥得到所述的竹節(jié)參多糖。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷250-380份竹節(jié)參多糖160-220份。更優(yōu)選地，所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷280-350份竹節(jié)參多糖180-200份。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的竹節(jié)參粉粒度是20-40目。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在制備竹節(jié)參皂苷時，按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為12，添加60體積％乙醇水溶液，浸泡2小時，然后進(jìn)行加熱回流提取2小時，這樣加熱回流提取4次。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，得到的粗竹節(jié)參皂苷以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1倍的85體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入4倍的丙酮，靜置5小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在70°C下進(jìn)行干燥1.5小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在制備竹節(jié)多糖時，稱取竹節(jié)參粉10重量份，加入100重量份水，在室溫下進(jìn)行提取2小時，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行3次，合并濾液，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/5；往得到的濃縮提取液中添加95體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到60體積％。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的減壓是壓力為0.01-0.IOMPa0在本發(fā)明中，所述的組合物是散劑、片劑、膠囊、顆粒劑、口服液和注射劑。本發(fā)明還涉及所述的組合物在制備用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的藥物、保健藥品、保健茶、保健食品、保健酒、飲料等中的用途。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物。所述的組合物是由有效組分或有效組分與在保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料上可接受的載體組成的，其特征在于所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷200-400份竹節(jié)參多糖125-250份。大量研究工作表明，竹節(jié)參的主要活性成分是竹節(jié)參皂苷(chikusetsusaponin)、人參皂苷(ginsenoside)、竹節(jié)參多糖(tochhibanan)及揮發(fā)油部分β檀香萜烯(^santalene)等，還含有多種水溶性氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸。采用本發(fā)明的方法主要提取竹節(jié)參中的竹節(jié)參皂苷和竹節(jié)人參多糖，以竹節(jié)參皂苷和竹節(jié)參多糖作為主要活性成分。一、所述的有效組分竹節(jié)參皂苷可以采用下述方法制備得到Α、稱取竹節(jié)參粉10重量份，按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為10-14添加50-70體積％乙醇水溶液，浸泡1-3小時，然后進(jìn)行加熱回流提取1-3小時，這樣加熱回流提取3-5次，提取液合并，濾過，得到粗竹節(jié)參皂苷提取液。優(yōu)選地，可以按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為12，往竹節(jié)參粉中添加60體積％乙醇水溶液，浸泡2小時，然后進(jìn)行加熱回流提取2小時，這樣加熱回流提取4次。所述的竹節(jié)參例如可以是目前我國市場上銷售的竹節(jié)參中藥材，例如選自湖北省恩施州宣恩椿木營竹節(jié)參種植基地種植的竹節(jié)參，它為五加科植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Meyer的根蓮。然后，使用在本
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中通常使用的超聲波清洗器進(jìn)行清洗，除去泥沙，例如使用昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-250B型超聲波清洗器進(jìn)行清洗。清洗后的竹節(jié)參再使用在本
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中通常使用的真空干燥箱進(jìn)行干燥，例如像德國MMM公司生產(chǎn)的真空干燥箱進(jìn)行干燥。然后，使用在藥材加工中通常使用的粉碎機(jī)對干燥竹節(jié)參的進(jìn)行粉碎，粉碎的竹節(jié)參再用標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩分，收集20-40目的竹節(jié)參粉。得到的竹節(jié)參粉與所述乙醇水溶液進(jìn)行浸泡后，使用在本
