專利名稱：京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工神經(jīng)移植物及其制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)實(shí)社會(huì)中交通事故、工傷事故、運(yùn)動(dòng)意外及臨床手術(shù)等事件均會(huì)造成周圍神經(jīng) 損傷，臨床上但當(dāng)中長距離的神經(jīng)缺損不能依靠端對端的縫合來彌補(bǔ)神經(jīng)缺失時(shí)，就不得 不依靠移植物來橋接修復(fù)。近年來，基于生命科學(xué)與工程學(xué)的原理和技術(shù)發(fā)展起來的組織 工程學(xué)為構(gòu)建神經(jīng)移植替代品提供了一條新的出路。采用組織工程技術(shù)修復(fù)神經(jīng)損傷的研 究主要集中在設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的組織工程神經(jīng)橋接裝置，目前這類橋接物通常是單獨(dú)采用生 物材料，通過將其加工成管狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)引導(dǎo)通道，為神經(jīng)的再生提供適當(dāng)?shù)目臻g和引導(dǎo) 作用。但對于長距離、粗大神經(jīng)缺損，這類單純由生物材料組成的導(dǎo)管由于缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因 子等微環(huán)境物質(zhì)的支持，取得的修復(fù)效果非常有限。這可能是因?yàn)殚L距離神經(jīng)缺損修復(fù)早 期，神經(jīng)斷端內(nèi)細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子有限，難以在長距離或較粗的神經(jīng)導(dǎo)管中發(fā)揮作 用。 已有的研究表明，在神經(jīng)缺損修復(fù)中需要生物微環(huán)境如神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)的作 用，這提示我們?nèi)绻斯ど窠?jīng)移植物上含有一定濃度的神經(jīng)營養(yǎng)因子，將能夠提高缺損神 經(jīng)的修復(fù)效果，尤其是對長距離、粗大神經(jīng)缺損。因此，理想的組織工程人工神經(jīng)移植物應(yīng) 該包含支架材料、神經(jīng)營養(yǎng)因子和種子細(xì)胞三部分，其中支架材料應(yīng)具有良好的力學(xué)性能、 通透性能、生物相容性和生物可降解性；神經(jīng)營養(yǎng)因子應(yīng)具有合適濃度、良好釋放率和盡量 長的釋放時(shí)間。 從2007年以來，隨著人工神經(jīng)移植物材料研究的逐漸成熟和完善，在材料上固定 神經(jīng)生長因子這方面的研究逐步成為神經(jīng)再生領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，有人采用直接包埋法 將不同劑量的NGF固定在不同工藝制備的絲素蛋白材料上，然后考察了各自體外釋放NGF 的情況及與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)后促進(jìn)細(xì)胞分化的情況。 京尼平是存在于果實(shí)中的環(huán)烯醚萜苷，具有廣泛的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗 腫瘤、抗氧化等。1999年有人用京尼平交聯(lián)的明膠基創(chuàng)口粘貼膜具有優(yōu)異的使用性能，具有 低的急性毒性，在鼠中的LD50是382mg/kg，它的毒性比常用的戊二醛的毒性低10， 000倍。 京尼平作為一種天然交聯(lián)劑，在明膠、殼聚糖等含氨基的生物大分子材料的改性方面有了 較多的研究報(bào)道。如有人通過京尼平的交聯(lián)作用，提高明膠薄膜的強(qiáng)度，降低其水容性等。 關(guān)于京尼平與含氨基的生物大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理目前尚無統(tǒng)一的認(rèn)識，隨著反 應(yīng)條件(主要是溫度和pH值)的不同，可能有不同的反應(yīng)機(jī)理。 一般認(rèn)為在較低的溫度 (35t:左右)和弱堿性介質(zhì)(pH = 7.5-8.0)中，京尼平以3種異構(gòu)體的形式處于平衡狀態(tài) 存在。京尼平的二醛結(jié)構(gòu)，使其易發(fā)生聚合。至于京尼平是以單體的形式還是以二聚體或 多聚體的形式與氨基酸的生物大分子反應(yīng)，目前還沒有定論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含神經(jīng)營養(yǎng)因子的京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工
神經(jīng)移植物及其制備方法。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 —種京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物，其特征是包括神經(jīng)移植物支 架材料，神經(jīng)移植物支架材料上有經(jīng)京尼平交聯(lián)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。 神經(jīng)營養(yǎng)因子為神經(jīng)生長因子、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、堿性成纖維 細(xì)胞生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一種或多種。 人工神經(jīng)移植物支架材料為殼聚糖、絲素蛋白、膠原、明膠中的一種或多種。
—種京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物的制備方法，其特征是在神經(jīng) 移植物支架材料溶液里加入京尼平溶液和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，然后將溶液進(jìn)行成型加工， 同時(shí)固化交聯(lián)，得到所需要的人工神經(jīng)移植物。
神經(jīng)移植物支架材料溶液與京尼平溶液的體積比從o.2 : i-i : 4。 神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料、京尼平及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合液中的濃度為 1y g/ml_800g/ml。 本發(fā)明的產(chǎn)品含神經(jīng)營養(yǎng)因子，所用材料均為可降解性材料，與人體有著良好的 生物相容性。制得的產(chǎn)品不含有由于制備工藝帶入的外源性毒、副作用物質(zhì)。導(dǎo)管管壁具 有豐富微孔的三唯結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)細(xì)胞生長過程所需的營養(yǎng)物質(zhì)的輸送提供了必須的途徑， 使用效果好。為神經(jīng)細(xì)胞的生長提供了必要的誘導(dǎo)作用和必須的生長空間。我們將以上制 得的產(chǎn)品在體外與神經(jīng)組織細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)觀察、酶代謝活力測定、神經(jīng)生長因子的 測定，顯示該產(chǎn)品具有良好的生物相容性。大鼠動(dòng)物體內(nèi)使用該產(chǎn)品修復(fù)坐骨神經(jīng)1厘米 距離缺損，標(biāo)明該產(chǎn)品能有利于神經(jīng)再生，導(dǎo)致恢復(fù)損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)，同時(shí)該產(chǎn)品具有 很好的組織相容性。 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 : 將蠶絲在弱堿溶液(0. 1 10%重量濃度的碳酸鈉或0. 1 10%重量濃度的碳酸 鉀)中50 IO(TC加熱處理，然后將處理后的纖維用蒸餾水清洗得到絲素蛋白纖維，將上 述制備的部分蠶絲絲素蛋白纖維于25-8(TC (例25t:、5(TC、8(rC)下，溶解在氯化鈣、乙醇
