專利名稱：以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架及其制備方法，屬于醫(yī)
學(xué)組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織工程是20世紀(jì)80年代提出的新型交叉學(xué)科，它主要是利用生物科學(xué)和工程 學(xué)原理，開發(fā)用于修復(fù)、重建和維持受損組織和器官結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)。組織工程的研究 主要集中在三維支架的構(gòu)建和種子細(xì)胞選擇領(lǐng)域。理想的組織工程支架應(yīng)具有以下特點 (1)良好的生物相容性，表面微結(jié)構(gòu)和生物特性有利于種子細(xì)胞的黏附與增殖；(2)適當(dāng) 的機械性能，符合替代部位組織器官的力學(xué)性能；(3)特定的生物可降解性，生物材料的降 解速率必須與種子細(xì)胞合成細(xì)胞基質(zhì)的速率相互匹配；(4)類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)的三維 結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，有利于種子生長和分泌細(xì)胞外基質(zhì)；(5)生物材料及其降解產(chǎn)物在體 內(nèi)不引起炎癥反應(yīng)和產(chǎn)生毒副作用，從而保證組織工程器官構(gòu)建成功。目前應(yīng)用于構(gòu)建組 織工程支架的可降解生物材料主要有兩類，即天然生物材料和人工合成的高分子材料。天 然材料一般都具有清水、生物相容性及細(xì)胞親和性好的特點，但缺點是力學(xué)性能差、降解速 度快、加工性能差。人工合成的高分子材料不僅具有良好的物理機械性能，而且易于加工， 比較容易地進(jìn)行批量生產(chǎn)并且可以根據(jù)特殊用途改變其特點，可通過改變工藝調(diào)節(jié)降解速 度；但人工合成材料多為疏水性，不利于種子細(xì)胞的黏附與增殖。因此將兩者混合，理論上 就克服了兩者的不足，構(gòu)建的組織工程支架具有良好的應(yīng)用前景。 纖維蛋白原是參與凝血過程后期階段的一個血漿糖蛋白。在凝血過程中，纖維蛋 白原在凝血酶的作用下水解轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，最終形成血凝塊。纖維蛋白原不僅參與凝血 功能，其在創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤生長過程中也發(fā)揮了作用，近年來作為組織工程支架的優(yōu)勢逐 漸引起人們的重視。纖維蛋白原來源廣泛，不僅可以從自身獲得，而且可以從哺乳動物身上 獲得。目前纖維蛋白原主要是以膠體形式(纖維蛋白膠)在促進(jìn)傷口愈合、封閉組織缺損、 防止組織粘連等方面獲得廣泛應(yīng)用，并且已顯示其有良好的組織相容性。在組織工程中，纖 維蛋白原是一種生物活性材料，可作為細(xì)胞生長的支架材料，其主要采用其膠體形式應(yīng)用 于組織工程支架，但以純纖維蛋白膠構(gòu)建的組織工程支架還缺乏足夠的機械強度，在體內(nèi) 還不能夠抵抗生理性的動態(tài)環(huán)境，難以滿足組織工程支架的需求；而且以纖維蛋白膠構(gòu)建 組織工程支架多需要種子細(xì)胞與纖維蛋白原混合后再形成纖維蛋白膠，不利與支架的消毒 與大規(guī)模應(yīng)用。 合成材料，如聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸/聚己內(nèi)酯等，憑借其良好的力學(xué)性能、
組織相容性、可控的生物降解性和易加工成型性能在組織工程中得到了廣泛的應(yīng)用。但是
這些合成材料缺乏生物活性。將這些具有合成材料與具有生物活性的纖維蛋白原復(fù)合是構(gòu)
建具有良好生物活性、適宜機械強度組織工程支架的一條行之有效的途徑。 天然細(xì)胞外基質(zhì)呈納米級構(gòu)造，利用不同納米技術(shù)構(gòu)建組織工程器官是組織工程
發(fā)展的新趨勢。為構(gòu)建與細(xì)胞外基質(zhì)相類似的納米三維結(jié)構(gòu)，已有研究者采用了不同的實驗方法。如分子自組裝技術(shù)，相分離技術(shù)及靜電紡絲技術(shù)。其中，靜電紡絲技術(shù)制備的無 紡纖維膜具有高比表面積、高孔隙率、孔隙相連性好等特點，與正常組織細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu) 非常類似，有利于細(xì)胞的黏附吸附和生長。而且，靜電紡絲具有使用簡便快捷、成本低廉、結(jié) 構(gòu)可控等優(yōu)點?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中未見以靜電紡絲方式生產(chǎn)以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米 支架的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三維多孔納米支架及其制備方法，所述支架具有良好的
生物活性，適宜的機械強度，可控的降解速率，可用來替代各種原因造成的彈性組織缺失。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架，
其特征在于，由纖維蛋白原以及聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物制成。 所述纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為1 : 5 12 : 5。 所述聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物中聚乳酸與聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比為5 : 5 8 : 2。 所述聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的分子量為5萬 30萬。 本發(fā)明還提供了上述以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架的制備方法，其特 征在于，具體步驟為 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基