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中通常使用的提取器進(jìn)行加熱回流提取，例如使用上海宏興機(jī)械儀器實(shí)業(yè)制造公司生產(chǎn)的電子恒溫不銹鋼水浴鍋與海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司提供的SXT-06型索氏提取器進(jìn)行加熱回流提取。B、得到的提取液在減壓下蒸去溶劑，直到無醇味，其殘留物加水稀釋后進(jìn)行離心分離，得到的上清液再按照所述上清液與正丁醇的體積比11使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到的萃取液再減壓蒸去正丁醇，得到粗竹節(jié)參皂苷。得到的提取液可以使用在本
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中通常使用的減壓蒸發(fā)設(shè)備蒸去溶劑，例如使用上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA在壓力0.01-0.IOMPa進(jìn)行減壓蒸發(fā)，除去乙醇溶劑。使用同樣的設(shè)備將所得到萃取液中的正丁醇蒸去。在這個步驟中進(jìn)行離心分離使用的設(shè)備是在本
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中通常使用的設(shè)備，例如德國SIGMA離心機(jī)。C、得到的粗竹節(jié)參皂苷以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1-2倍的80-90體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入45倍的丙酮，靜置46小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在60-80°C下進(jìn)行干燥12小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷。優(yōu)選地，得到的粗竹節(jié)參皂苷以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1倍的85體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入4倍的丙酮，靜置5小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在70°C下進(jìn)行干燥1.5小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷。在這個步驟中，進(jìn)行離心、干燥操作所使用的設(shè)備與上述設(shè)備相同。二、所述的有效組分竹節(jié)參多糖是采用下述方法制備得到的A、稱取竹節(jié)參粉10重量份，然后加入80-120重量份水，在室溫下進(jìn)行提取13小時，提取完后進(jìn)行過濾，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行24次，得到的濾液合并，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/4至1/6，得到濃縮提取液。優(yōu)選地，在制備竹節(jié)多糖時，稱取竹節(jié)參粉10重量份，加入100重量份水，在室溫下進(jìn)行提取2小時，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行3次，合并濾液，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/5。使用的竹節(jié)參粉是采用與前面描述的相同方法得到的。在這個步驟中，進(jìn)行提取、減壓濃縮操作所使用的設(shè)備與上述設(shè)備相同。B、然后，往所述的濃縮提取液中添加90-100體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到50-70體積％，在室溫下進(jìn)行醇沉過夜，然后進(jìn)行過濾分離得到竹節(jié)參多糖溶液，再經(jīng)真空噴霧干燥得到所述的竹節(jié)參多糖。在本發(fā)明的意義上，醇沉就是利用有效組分能溶于乙醇而雜質(zhì)不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效組分轉(zhuǎn)溶于乙醇中而雜質(zhì)則被沉淀出來。醇沉的目的是為了除去雜質(zhì)保留藥物有效組分，因而醇沉操作應(yīng)該是十分重要的。優(yōu)選地，往得到的濃縮提取液中添加95體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到60體積％，在室溫下進(jìn)行醇沉過夜。所述的真空噴霧干燥可以使用在本
