專利名稱：脊髓損傷、炎癥和免疫性疾病:治療劑的局部控釋的制作方法
技術領域：
本公開涉及一種傳遞至損傷處的治療劑。
背景技術：
一氧化氮(NO)是一種氣態(tài)的化學信使，它參與了人體內(nèi)的多種生理學過程。發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的濃度最高。酶NO合成酶(NOS)催化NO的合成(Conti，A.，Miscusi,M. , Cardali, S. ,Germano,A. , Suzuki,H. ,、Cuzzocrea,S.和 Tomasello,F. (2007)Nitric oxide in the injured spinal cord Synthases cross-talk, oxidative stressand inflammation(受損脊髓中的一氧化氮合成酶的竄擾、氧化應激以及炎癥)。BrainResearch Reviews 54,205-218) CNS中的NOS具有四種亞型。其中兩種為組成型表達 神經(jīng)元型(nNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)。在線粒體中發(fā)現(xiàn)了一種功能活性的亞型(mtNOS)，而第四種亞型能在病理狀態(tài)下誘導產(chǎn)生(iNOS)。正常情況下，nNOS位于神經(jīng)元、血管周神經(jīng)中，在星形膠質(zhì)細胞中也有非常低的含量?？梢栽谀X血管內(nèi)皮中發(fā)現(xiàn)eNOS。而iNOS在星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、血管平滑肌和內(nèi)皮細胞中表達。但NO除了在正常機能中的作用外還具有毒性。對于超氧陰離子自由基(O廣)，NO在與超氧化物歧化酶的競爭中勝出，生成過氧亞硝基陰離子。過氧亞硝基(peroxynitrite)本身就是具有毒性的。除此之外，過氧亞硝基在生理條件下分解成羥自由基、碳酸根自由基和二氧化氮，這些物質(zhì)能使細胞受到毒性的氧化應激。過氧亞硝基及其分解產(chǎn)物造成的氧化應激導致了多種疾病和損傷狀態(tài)，包括脊髓損傷(SCI)、中風、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循環(huán)休克(circulatory shock)、慢性炎癥性疾病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病。發(fā)生神經(jīng)元損傷后，nNOS發(fā)生短時間的上調(diào)(I小時)。證據(jù)顯示這會引起缺血性損傷(ischemic damage)。另一方面,eNOS產(chǎn)生的NO可以通過促進血管舒張并抑制微血管發(fā)生凝集和粘連來起到保護神經(jīng)的作用。根據(jù)這一點，假設NO能清除由缺血產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)而具有保護的功能。但在最初的nNOS發(fā)生上調(diào)之后，下調(diào)至組成水平以下的NO卻會引起氧化應激和iNOS的超級誘導。在病理狀態(tài)下(如炎癥、免疫應答和外傷)時，iNOS幾乎在所有類型的細胞中都有表達。誘導需要炎性細胞因子，從而使轉(zhuǎn)錄因子STAT-I和(NF)-K B激活。iNOS—旦得到表達就能在時間和空間上產(chǎn)生高濃度的NO。雖然NO在噬菌細胞過程中非常重要，但如同對慢性炎癥、自身免疫疾病和外傷的觀察，以不受控的方式釋放過量的NO可能對組織造成損害。在SCI中，遭受損傷2小時后，iNOS的mRNA就在受損組織中得到了表達并持續(xù)數(shù)天。炎性細胞無法在損傷后3小時期間內(nèi)侵入組織。因此，SCI后的早期iNOS表達很可能僅由固有脊髓細胞(resident spinal cord cells)(特別是小膠質(zhì)細胞)產(chǎn)生。該時間點之后的iNOS表達主要由浸潤的炎性細胞產(chǎn)生。雖然嗜中性粒細胞在損傷后I小時即可在脊髓中檢測到，但是大多數(shù)在血管內(nèi)。損傷后3-4小時發(fā)生外滲。嗜中性粒細胞感染率在損傷后1-3天達到最高值，并持續(xù)達10天。嗜中性粒細胞會釋放出大量的物質(zhì)，包括趨化因子、細胞因子、酶、ROS和活性氮自由基(reactive nitrogen radical)。NO與CNS缺血性損傷和外傷損傷后的神經(jīng)毒性有關(Xiong, Y、Rabchevsky,A. G.和 Hall, E. D. (2007)Role of peroxynitrite in secondary oxidative damageafter spinal cord injury (過氧亞硝基在脊髓損傷后的二次氧化損害中的作Μ)·]· Neurochem. 