專利名稱：：一種中藥組合物及其在制備防治豬偽狂犬病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獸藥領(lǐng)域，具體涉及養(yǎng)豬業(yè)，尤其涉及一種中藥組合物及其在制備防治豬偽狂犬病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬偽狂犬病是一種由豬偽狂犬病毒(Psendorabiesvirus,PRV)引起的急性傳染病，可引發(fā)妊娠母豬流產(chǎn)、死胎以及呼吸道癥狀。該病在豬群中具有傳播快、死亡率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點(diǎn)，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。病毒性疾病的治療藥物研發(fā)較遲緩，主要由于病毒有嚴(yán)格寄生性，與細(xì)胞關(guān)系密切，病毒感染細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)利用細(xì)胞酶系統(tǒng)復(fù)制；有些病毒核酸整合于細(xì)胞染色體，難于清除。病毒嚴(yán)格寄生在細(xì)胞內(nèi)，使得藥物殺傷病毒的同時(shí)對(duì)機(jī)體細(xì)胞也有損害?，F(xiàn)有的抗病毒化學(xué)藥物即因?yàn)槎拘蕴蠡蚰退幮缘漠a(chǎn)生，其臨床難以取得令人滿意的效果。傳統(tǒng)中藥的多靶點(diǎn)作用機(jī)制、低毒副作用、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)使它表現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景，篩選高效低毒的抗病毒中藥是當(dāng)前抗病毒研究熱點(diǎn)之一。豬的偽狂犬病目前主要采用疫苗進(jìn)行預(yù)防，缺乏治療和預(yù)防藥物，一旦發(fā)病損失巨大，針對(duì)豬偽狂犬病毒設(shè)計(jì)相應(yīng)的中藥治療藥物，對(duì)豬偽狂犬病的治療具有重大意義。目前，有關(guān)中藥抗病毒的機(jī)制尚未完全研究清楚，但主要的作用包括直接抑制作用、增強(qiáng)免疫功能作用、修復(fù)組織損傷、防治并發(fā)癥和繼發(fā)感染、調(diào)節(jié)器整機(jī)體緩解癥狀、防止應(yīng)激等等。其中，直接抑制作用包括侵入前阻止吸附、細(xì)胞內(nèi)抑制增殖和抗表達(dá)再感染三方面。增強(qiáng)免疫功能包括促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫、促進(jìn)免疫器官發(fā)育、增強(qiáng)紅細(xì)胞免疫功能、誘生干擾素和增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，進(jìn)而殺滅病原體。目前，國(guó)內(nèi)研究和篩選抗病毒中藥的有效成分或有效部位群(如水溶性或醇溶性或脂溶溶性的一類成分)的主要研究手段是體外細(xì)胞法。國(guó)外抗病毒的篩選研究主要是從天然生物中提取、分離有效成分，并采用多種分子生物學(xué)研究手段(尤其是與現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)的方法)來(lái)研究其分子結(jié)構(gòu)與抗病毒分子機(jī)理間的關(guān)系，從而尋找有效的抗病毒藥物，這一點(diǎn)目前國(guó)內(nèi)尚有欠缺。同時(shí)由于病毒種類繁多、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、變異復(fù)雜，中藥進(jìn)入機(jī)體后藥物代謝過(guò)程復(fù)雜，加上中藥進(jìn)入機(jī)體后對(duì)免疫系統(tǒng)的影響與抗病毒間的協(xié)同關(guān)系等諸多因素的存在，這就使得針對(duì)某一病毒設(shè)計(jì)合適的中藥治療藥物是一項(xiàng)復(fù)雜且有難度的工作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可防治豬偽狂犬病的中藥組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述中藥組合物在制備防治豬偽狂犬病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