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中通常使用的真空噴霧干燥設(shè)備進(jìn)行干燥，例如使用像上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司提供的SY-6000小型噴霧干燥儀進(jìn)行干燥。在本發(fā)明中，竹節(jié)參及其提取物的總皂苷測定方法如下樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備樣品溶液的制備精確稱取20-40目竹節(jié)參藥材粉末l.Og，置索氏提取器中，力口200mL乙醚，加熱回流lh，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚，置于索氏提取器中，再加200mL甲醇，加熱提取至甲醇無色，取出甲醇提取液，讓其揮發(fā)至干，其殘?jiān)?0mL蒸餾水分多次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用蒸餾水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的蒸餾水洗滌2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，蒸干，得到的殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到樣品溶液。標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備精確稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)樣品適量，置IOmL量瓶中，用甲醇溶解制成每ImL含1.30mg的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。線性關(guān)系的考察分別精密吸取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液30、50、70、90、110、130μL，置于IOmL具塞試管中，用水浴使溶劑揮發(fā)，分別精確加入0.2mL新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液，0.SmL高氯酸溶液，加塞，搖勻，于60°C水浴加熱15min，取出，置冰水中冷卻3min，分別精確加入5mL冰醋酸，搖勻，隨行試劑作空白，于552nm處測定吸光度，以吸光度㈧對人參皂苷Re質(zhì)量濃度(C，μg'IiiL-I)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程=A=0.0194C-0.0059，r=0.9997，該結(jié)果表明人參皂苷Re在6.50μg·mL-128.17μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見附圖1。如前面所述制備樣品溶液，精密吸取40μL該樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，于552nm處測定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線給出樣品溶液相當(dāng)于人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的濃度，根據(jù)回歸方程，計(jì)算樣品中總皂苷的含量。在本發(fā)明中，竹節(jié)參及其提取物的多糖測定方法如下5%苯酚的配制稱取苯酚100g，加0.Ig鋁片和0.05g碳酸氫鈉，進(jìn)行常壓蒸餾，收集180士2°C餾分。精確稱取約10.Og該餾分，置于200mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，4°C保存?zhèn)溆?。葡萄糖對照溶液的配制精確稱取50mg減壓真空干燥至恒重的葡萄糖，溶于在50mL容量瓶中的蒸餾水中，精確移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.OmL，加到25mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得到一組葡萄糖對照溶液。竹節(jié)參多糖測試液的制備精確稱取Ig20-40目竹節(jié)參粉末，置圓底燒瓶中，加入50mL80重量％乙醇水溶液，加熱回流3次，每次2h，棄濾液，沉淀進(jìn)行揮發(fā)至干，加50mL蒸餾水，稱重，靜置lh，加熱回流2h，放冷，稱重，用蒸餾水補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，濾液備用。竹節(jié)參多糖最大吸收波長的選擇吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、竹節(jié)參多糖測試液各ImL至具塞試管中，加入2.OmL苯酚，迅速加入7.OmL濃硫酸，混勻，置40°C水浴中30min，在冰浴中冷卻lOmin。以試劑空白為參比，在200IlOOnm波長范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長為478nm。掃描結(jié)果見附圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確量取葡萄糖與測試溶液各lmL，測定吸光度，得到在每ImL含葡萄糖40160μg范圍內(nèi)葡萄糖量與吸收度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=O.0051X-0.0341，r=0.9953。根據(jù)回歸方程，計(jì)算樣品中竹節(jié)參多糖的含量。在本發(fā)明中，在保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料上可接受的載體應(yīng)該理解是指在藥學(xué)、食品、酒或飲料
技術(shù)領(lǐng)域：