100 (I) · 639-649)。NO作為自由基能引起蛋白亞硝基化。它能通過多種機理而削弱氧化磷酸化并抑制糖基化，造成能量耗盡、缺氧和神經(jīng)元死亡。NO能促進誘變DNA的脫氨基作用，并引起磷脂過氧化反應，從而破壞細胞膜的結(jié)構和功能完整性，導致細胞死亡。SCI后，有研究指出過氧亞硝基形成的水平至少在損傷后一周內(nèi)持續(xù)升高，這正好與蛋白質(zhì)氧化以及脂質(zhì)過氧化相吻合。參見Deng, Y·, Thompson, B. M. , Gao, X和 Hall,E.D. (2007)Temporal relationship of peroxynitrite-induced oxidativedamage, calpain—mediated cytoskeletal degradation and neurodegeneration after traumatic brain injury(外傷性腦損傷后的過氧亞硝基誘導的氧化損害、 丐蛋白酶介導的細胞骨架退化以及神經(jīng)退行性變間的時間關系).Exp. Neurol. 205. 154-165。還有研究指出了多種試劑在減輕二次損傷中的效果，包括青霉氨、坦波爾(tempol) (Hillard, V. H.,Peng, H. , Zhang, Y. , Das, K. , Murali, R. ^PEtlinger, J. D. (2004)Tempol, a nitroxideantioxidant, improves locomotor and histological outcomes after spinal cordcontusion in rats (坦波爾，一種硝基氧抗氧化物,能改善脊髓挫傷后大鼠的運動性和組織性結(jié)果)，J. Neurotrauma 21 (10). 1405-1414 ( “Hillard 等人”))和尿酸(Scott, G. S.，Cuzzocrea, S. , Genovese, T. , Koprowski, H.和 Hooper, D. C. (2005)Uric acid protectsagainst secondary damage after spinal cord injury(尿酸能防止脊髓損傷后的二次損害)，Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (9)，3483-3488 (“Scott 等人”))。此外，還有研究證實了臨床上給藥的糖皮質(zhì)激素類固醇的神經(jīng)保護效果很大程度是因為抑制了脂質(zhì)過氧化而不是受體介導的抗炎性(Hall,E. D.和Springer, J. Ε· (2004)Neuroprotection and Acute SpinalCord Injury A Reappraisal (神經(jīng)保護與急性脊髓損傷一次重新評價)，NeuroRx. I,80-100)。1990年時，采用了高劑量甲基脫氫皮質(zhì)醇(methylprednisolone)作為治療急性SCI的標準。但是，對給藥治療急性SCI的類固醇的爭議主要歸結(jié)于其不利的副作用風險(如，感染、肺炎、感染性休克、糖尿病并發(fā)癥和延誤傷口愈合)和定量難度(如，尖銳的雙相劑量反應曲線以及所需處理期間隨著起始的時間點而變化)。已經(jīng)在局部給藥甲基脫氫皮質(zhì)醇。參見 Chvatal, S. A.，Kim, Y. -T.，Bratt-Leal, A. M.，Lee, H.和Bellamkonda, R. V. (2008)Spatial distribution and anti-inflammatory effectsof Methylprednisolone after sustained local delivery to the contused spinalcord(甲基脫氫皮質(zhì)醇在挫傷脊髓進行持續(xù)局部釋藥后的空間分布與抗炎性效果)，Biomaterials, 1-9。Chvatal等人的給藥法需要在椎板切除術中通過手術使脊髓暴露。然后將傳遞介質(zhì)-溫熱的瓊脂糖施覆在硬脊膜(dura)的外側(cè)。對SCI后的脊髓細胞和損傷后的的外周神經(jīng)的氧化應激可能歸因于在生理學條件下產(chǎn)生的由NO和ROS形成的過氧亞硝基和過氧亞硝基活性降解產(chǎn)物。由氧化應激造成的壞死過程或細胞凋亡級聯(lián)反應由于過氧亞硝基的存在而以造成脊髓損傷或外周神經(jīng)損傷后的病變擴散為特征。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明涉及一種在患者損傷處對損傷進行治療的方法。該方法包括在損傷處向患者給藥含有基質(zhì)和一種或多種治療劑的藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery system)。另一方面，本發(fā)明涉及一種含有基質(zhì)和一種或多種治療劑的藥物傳遞系統(tǒng)。