混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 120mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物溶解在六氟異丙醇、三氯甲烷、二甲基甲酰
胺、四氫呋喃和丙酮中的一種或兩種以上的混合溶劑中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 10%的聚乳酸
/聚己內(nèi)酯原液； 第三步將纖維蛋白原液與聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液混勻后加入靜電紡絲機的同一 容量管中進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為0. 5 3kv/紡絲距離cm，紡絲液推進(jìn)速度0. 5 4ml/ h，在接收裝置上得到膜狀或管狀的三維多孔納米支架； 或者，將纖維蛋白原液和聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液分別加入到靜電紡絲機上兩不同 的容量管中，將兩容量管中的不同原液同時進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為0. 5 3kv/紡絲距 離cm，紡絲液推進(jìn)速度0. 5 4ml/h，在接收裝置上得到膜狀或管狀的三維多孔納米支架；
第四步將三維多孔納米支架真空干燥以除去支架中的殘留有機溶劑，以環(huán)氧乙 烷或Y射線消毒。 本發(fā)明技術(shù)方案中，根據(jù)目的組織工程支架所需的力學(xué)強度和降解速度，可通過
選用不同質(zhì)量比的聚乳酸/聚己內(nèi)酯聚合物，以及通過改變纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)
酯兩種材料的濃度和組成比例來獲得適宜的機械強度和降解速度，同時具有良好的生物學(xué)
性能。纖維蛋白原可來自于人、哺乳動物(如牛、豬)，纖維蛋白原經(jīng)提取凍干后呈粉末狀。本發(fā)明所構(gòu)建的三維多孔納米支架的纖維直徑為200-800nm，孔隙率為65_85% 。 與現(xiàn)有構(gòu)建的組織工程支架相比，本發(fā)明具有以下顯著的有益效果 1.本發(fā)明所構(gòu)建的組織工程支架具有與細(xì)胞外基質(zhì)相類似的納米纖維結(jié)構(gòu)，并具
有良好的比表面積、高孔隙率、空隙相連性好等特點，有利于種子細(xì)胞的生長與遷移，易于
種子細(xì)胞的代謝交換。 2.本發(fā)明構(gòu)建的組織工程支架具有良好的生物活性，能為種子細(xì)胞提供良好的生活壞境，有利于種子細(xì)胞的粘附、增殖和分化，易于種子細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終完好替 代缺損組織。 3.本發(fā)明構(gòu)建的組織工程支架具有良好的機械強度和彈性，能夠滿足作為各種彈 性組織支架的力學(xué)要求。并可通過改變原材料的濃度以及混合比例來調(diào)整組織工程的力學(xué) 性能，從而滿足不同彈性組織各種不同的力學(xué)性能要求。 4.本發(fā)明構(gòu)建的組織工程支架，可通過改變高分子聚合物的成分來調(diào)節(jié)支架的降 解速度，從而滿足自體組織器官的再生速度，。 5.本發(fā)明所使用的靜電紡絲技術(shù)操作方便，制備工藝簡單，根據(jù)接收裝置形狀不 同可以制備管狀、膜狀等不同形態(tài)支架，滿足不同組織形態(tài)需要。


圖1為以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架的表面形態(tài)的掃描電鏡圖片。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。
實施例1 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基 混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物(聚乳酸/聚己內(nèi)酯的重量比為7 : 3，分子 量為15萬)溶解在六氟異丙醇中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液；
第三步將纖維蛋白原液與聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液按體積比1 : 4混勻后加入靜 電紡絲機的同一容量管中進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為2kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm，紡 絲液推進(jìn)速度3ml/h，在接收裝置(轉(zhuǎn)速500rpm、外徑約0. 5cm的鋼管)上得到直徑0. 5cm， 長度為10cm的管狀的三維多孔納米支架； 第四步將三維多孔納米支架真空干燥24小時以除去支架中的殘留有機溶劑，以
環(huán)氧乙烷消毒，所得支架中纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為5 : 16，支架
中纖維直徑450nm，孔隙率60X。拉伸強度llMPa。如圖1所示，為以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的
三維多孔納米支架的表面形態(tài)的掃描電鏡圖片，纖維呈無序狀態(tài)、形態(tài)均一，未見紡錘形的
珠滴形成。 實施例2 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基 混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物(聚乳酸/聚己內(nèi)酯的重量比為5 : 5，分子 量為5萬)溶解在三氯甲烷中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液；