中通常使用的載體，例如像稀釋劑、賦形劑和水等，填充劑，例如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纖維素等；粘合劑，例如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；潤濕劑，例如甘油；崩解劑，例如羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物；表面活性劑，例如十六烷醇、十二烷基硫酸鈉；吸附載體，例如高齡土和皂粘土；潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。在本發(fā)明中，所述組合物的劑型是散劑、片劑、膠囊、顆粒劑、口服液和注射劑。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷250-380份竹節(jié)參多糖160-220份。更優(yōu)選地，所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷280-350份竹節(jié)參多糖180-200份。本發(fā)明還涉及所述的組合物在制備用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料中的用途。在本發(fā)明中，應(yīng)該注意到，使用作為保健藥品的本發(fā)明組合物的劑量需要由醫(yī)生根據(jù)病人的體重、身體狀況與疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行確定。但每個病人一般使用劑量是每個病人每天每千克體重100-400mg/天.kg。本發(fā)明的組合物可以通過口服或腸胃外給藥的方式為需要這種治療的患者給藥。采用口服方式給藥時，可將本發(fā)明的組合物制成常規(guī)的固體制劑，例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑等，制成液體制劑，例如水或油懸浮劑，其它液體制劑，例如糖漿、口服液等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、粉針、水或油性懸浮劑等。在制備用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的保健食品、保健茶、保健酒或飲料時，可以在制作保健食品、保健茶、保健酒或飲料的過程中，將本發(fā)明的組合物作為一種添加劑加到其制作原料中，或者在飲茶、酒或飲料時把本發(fā)明的組合物加到茶、酒或飲料中，這時每個人一般使用劑量是每個人每天每千克體重50-100mg/天.kg。[有益效果]本發(fā)明含有竹節(jié)參皂苷和多糖的組合物能明顯改善環(huán)磷酰胺引起免疫低下小鼠的脾萎縮，顯著提高脾臟指數(shù)，提高⑶4+、⑶8+，B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞比例；增加細(xì)胞因子IL-2和IFN-Y含量；并且本發(fā)明組合物的效果非常明顯地優(yōu)于單一活性成分竹節(jié)參皂苷或單一活性成分竹節(jié)參多糖的效果。該組合物可以大大提高竹節(jié)參的藥物效果和藥用價(jià)值。圖1是竹節(jié)參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是多糖吸收曲線樣品1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，樣品2為測試樣品。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明顆粒劑的制備制備所述的有效組分竹節(jié)參皂苷選用湖北省恩施州宣恩椿木營竹節(jié)參種植基地種植的竹節(jié)參，使用昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-250B型超聲波清洗器進(jìn)行清洗，清洗后的竹節(jié)參再使用德國MMM公司生產(chǎn)的真空干燥箱進(jìn)行干燥，然后進(jìn)行粉碎，用標(biāo)準(zhǔn)篩進(jìn)行篩分，收集20-40目的竹節(jié)參粉。稱取竹節(jié)參粉10重量份，按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為12添加60體積％乙醇水溶液，浸泡2小時，然后使用上海宏興機(jī)械儀器實(shí)業(yè)制造公司生產(chǎn)的電子恒溫不銹鋼水浴鍋與海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司提供的SXT-06型索氏提取器進(jìn)行加熱回流提取2小時，這樣加熱回流提取4次，提取液合并，濾過，得到粗竹節(jié)參皂苷提取液。得到的提取液使用上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA在壓力0.05MPa進(jìn)行減壓蒸發(fā)，除去乙醇溶劑，其殘留物加水稀釋后使用北德國SIGMA離心機(jī)進(jìn)行離心分離，得到的上清液再按照所述上清液與正丁醇的體積比11使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到的萃取液再使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA減壓蒸去正丁醇，得到粗竹節(jié)參皂苷。得到的粗竹節(jié)參皂苷以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1倍的85體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入4倍的丙酮，靜置5小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在70°C下進(jìn)行干燥1.5小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷。采用本發(fā)明說明書中描述的竹節(jié)參皂苷測定方法測定了在所得到竹節(jié)參皂苷中的皂苷含量，其結(jié)果是以所得到竹節(jié)參皂苷總重量計(jì)為96.8重量％。