明人首先根據(jù)豬偽狂犬病毒選擇黃芪、板藍(lán)根、半支蓮、千里光、金銀花、大青葉、連翹、香薷、魚(yú)腥草、地膽草、野菊花、貫眾、蟾酥、冰片和黃芩這15種中藥作為研究對(duì)象，通過(guò)15種單味中藥體外抗偽狂犬病毒的藥效觀察，以及小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，研究各種復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫力及抗氧化能力的影響，從而篩選出一種中藥組合物，該中藥組合物由地膽草、紫錐菊、半枝蓮、板藍(lán)根、野菊花、千里光、連翹、魚(yú)腥草和黃芪這9種中草藥中的任意69種組成。上述中藥組合物中，9種中草藥的用量比為地膽草紫錐菊半枝蓮板藍(lán)根野菊花千里光連翹魚(yú)腥草黃芪=30:18:26:20:18:26:20:30，所述用量比為重量比。本發(fā)明的中藥組合物的使用方法為從地膽草、紫錐菊、半枝蓮、板藍(lán)根、野菊花、千里光、連翹、魚(yú)腥草和黃芪這9種中草藥中隨意選擇任意69種，按照前述的用量比稱取后混合到一起，即可得到本發(fā)明所需的中藥組合物。本發(fā)明的中藥組合物中，連翹、野菊花、地膽草、魚(yú)腥草、半枝蓮和板藍(lán)根均對(duì)PRV在細(xì)胞內(nèi)的增殖具有很好的抑制作用，黃芪、板藍(lán)根、地膽草、金銀花、半枝蓮、魚(yú)腥草、野菊花和千里光都對(duì)PRV有抗吸咐作用，金銀花、千里光、野菊花、魚(yú)腥草、黃芪、板藍(lán)根和連翹對(duì)PRV具有直接的殺滅作用；此外，本發(fā)明的中藥組合物對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞具有顯著的促增值作用，對(duì)細(xì)胞因子IFN-Y的分泌也有明顯的促進(jìn)租用，還能維持血清中AST、ALT、TBIL、DBIL和CHOL這幾項(xiàng)指標(biāo)的正常水平，同時(shí)顯著提高TP、GLB和P這三項(xiàng)生化指標(biāo)，此外本發(fā)明的中藥組合物還能提高小鼠血清超氧化物歧化酶SOD的活力，降低丙二醛MDA含量。綜上所述，本發(fā)明的中藥組合物可用于制備防治豬偽狂犬病的藥物，應(yīng)用于豬飼養(yǎng)中對(duì)豬偽狂犬病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的中藥組合物在使用時(shí)可制成任意一種常用的劑型，如散劑、顆粒劑、注射劑或口服劑，在飼料或飲水中按O.5%1%口服使用，或制成注射液肌肉注射使用。本發(fā)明的中藥組合物在制備成散劑時(shí)，其具體操作過(guò)程為將上述中藥組合物中的69種中草藥按比例稱取混合，粉碎后過(guò)80100目篩，制成散劑。本發(fā)明的中藥組合物在制備成顆粒劑時(shí)，其具體操作過(guò)程為將上述中藥組合物中的69種中草藥按比例稱取混合，然后采用水煎濃縮的方法，制成顆粒劑。本發(fā)明的中藥組合物在制備成注射劑時(shí)，其具體操作過(guò)程為將上述中藥組合物中的69種中草藥按比例稱取混合，然后采用水煎濃縮過(guò)濾除菌的方法，制成濃度為lg生藥/mL的注射液。本發(fā)明的中藥組合物在制備成口服劑時(shí)，其具體操作過(guò)程為將上述中藥組合物中的69種中草藥按比例稱取混合，然后采用水煎濃縮過(guò)濾除菌的方法，制成濃度為lg生藥/mL的口服液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明在中醫(yī)藥基本理論的指導(dǎo)下，結(jié)合文獻(xiàn)檢索和臨床經(jīng)驗(yàn)，篩選出一種中藥組合物，該組合物包含地膽草、紫錐菊、半枝蓮、板藍(lán)根、野菊花、千里光、連翹、魚(yú)腥草和黃芪，這9種中草藥分別對(duì)豬偽狂犬病毒的增值具有抑制作用，對(duì)豬偽狂犬病毒具有抗吸附作用和直接滅殺作用，而且這9種中草藥的復(fù)方能夠提高小鼠免疫力和抗氧化能力，因此4該中藥組合物可用于豬偽狂犬病的防治，具有廣闊的市場(chǎng)前景。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例l15種單味中藥體外抗豬偽狂犬病毒的藥效觀察本實(shí)施例選擇黃芪、板藍(lán)根、半支蓮、千里光、金銀花、大青葉、連翹、香薷、魚(yú)腥草、地膽草、野菊花、貫眾、蟾酥、冰片和黃吝15種中藥，對(duì)這15種單味中藥進(jìn)行體外抗豬偽狂犬病毒的藥效觀察。