第三步將纖維蛋白原液與聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液按體積比1 : 2混勻后加入靜 電紡絲機的同一容量管中進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為0. 5kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm， 紡絲液推進(jìn)速度0. 5ml/h，在接收裝置(轉(zhuǎn)速500rpm、外徑約0. 5cm的鋼管)上得到直徑 0. 5cm，長度為10cm管狀的三維多孔納米支架； 第四步將三維多孔納米支架真空干燥24h以除去支架中的殘留有機溶劑，以Y
5射線消毒。所得支架中纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為4 : 5，支架中纖
維直徑280nm，孔隙率72% 。拉伸強度7. 5MPa。
實施例3 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基 混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物(聚乳酸/聚己內(nèi)酯的重量比為8 : 2，分子 量為30萬)溶解在二甲基甲酰胺中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液；
第三步將纖維蛋白原液與聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液按體積比1 : 1混勻后加入靜 電紡絲機的同一容量管中進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為3kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm，紡 絲液推進(jìn)速度4ml/h，在接收裝置(5cmX 10cm平整鋼板)上得到5cmX 10cm的膜狀的三維 多孔納米支架； 第四步將三維多孔納米支架真空干燥24小時以除去支架中的殘留有機溶劑，以 環(huán)氧乙烷消毒，所得支架中纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為6 : 5，支架 纖維直徑650nm，孔隙率65% 。拉伸強度10. 2MPa。
實施例4 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基 混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物(聚乳酸/聚己內(nèi)酯的重量比為7 : 3，分子
量為15萬)溶解在四氫呋喃中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液； 第三步將等體積纖維蛋白原液和聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液分別加入到靜電紡絲機
上兩不同的容量管中，將兩容量管中的不同原液同時進(jìn)行靜電紡絲，靜電紡絲參數(shù)設(shè)置相
同，紡絲電壓為0. 5kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm，紡絲液推進(jìn)速度0. 5ml/h，在接收裝置
(轉(zhuǎn)速500rpm、外徑約0. 5cm的鋼管)上得到直徑0. 5cm，長度為10cm管狀的三維多孔納米
支架； 第四步將三維多孔納米支架真空干燥24小時以除去支架中的殘留有機溶劑，以 環(huán)氧乙烷消毒，所得支架支架中纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為5 : 4， 纖維直徑520nm，孔隙率68 % 。拉伸強度8. 6MPa。
實施例5 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基 混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物(聚乳酸/聚己內(nèi)酯的重量比為7 : 3，分子
量為15萬)溶解在丙酮中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液； 第三步將體積比為1 : 4的纖維蛋白原液和聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液分別加入到
靜電紡絲機上兩不同的容量管中，將兩容量管中的不同原液同時進(jìn)行靜電紡絲，纖維蛋白
原紡絲液推進(jìn)速度0. 75ml/h，聚乳酸/聚己內(nèi)酯紡絲液推進(jìn)速度3ml/h，其余參數(shù)設(shè)置相
同，紡絲電壓為2kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm，在接收裝置上(5cmX 10cm平整鋼板)得
到膜狀的三維多孔納米支架； 第四步將三維多孔納米支架真空干燥24小時以除去支架中的殘留有機溶劑，以 環(huán)氧乙烷消毒，所得支架中纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為1 : 5，支架纖維直徑760nm，孔隙率65% 。拉伸強度13. 6MPa。