制備所述的有效組分竹節(jié)參多糖稱取前面步驟得到的竹節(jié)參粉10重量份，然后加入100重量份水，在室溫下進(jìn)行提取2小時，提取完后進(jìn)行過濾，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行3次，得到的濾液合并，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/5，得到濃縮提取液。在這個步驟中，進(jìn)行提取、減壓濃縮操作所使用的設(shè)備與上述設(shè)備相同。然后，往所述的濃縮提取液中添加95體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到60體積％，在室溫下進(jìn)行醇沉過夜，然后進(jìn)行過濾分離得到竹節(jié)參多糖溶液，再使用上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司提供的SY-6000小型噴霧干燥儀進(jìn)行真空噴霧干燥，于是得到所述的竹節(jié)參多糖。采用本發(fā)明說明書中描述的竹節(jié)參多糖測定方法測定了在所得到竹節(jié)參多糖中的多糖含量，其結(jié)果是以所得到竹節(jié)參多糖總重量計(jì)為98.6重量％。使用本實(shí)施例制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖按照下述配方采用通常顆粒劑的制備方法制備顆粒劑竹節(jié)參皂苷200mg竹節(jié)參多糖125mg，淀粉20mg聚乙烯吡咯烷酮5mg實(shí)施例2本發(fā)明片劑的制備按照與實(shí)施例1相同方式制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖。使用本實(shí)施例制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖按照下述配方采用通常片劑制備方法制備片劑竹節(jié)參皂苷300mg竹節(jié)參多糖145mg，乳糖20mg聚乙烯吡咯烷酮5mg羥丙纖維素5mg實(shí)施例3本發(fā)明膠囊劑的制備按照與實(shí)施例1相同方式制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖。使用本實(shí)施例制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖按照下述配方采用通常膠囊劑制備方法制備膠囊劑竹節(jié)參皂苷380mg竹節(jié)參多糖245mg，蔗糖IOmg甘油50mg實(shí)施例4本發(fā)明口服的制備按照與實(shí)施例1相同方式制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖。使用本實(shí)施例制備竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖按照下述配方采用通?？诜褐苽浞椒ㄖ苽淇诜褐窆?jié)參皂苷350mg竹節(jié)參多糖188mg，蔗糖IOmg甘油50mg下面通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明組合物的功效。試驗(yàn)例1竹節(jié)參皂苷多糖組合物對免疫低下小鼠免疫器官重量的影響材料與方法Balb/e小鼠，體重18_22g，雌雄各半，由湖北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號SCXK(鄂2008-0005)給藥期間，每只小鼠按規(guī)定給予定量飼料，自由飲水，每日記錄小鼠體重，觀察小鼠體重及毛色變化。取Balb/c小鼠(1822g)，72只，隨即分9組，每組各8只。分為正常組蒸餾水；香菇多糖組香菇多糖(100mg/kg)；模型組環(huán)磷酰胺(30mg/kg)；實(shí)驗(yàn)組竹節(jié)參皂苷組(200mg/kg、400mg/kg)兩個劑量組；竹節(jié)參多糖(125mg/kg、250mg/kg)；皂苷多糖組合物(皂苷200mg/kg+多糖125mg/kg、皂苷400mg/kg+多糖250mg/kg)。灌胃給藥，連續(xù)18d，正常組及模型組給予相應(yīng)體積的蒸餾水。d3除正常組外腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg(正常組給予等容量生理鹽水)，隔天注射，共注射4次，制備免疫功能低下的動物模型。每天記錄小鼠體重。未次給藥后，小鼠頸椎脫臼處死，取脾并稱濕重，計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=小鼠脾重/體重(mg.g—1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果Cy免疫抑制組小鼠脾臟器指數(shù)比正常組降低，說明Cy可以降低脾的重量；香菇多糖組脾臟的重量得到一定恢復(fù)，說明陽性藥對免疫低下小鼠的脾臟有保護(hù)作用；竹節(jié)參皂苷和多糖組均提高脾指數(shù)，均可提高脾臟的指數(shù)。竹節(jié)參皂苷多糖組合物使脾臟指數(shù)恢復(fù)到正常水平，見表1。表1小鼠脾臟指數(shù)表(；士s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>ΔΔΡ<0.Olvs正常組；*Ρ<0.05，**Ρ<0.Olvs模型組▲前一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的竹節(jié)參皂苷，后一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的多糖。