和水的三元體系中(摩爾比是氯化f丐乙醇水=i : 2 : 8)，溶解時(shí)間為o. 5 6小時(shí)
(例0. 5、3、6小時(shí))將溶解的混合溶液裝入纖維素膜袋，用蒸餾水透析得到含1_10%絲素 蛋白水溶液，加入lOmM京尼平溶液和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，絲素蛋白水溶液與京尼平溶液體
積比為o.2 : i-i : 4(例o.5 : i、i : i、i : 2)，神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料、
京尼平及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合液中的濃度為IP g/ml-800g/ml，種類有神經(jīng)生長因子(NGF)、 腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、膠質(zhì) 細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等中的一種或多種，然后將溶液注入模具，交聯(lián)和干燥得到含 神經(jīng)營養(yǎng)因子的絲素蛋白人工神經(jīng)移植物。
實(shí)施例2:
將殼聚糖用弱酸溶解，弱酸是醋酸(或磷酸、檸檬酸、乳酸)，乳酸的濃度為 0.5 15% (例2%、8%、15% )，殼聚糖的濃度為0. 5-5% (例0. 5 % 、2 % 、5 % )。加入 一定量的lOmM京尼平溶液和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，絲素蛋白水溶液與京尼平溶液體積比為
(0.2 : i-i : 4，例o. 5 : i、i : i、i : 2)，神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料、京尼平
及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合液中的濃度為1 P g/ml-800g/ml，種類有神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源神 經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源 神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等中的一種或多種，然后將溶液注入模具，交聯(lián)和干燥得到含神經(jīng)營 養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物。
實(shí)施例3 : 將濃度為0.5-5% (例O. 5%、2%、5%)膠原溶液加入一定量的10mM京尼平溶液， 和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，絲素蛋白水溶液與京尼平溶液體積比為體積比從0.2 : 1-1 : 4(例
0.5 : i、i : 1、1 : 2)，神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料、京尼平及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合
液中的濃度為IP g/ml-800g/ml，種類有神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、 神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)等中的一種或多種，然后將溶液注入模具，交聯(lián)和干燥得到含神經(jīng)營養(yǎng)因子的膠原 蛋白人工神經(jīng)移植物。
實(shí)施例4 : 將明膠用熱水溶解，明膠的濃度為0.5-5% (例0.5%、2%、5% )，加入一定 量的lOmM京尼平溶液和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，絲素蛋白水溶液與京尼平溶液體積比為
0.2 : i-i : 4(例o.5 : i、i : 1、1 : 2)，神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料、京尼平
及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合液中的濃度為IP g/ml-800g/ml，種類有神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源神 經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源 神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等中的一種或多種，然后將溶液注入模具，交聯(lián)和干燥得到含神經(jīng)營 養(yǎng)因子的明膠人工神經(jīng)移植物。
權(quán)利要求
一種京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物，其特征是包括神經(jīng)移植物支架材料，神經(jīng)移植物支架材料上有經(jīng)京尼平交聯(lián)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物，其特征是神 經(jīng)營養(yǎng)因子為神經(jīng)生長因子、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、堿性成纖維細(xì)胞生長因 子、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一種或多種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物，其特征是 人工神經(jīng)移植物支架材料為殼聚糖、絲素蛋白、膠原、明膠中的一種或多種。
4. 一種權(quán)利要求1所述的京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物的制備方法，其 特征是在神經(jīng)移植物支架材料溶液里加入京尼平溶液和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，然后將溶液 進(jìn)行成型加工，同時(shí)固化交聯(lián)，得到所需要的人工神經(jīng)移植物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物的制備方法，其 特征是神經(jīng)移植物支架材料溶液與京尼平溶液的體積比從0.2 : 1-1 : 4。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物的制備方法，其特征是神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)移植物支架材料、京尼平及神經(jīng)營養(yǎng)因子混合液中的濃度為1y g/ml_800g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種京尼平固定神經(jīng)營養(yǎng)因子的人工神經(jīng)移植物及其制備方法，產(chǎn)品包括神經(jīng)移植物支架材料，神經(jīng)移植物支架材料上有經(jīng)京尼平交聯(lián)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。制備方法包括在神經(jīng)移植物支架材料溶液里加入京尼平溶液和神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液，然后將溶液進(jìn)行成型加工，同時(shí)固化交聯(lián)，得到所需要的人工神經(jīng)移植物。本發(fā)明的產(chǎn)品含神經(jīng)營養(yǎng)因子，所用材料均為可降解性材料，與人體有著良好的生物相容性。制得的產(chǎn)品不含有由于制備工藝帶入的外源性毒、副作用物質(zhì)。
文檔編號A61L27/54GK101708345SQ201010017248
公開日2010年5月19日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者丁斐, 楊宇民, 顧曉松 申請人:南通大學(xué)