—、單味中藥的研究1.15種單味中藥的提取液制備貫眾提取液貫眾粗粉50g經(jīng)80X酒精加熱回流提取2次，每次10倍體積，40min，提取液趁熱濾過(guò)后合并，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)粗提液，定容到50m1(1:l，體積比)醇提液。蟾酥提取液蟾酥lg經(jīng)80%酒精加熱提取，醇體積為藥材的200倍，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取液，定容到lOOml(l:IOO，體積比)醇提液。冰片提取液冰片lg經(jīng)80%酒精溶解提取，定容至100ml(1:100，體積比)醇提液。黃芩提取液黃芩粗粉50g水提，水煎兩次，每次沸騰30min，合并兩次煎液，常壓真空抽濾及濃縮，調(diào)ra=7.2定容至50ml(1:1，體積比)水煎液。黃芪、板藍(lán)根、半支蓮、千里光、金銀花、大青葉、連翹、香薷、魚(yú)腥草、地膽草、野菊花提取液各藥按傳統(tǒng)的水煎煮方法進(jìn)行粗提，上述藥物均粉碎到20目，浸泡2h，水煎兩次，每次煮沸30min，合并兩次煎液，常壓真空抽濾及濃縮，定容至50ml(1:1，體積比)水煎液，相當(dāng)于lg生藥/ml。2.中藥對(duì)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度的測(cè)定結(jié)果通過(guò)MTT法檢測(cè)加入中藥后的細(xì)胞存活情況，根據(jù)計(jì)算平均OD值間接判斷中藥的毒性大小，如表1、2和3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可知，毒性按小到大排列為黃芪<香薷<板藍(lán)根<千里光<連翹<半枝蓮、地膽草<大青葉<魚(yú)腥草<野菊花<黃芩<金銀花<貫眾<冰片<蟾酥。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察到中藥對(duì)PK細(xì)胞也有一定的毒性作用，其毒性作用主要表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加、變圓、粘連、破碎、脫落、死亡、吸光值明顯下降。藥液濃度的升高，對(duì)細(xì)胞毒性越大，存活細(xì)胞越少，MTT被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原成藍(lán)色甲簪結(jié)晶越少，0D值越小，細(xì)胞存活率越低。3.PRV的TCID50測(cè)定結(jié)果MTT法測(cè)定不同稀釋度豬偽狂犬病病毒PRV對(duì)PK細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。由0D值計(jì)算得各稀釋度下病毒對(duì)PK細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果如表4所示。根據(jù)Reed-Muench兩氏法得PRV的TCID5。=10—416/0.1ml。根據(jù)下列公式計(jì)算距離比例=(高于50%的百分?jǐn)?shù)_50)/(高于50%的百分?jǐn)?shù)_低于50%的百分?jǐn)?shù))=(57.07-50)/(57.07-12.34)=0.16。LgTCID5。=距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的對(duì)數(shù)=0.158X(-l)+(-4)=-4.16。TCID50=10—416/0.lml。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.中藥對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用由表5和表6可知，連翹抑制PRV內(nèi)增殖的效果最好，其次是野菊花、地膽草、金銀花、魚(yú)腥草、香薷、半枝蓮和板藍(lán)根，冰片、黃芩和蟾酥較次之，貫眾及黃芪抑制效果不明顯，大青葉和千里光沒(méi)有抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5.中藥對(duì)病毒的抗吸附作用如表7和表8所示，黃芪、板藍(lán)根、蟾酥、地膽草、金銀花、半枝蓮、魚(yú)腥草、大青葉、野菊花、千里光和香薷都對(duì)PRV有抗吸咐作用，其中以黃芪效果最好，板藍(lán)根、蟾酥、地膽草和金銀花等次之，香薷效果最弱，冰片、連翹、黃芩和貫眾沒(méi)有抗吸附的作用。