試驗(yàn)例2竹節(jié)參皂苷多糖組合物對免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響材料與方法Balb/c小鼠分組及給藥方式同上，末次灌胃給藥24h后，眼球取血，每個樣品加入50U·ml-1的肝素抗凝，分別加入FITC標(biāo)記的CD3+和PE+標(biāo)記的CD4+抗體各5μL(檢測CD4.亞群T細(xì)胞)，或者加入FITC標(biāo)記的CD3+和PE標(biāo)記的CD8.抗體各5μL(檢測CD8.亞群T細(xì)胞)，或者加入PE標(biāo)記的⑶49b+抗體5μL(檢測NK細(xì)胞)，或者加入PE標(biāo)記的⑶19+抗體5μL(檢測B細(xì)胞)，?；靹?，40C孵育30min，然后把試管放入Q-PreP標(biāo)本制備儀上自動把標(biāo)本溶血，加入固定液；1500r/min離心5min，棄上清，清洗2次，加入600μIPBS振蕩混勻，避光保存于4°C冰箱待上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀測定⑶4+、⑶8+T細(xì)胞比例(AntiCD3/FITC,AntiCD4/PE,AntiCD8/PE,AntiCD49b/PE，AntiCD19/PE，美國，e-bioscience公司)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果Cy模型組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群紊亂，⑶4+、⑶8+細(xì)胞百分比遠(yuǎn)低于正常組；香菇多糖組可明顯提高⑶4+和⑶8+細(xì)胞百分比；竹節(jié)參皂苷和多糖的高劑量組均可提高⑶4+和⑶8+百分比，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；竹節(jié)參皂苷多糖組合物同時提高⑶4+及⑶8+百分比，調(diào)節(jié)T細(xì)胞各亞群的比例，恢復(fù)到接近正常小鼠免疫水平，且作用優(yōu)于單獨(dú)用藥組，見表2。表2小鼠外周血T淋巴細(xì)-胞比例分布表(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>)分組劑量CD3+%CD4+%CD8+%(mg-kg"1)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>正常組-78.42士2.6057.69±1.6819.64±1.79模型組-52.89±3.96δδ42.66±3.28δδ9.94±1.95δδ香菇多糖10075.88±6.09'‘55.72±2.92_*16.69±1.02··皂苷低劑量組20064.72±2.7747.42±0.6813.08±3.72皂苷高劑量組40069.55士2.48*53.18±2.09'*15.55±3.19**多糖低劑量組12564.93士2.1048.02士2.8113.80±2.44多糖高劑量組25072.11±1.40"52.94±1.77"17·76±3·37·‘本發(fā)明組合物低劑量組200+125475.12±5.20'*56.92±5.60'*19.92±1.59'*本發(fā)明組合物高劑量組400+250Α78.25±8.14··57.13±4.84**22·08±3·18"ΔΔΡ<0.Olvs正常組；*P<0.05，**Ρ<0.Olvs模型組▲前一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的竹節(jié)參皂苷，后一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的多糖。試驗(yàn)例3竹節(jié)參皂苷多糖組合物對免疫低下小鼠B淋巴細(xì)胞的影響材料與方法Balb/c小鼠分組及給藥方式同上，末次灌胃給藥24h后，眼球取血，每個樣品加入50U·πι1-1的肝素抗凝，分別加入FITC標(biāo)記的⑶3+和PE標(biāo)記的⑶4+抗體各5μL(檢測⑶4亞群T細(xì)胞)，或者加入FITC標(biāo)記的⑶3+和PE標(biāo)記的⑶8+抗體各5μL(檢測⑶8+亞群T細(xì)胞)，或者加入PE標(biāo)記的⑶49b+抗體5μL(檢測NK細(xì)胞)，或者加入PE標(biāo)記的⑶19+抗體5μL(檢測B細(xì)胞)，混勻，40C孵育30min，然后把試管放入Q-PreP標(biāo)本制備儀上自動把標(biāo)本溶血，加入固定液；1500r/min離心5min，棄上清，清洗2次，加入600μIPBS振蕩混勻，避光保存于4°C冰箱待上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀測定B細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組比較，Cy組小鼠B細(xì)胞數(shù)明顯降低；與正常組比較，陽性藥香菇多糖組B細(xì)胞水平明顯提高；竹節(jié)參皂苷和多糖的高劑量組對Cy致免疫低下小鼠B細(xì)胞數(shù)均有顯著性提高；組合物低、高劑量組均顯著提高B細(xì)胞數(shù)，接近正常水平，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示竹節(jié)參皂苷和多糖聯(lián)用對小鼠體液免疫反應(yīng)有促進(jìn)作用，并有一定的協(xié)同作用，且作用優(yōu)于單獨(dú)用藥組，見表3。表3小鼠外周血B細(xì)胞比例表(；土s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ΔΔΡ<0.Olvs正常組；*Ρ<0.05，**Ρ<0.Olvs模型組▲前一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的竹節(jié)參皂苷，后一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的多糖。