實施例6 第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基 混合而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120mg/ml的纖維蛋白原液； 第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物(聚乳酸/聚己內(nèi)酯的重量比為7 : 3，分子 量為15萬)溶解在體積比為1 : 1的二甲基甲酰胺與丙酮的混合溶劑中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%的聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液； 第三步將等體積纖維蛋白原液和聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液分別加入到靜電紡絲機 上兩不同的容量管中，將兩容量管中的不同原液同時進(jìn)行靜電紡絲，靜電紡絲參數(shù)設(shè)置相 同，紡絲電壓為3kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm，紡絲液推進(jìn)速度3ml/h，在接收裝置上 (5cmX10cm平整鋼板)得到膜狀的三維多孔納米支架； 第四步將三維多孔納米支架真空干燥24小時以除去支架中的殘留有機溶劑，以 環(huán)氧乙烷消毒，所得支架中纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為12 : 5，支架 纖維直徑280nm，孔隙率74% 。拉伸強度6. 8MPa。 同樣，分別以純100mg/ml纖維蛋白原原液和純8%聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液進(jìn)行靜 電紡絲，靜電紡絲設(shè)置參數(shù)同實施例l，紡絲電壓為2kv/紡絲距離cm，紡絲距離12cm，紡絲 液推進(jìn)速度3ml/h，在接收裝置(轉(zhuǎn)速500rpm、外徑約0. 5cm的鋼管)上得到直徑0. 5cm， 長度為10cm的管狀的三維多孔納米支架。所得纖維蛋白原支架纖維直徑220nm，孔隙率 76%。拉伸強度1.4MPa;聚乳酸/聚己內(nèi)酯支架纖維直徑460nm，孔隙率54X，拉伸強度 8. lMPa。以人臍靜脈內(nèi)細(xì)胞皮分別種植于純纖維蛋白原支架、純聚乳酸/聚己內(nèi)酯支架和 實施例1所得支架的表面，培養(yǎng)一周后測得支架表面臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖速率分別為3. 5、 0. 2及3. 2倍。
權(quán)利要求
一種以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架，其特征在于，由纖維蛋白原以及聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物制成。
2. 如權(quán)利要求1所述的以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架，其特征在于，所述纖維蛋白原與聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物的質(zhì)量比為i : 5 i2 : 5。
3. 如權(quán)利要求1所述的以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架，其特征在于，所述聚乳酸/聚己內(nèi)酯聚合物中聚乳酸與聚己內(nèi)酯的質(zhì)量比為5 : 5 8 : 2。
4. 如權(quán)利要求1所述的以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架，其特征在于，所述 聚乳酸/聚己內(nèi)酯聚合物的分子量為5萬 30萬。
5. 權(quán)利要求1所述的以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架的制備方法，其特征在 于，具體步驟為第一步將纖維蛋白原溶解在由體積比為9 : 1的六氟異丙醇和10XDMEM培養(yǎng)基混合 而成的溶劑中制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 120mg/ml的纖維蛋白原液；第二步將聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物溶解在六氟異丙醇、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氫呋喃和丙酮中的一種或兩種以上的混合溶劑中制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 10%的聚乳酸/聚己 內(nèi)酯原液；第三步將纖維蛋白原液與聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液按一定體積比混勻后加入靜電紡絲 機的同一容量管中進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為0. 5 3kv/紡絲距離cm，紡絲液推進(jìn)速度 0. 5 4ml/h，在接收裝置上得到膜狀或管狀的三維多孔納米支架；或者，將纖維蛋白原液和聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液分別加入到靜電紡絲機上兩不同的容 量管中，將兩容量管中的不同原液同時進(jìn)行靜電紡絲，紡絲電壓為0.5 3kv/紡絲距離cm， 紡絲液推進(jìn)速度0. 5 4ml/h，在接收裝置上得到膜狀或管狀的三維多孔納米支架；第四步將三維多孔納米支架真空干燥以除去支架中的殘留有機溶劑，以環(huán)氧乙烷或 Y射線消毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架及其制備方法。所述的以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的三維多孔納米支架，其特征在于，由纖維蛋白原以及聚乳酸/聚己內(nèi)酯共聚物制成。其制備方法為配制纖維蛋白原液和聚乳酸/聚己內(nèi)酯原液；靜電紡絲；以及后處理。本發(fā)明具有良好的比表面積、高孔隙率、空隙相連性好等特點。
文檔編號A61L27/22GK101780292SQ20101010725
公開日2010年7月21日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者何紅兵, 張祥滿, 方征東, 王玉琦, 符偉國, 董智慧, 郭大喬 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院