表7中藥對(duì)PRV的預(yù)防作用抑制率％(^土S.E，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表7中，Cl、C2、C3、C4、C5表示從TC50開(kāi)始倍比稀釋的五個(gè)濃度。表8中藥對(duì)PRV的預(yù)防作用治療指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6.中藥對(duì)病毒的直接滅活作用由表9和10可知，對(duì)PRV病毒的直接滅活作用中蟾酥、金銀花和貫眾效果較好，其中以蟾酥效果最好，千里光、野菊花、香薷、魚(yú)腥草、黃芪、板藍(lán)根、大青葉和連翹也有直接殺滅作用，但效果不如蟾酥和金銀花理想；冰片的直接殺滅作用最弱，幾乎與黃芩和地膽草一樣，對(duì)PRV沒(méi)有直接殺滅的作用。表9中藥對(duì)PRV的直接滅活作用抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注Cl、C2、C3、C4、C5表示從TC,。開(kāi)始倍比#釋的五個(gè)濃度。CN101721533A眾s步14/ls〔0060u嫌10i邀進(jìn)PRV苦w碟s筇^油s遂4端錄〔0061u<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二、復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫力及抗氧化能力的影響根據(jù)前述15種單味中藥的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，旨在研究中藥抗病毒作用的機(jī)理。復(fù)方I的配方為金銀花30克、黃芪18克、地膽草20克、野菊花12克、貫眾20克、冰片1克；復(fù)方II的配方為黃芩30克、金銀花28克、連翹30克、大青葉20克、魚(yú)腥草16克、野菊花12克、貫眾20克；復(fù)方III的配方為地膽草30克、紫錐菊30克、半枝蓮18克、板藍(lán)根26克、野菊花20克、千里光18克、連翹26克、魚(yú)腥草20克和黃芪30克；復(fù)方IV的配方為大青葉20克、魚(yú)腥草16克、野菊花12克、貫眾20克。以生理鹽水作為對(duì)照組。1.復(fù)方制劑對(duì)小鼠脾臟指數(shù)影響的結(jié)果由表11可知，與對(duì)照組相比，四種復(fù)方制劑對(duì)小鼠脾臟指數(shù)都有一定的影響，復(fù)方1、復(fù)方III和復(fù)方IV的脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組，復(fù)方III和復(fù)方IV與其它組對(duì)比均差異顯著(P<0.05)，尤其以復(fù)方III組差異突出。表ll復(fù)方制劑對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響(f±S.E，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上述表12中，脾臟指數(shù)處各數(shù)值的上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。3.復(fù)方制劑對(duì)小鼠血清IFN-Y的影響由表13可知，與對(duì)照組相比，復(fù)方III、IV組小鼠血清IFN-Y的含量較高，而且差異顯著(P<0.05)。與復(fù)方IV組比較，復(fù)方III組促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-Y分泌的作用更加明顯，差異顯著(P<0.05)。表13復(fù)方制劑對(duì)小鼠血清IFN-Y的影響(f土S.E，n=5)組別<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>上述表14中，各數(shù)值的上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。5.抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果5.1S0D的測(cè)定結(jié)果由表15可知，與其它組相比，復(fù)方III能提高小鼠血清SOD的活力，但差異不顯著；其它組均比正常值要低，差異不顯著。