試驗(yàn)例4竹節(jié)參皂苷多糖組合物對免疫低下小鼠NK淋巴細(xì)胞的影響材料與方法Balb/c小鼠分組及給藥方式同上，末次灌胃給藥24h后，眼球取血，每個樣品加入50U·πι1-1的肝素抗凝，分別加入FITC標(biāo)記的⑶3+和PE標(biāo)記的⑶49b+抗體5μL(檢測NK細(xì)胞)，混勻，4°C孵育30min，然后把試管放入Q-PreP標(biāo)本制備儀上自動把標(biāo)本溶血，加入固定液；1500r/min離心5min，棄上清，清洗2次，加入600μIPBS振蕩混勻，避光保存于4°C冰箱待上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀測定NK細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組比較，Cy模型組小鼠NK細(xì)胞顯著下降，陽性藥組NK細(xì)胞顯著性增高，超過正常組；竹節(jié)參皂苷和多糖組中，只有竹節(jié)參多糖低劑量組有提高NK細(xì)胞數(shù)的作用，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；皂苷多糖組合物兩個劑量組均可明顯提高NK細(xì)胞數(shù)，使之恢復(fù)正常，甚至更高。提示竹節(jié)參皂苷多糖組合物可促進(jìn)非特異性免疫作用，且作用優(yōu)于單獨(dú)用藥，見表4。表4小鼠外周血NK細(xì)胞此例表(X±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>ΔΔΡ<0.Olvs正常組；*Ρ<0.05，**Ρ<0.Olvs模型組▲前一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的竹節(jié)參皂苷，后一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的多糖。試驗(yàn)例5竹節(jié)參皂苷多糖組合物對免疫低下小鼠IL-2水平的影響材料與方法Balb/c小鼠分組及給藥方式同上，小鼠末次給藥后，摘小鼠眼球取血，分離血清，采用ELIAS法，按試劑盒操作說明進(jìn)行(白細(xì)胞介素2酶免試劑盒及IFN-Y試劑盒，美國，Rndsystems公司)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組比較，Cy組小鼠IL-2含量明顯降低；陽性藥香菇多糖組IFN有明顯提高；竹節(jié)參皂苷和多糖組對Cy致免疫低下小鼠IL-2含量均具有提高作用，并呈一定的量效關(guān)系；竹節(jié)參皂苷多糖組合物均可明顯提高IL-2含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示竹節(jié)參皂苷多糖組合物可以顯著提高免疫低下小鼠的IL-2含量，效果優(yōu)于皂苷和多糖單獨(dú)使用組。見表5表5小鼠血清白介素2表達(dá)水平表(；±Sjn=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>ΔΔΡ<0.Olvs正常組；*P<0.05，**Ρ<0.Olvs模型組▲前一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的竹節(jié)參皂苷，后一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的多糖。實(shí)驗(yàn)例6竹節(jié)參皂苷多糖組合物對免疫低下小鼠IFN-γ水平的影響材料與方法Balb/c小鼠分組及給藥方式同上，小鼠末次給藥后，摘小鼠眼球取血，分離血清，采用ELIAS法，按試劑盒操作說明進(jìn)行(白細(xì)胞介素2酶免試劑盒及IFN-Y試劑盒，美國，Rndsystems公司)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組比較，Cy組小鼠IFN-Y含量明顯降低；陽性藥香菇多糖組IFN有明顯提高；竹節(jié)參皂苷和多糖組對Cy致免疫低下小鼠IFN-Y含量均具有提高作用，并呈一定的量效關(guān)系；竹節(jié)參皂苷多糖組合物均可明顯提高IFN-Y含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示竹節(jié)參皂苷多糖組合物可以顯著提高免疫低下小鼠的IFN-Y含量，效果優(yōu)于皂苷和多糖單獨(dú)使用組，見表6。表6小鼠血清、干擾素表達(dá)水平表(±sn=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ΔΔΡ<0.Olvs正常組；*P<0.05，**Ρ<0.Olvs模型組▲前一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的竹節(jié)參皂苷，后一個數(shù)據(jù)為實(shí)施例1制備的多糖。權(quán)利要求一種用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物，它是由有效組分或有效組分與在保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料上可接受的載體組成的，其特征在于所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷200-400份竹節(jié)參多糖125-250份所述的有效組分竹節(jié)參皂苷是采用下述方法制備得到的稱取竹節(jié)參粉10重量份，按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為10-14添加50-70體積％乙醇水溶液，浸泡1-3小時，然后進(jìn)行加熱回流提取1-3小時，這樣加熱回流提3-5次，提取液合并，濾過，得到粗竹節(jié)參皂苷提取液；然后，得到的提取液在減壓下去除溶劑，直到無醇味，其殘留物加水稀釋后進(jìn)行離心分離，得到的上清液再按照所述上清液與正丁醇的體積比1∶1使用正丁醇進(jìn)行萃取，得到的萃取液再減壓去除正丁醇，得到粗竹節(jié)參皂苷；以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1-2倍的80-90體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入4-5倍的丙酮，靜置4-6小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在60-80℃下進(jìn)行干燥1-2小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷；所述的有效組分竹節(jié)參多糖是采用下述方法制備得到的稱取竹節(jié)參粉10重量份，然后加入80-120重量份水，在室溫下進(jìn)行提取1-3小時，提取完后進(jìn)行過濾，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行2-4次，得到的濾液合并，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/4至1/6，得到濃縮提取液；然后，往所述的濃縮提取液中添加90-100體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到50-70體積％，在室溫下進(jìn)行醇沉過夜，然后進(jìn)行過濾分離得到竹節(jié)參多糖溶液，再經(jīng)真空或噴霧干燥得到所述的竹節(jié)參多糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷250-380份竹節(jié)參多糖160-220份。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述的有效組分是，以重量份計(jì)竹節(jié)參皂苷280-350份竹節(jié)參多糖180-200份。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述的竹節(jié)參粉粒度是20-40目。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于在制備竹節(jié)參皂苷時，按照竹節(jié)參粉與乙醇水溶液重量體積比為12添加60體積％乙醇水溶液，浸泡2小時，然后進(jìn)行加熱回流提取2小時，這樣加熱回流提取4次。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于得到的粗竹節(jié)參皂苷以所述的粗竹節(jié)參皂苷重量計(jì)使用1倍的85體積％乙醇水溶液進(jìn)行溶解，再加入4倍的丙酮，靜置5小時，然后離心分離，收集沉淀物，用丙酮洗滌，再在70°C下進(jìn)行干燥1.5小時，得到所述的竹節(jié)參皂苷。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于在制備竹節(jié)多糖時，稱取竹節(jié)參粉10重量份，加入100重量份水，在室溫下進(jìn)行提取2小時，這個提取過程重復(fù)進(jìn)行3次，合并濾液，再減壓濃縮至所述合并濾液體積的1/5；往得到的濃縮提取液中添加95體積％乙醇水溶液，使所述濃縮提取液中最終乙醇濃度達(dá)到60體積％。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述的減壓是壓力為0.01-0.lOMPa。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于所述的組合物是散劑、片劑、膠囊、顆粒劑、口服液或注射劑。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物在制備用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的保健藥物、保健食品、保健茶、保健酒或飲料中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)人體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的組合物及其用途。本發(fā)明組合物是由有效組分竹節(jié)參皂苷與竹節(jié)參多糖或所述有效組分與在保健藥品、保健食品、保健茶、保健酒或飲料上可接受的載體組成的，本發(fā)明組合物具備改善免疫低下小鼠免疫功能的作用。本發(fā)明的組合物在環(huán)磷酰胺(Cy)導(dǎo)致的免疫功能低下的動物模型中，可提高免疫低下小鼠的脾臟指數(shù)；提高CD4+、CD8+，B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞比例；增加細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量。該組合物提高了竹節(jié)參的藥物效果和藥用價(jià)值，由此可促進(jìn)藥材種植和藥物研發(fā)，有較好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號A61K31/715GK101829138SQ201010130849公開日2010年9月15日申請日期2010年3月18日優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日發(fā)明者何毓敏,周志勇,姜美杰,孫志偉,張長城,曾曉,李守超,王洪武,羅春華,胡遠(yuǎn)浪,袁丁,趙海霞申請人:三峽大學(xué)