表15復(fù)方制劑對(duì)小鼠血清SOD的影響(f±S.E，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>5.2MDA的測(cè)定結(jié)果由表16可知，與其它各組比較，復(fù)方IV能提高血清中MDA含量，且差異顯著(P<0.05)，而其余三組與對(duì)照組的MDA含量接近，復(fù)方III還能降低MDA含量，但差異不顯表16復(fù)方對(duì)小鼠血清MDA的影響(f士s.E，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>上述表16中，MDA含量處各數(shù)值的上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。通過(guò)對(duì)四個(gè)復(fù)方的研究，最終得出本發(fā)明的中藥組合物配方，即由地膽草、紫錐菊、半枝蓮、板藍(lán)根、野菊花、千里光、連翹、魚(yú)腥草或黃芪中的任意69種中草藥組成，各中草藥的重量比為地膽草紫錐菊半枝蓮板藍(lán)根野菊花千里光連翹魚(yú)腥草黃甚=30:is:加20:is:加20:30。本實(shí)施例的各表中，蟾、板、金、冰、芪、連、野、大、芩、地、香、魚(yú)、半、千、貫分別表示蟾酥、板藍(lán)根、金銀花、冰片、黃芪、連翹、野菊花、大青葉、黃芩、地膽草、香薷、魚(yú)腥草、半枝蓮、千里光、貫眾。權(quán)利要求一種中藥組合物，其特征在于該中藥組合物由地膽草、紫錐菊、半枝蓮、板藍(lán)根、野菊花、千里光、連翹、魚(yú)腥草或黃芪中的任意6～9種中草藥組成，所述各中草藥的重量比為地膽草∶紫錐菊∶半枝蓮∶板藍(lán)根∶野菊花∶千里光∶連翹∶魚(yú)腥草∶黃芪＝30∶18∶26∶20∶18∶26∶20∶30。2.權(quán)利要求1所述中藥組合物在制備防治豬偽狂犬病的藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述防治豬偽狂犬病的藥物為散劑、顆粒劑、注射劑或口服劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述防治豬偽狂犬病的散劑藥物是通過(guò)將權(quán)利要求1所述中藥組合物按比例稱取混合，粉碎后過(guò)80100目篩制備而得。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述防治豬偽狂犬病的顆粒劑藥物是通過(guò)將權(quán)利要求1所述中藥組合物按比例稱取混合，然后采用水煎濃縮的方法制備而得。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述防治豬偽狂犬病的注射劑藥物是通過(guò)將權(quán)利要求1所述中藥組合物按比例稱取混合，然后采用水煎濃縮過(guò)濾除菌的方法，從而制備得到濃度為lg生藥/mL的注射液。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述防治豬偽狂犬病的口服劑注射劑藥物是通過(guò)將權(quán)利要求1所述中藥組合物按比例稱取混合，然后采用水煎濃縮過(guò)濾除菌的方法，制成濃度為lg生藥/mL的口服液。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種中藥組合物及其在制備防治豬偽狂犬病藥物中的應(yīng)用，該中藥組合物由地膽草、紫錐菊、半枝蓮、板藍(lán)根、野菊花、千里光、連翹、魚(yú)腥草或黃芪中的任意6～9種中草藥組成，各中草藥的重量比為地膽草∶紫錐菊∶半枝蓮∶板藍(lán)根∶野菊花∶千里光∶連翹∶魚(yú)腥草∶黃芪＝30∶18∶26∶20∶18∶26∶20∶30。本發(fā)明在中醫(yī)藥基本理論的指導(dǎo)下，結(jié)合文獻(xiàn)檢索和臨床經(jīng)驗(yàn)，篩選出一種中藥組合物，該組合物中的中草藥分別對(duì)豬偽狂犬病毒的增殖具有抑制作用，對(duì)豬偽狂犬病毒具有抗吸附作用和直接滅殺作用，該組合物能夠提高小鼠免疫力和抗氧化能力，因此該中藥組合物可用于豬偽狂犬病的防治，具有廣闊的市場(chǎng)前景。文檔編號(hào)A61K9/14GK101721533SQ20101001934公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2010年1月12日優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日發(fā)明者仇微紅,吳鴻,孔德勝,石達(dá)友,郭世寧,陳志虹,魏光偉申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)