下面結(jié)合附圖將能更好地理解對本發(fā)明優(yōu)選實施方式的具體說明。為了闡述本發(fā)明，附圖中展示的為目前的優(yōu)選實施方式。但應理解本發(fā)明并不限于所示的具體布置與手段。圖中 圖I顯示了 PEG-400的1H_NMR(核磁共振)譜；圖2顯示了比值為50 50的PLGA與Lactel的1H-NMR譜；圖 3 顯示了 CP-PLGA-pPEG-PLGA-Ι 的 1H-NMR 譜；圖4顯示了用來檢測鏈轉(zhuǎn)移劑CP-PLGA-pPEG-PLGA-RAFT-功能的1H-NMR譜；圖5 顯示了 S-(硫代苯甲酰)乙硫醇酰氯(S-(thiobenzoyl) thioglycolic acidchloride) DJS-CP-硫代苯甲酰-乙硫醇酰氯_1的IH-NMR譜；圖 6 顯示了 CP-PLGA-PEG-PLGA-CTA-Cl-rxn-Ι 的 1H-NMR 譜；圖7顯示了用S-硫代苯甲酰乙硫醇酸鏈轉(zhuǎn)移劑官能化的CP-PGS-CTA聚(甘油-共-癸二酸)的IH-NMR譜；圖8顯示了治療劑在50 μ L的含5mg微米顆粒(microparticle)的水凝膠中，從水凝膠-微米顆粒上的釋放曲線。
具體實施例方式權利要求書和說明書中對應部分中所用的詞“一”和“一個”，在沒有相反說明的情況下表示的是一個或多個所指代的物品。本文使用的“基質(zhì)”意指水凝膠、顆粒、納米顆粒、微米顆?；蛩鼈兊慕M合。本文使用的“治療劑”和“藥物”可互換使用。本文使用的“損傷”指的是以任何方式造成的損傷，包括但不限于物理外傷、疾病、免疫性疾病或炎癥。本文使用的“患者”指的是人類或?qū)儆诩顾鲃游镩T的非人類動物。本文使用的“一種藥學可接受鹽”或“多種藥學可接受鹽”指的是能安全有效地用于患者并獲得期望的生物學活性的化合物的鹽。所述多種藥學可接受鹽包括具有酸性或堿性基團的鹽。藥學可接受酸性添加鹽包括但不限于鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽(isonicotinate)、醋酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、琥珀酸鈉、馬來酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醒酸鹽(glucaronate)、鹿糖鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和巴莫酸鹽(即，1，I’ -亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))這些鹽。所述多種藥學可接受鹽包括多種氨基酸的鹽。藥物可接受堿性鹽包括但不限于鋁鹽、鈣鹽、鋰鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽和二乙醇胺鹽。本文的實施方式提供了一種調(diào)整外傷后二次損傷后的方法，該方法通過局部給藥治療劑來清除損傷處或炎癥處的自由基。鑒于用藥物(如糖皮質(zhì)激素類固醇)進行全身給藥還伴隨著不期望的副作用，因此通過局部給藥治療劑(包括消炎藥(如二甲胺四環(huán)素或甲基脫氫皮質(zhì)醇)、或自由基清除劑(如尿酸或坦波爾))來減輕二次損傷可能是有意義的。提供了對損傷后的神經(jīng)損害做出應答的藥物傳遞系統(tǒng)祀向過程(targeting processes)來影響治療劑的局部給藥。所述靶向過程包括由損傷引起的傷害造成的氧化應激。藥物傳遞系統(tǒng)的實施方式能適應于SCI后的脊髓治療。但是，所述藥物傳遞系統(tǒng)的實施方式可以用在任何損傷或炎癥處。所述損傷或炎癥處可以是脊髓或外周神經(jīng)。用藥物傳遞系統(tǒng)進行治療的方法可以在細胞內(nèi)區(qū)域、細胞外區(qū)域、血管內(nèi)區(qū)域和/或細胞膜處進行。藥物傳遞系統(tǒng)的實施方式及其方法能解決炎癥帶來的有害影響，且這些實施方式可用于治療慢性炎癥、自身免疫性疾病、脊髓損傷(SCI)、中風、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循環(huán)休克、 慢性炎癥性疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、外周神經(jīng)切斷、神經(jīng)根壓迫(nerveroot impingment)和其他疾病或外傷性損傷。所述藥物傳遞系統(tǒng)是這樣的裝置，它含有基質(zhì)和一種或多種治療劑。所述治療的方法包括給藥該藥物傳遞系統(tǒng)。所述藥物傳遞系統(tǒng)包括但不限于以下基質(zhì)和治療劑的組合1)水凝膠+治療劑；2)水凝膠+多種治療劑的組合；3)顆粒+治療劑；4)顆粒+多種治療劑；5)水凝膠+顆粒+治療劑，其中，治療劑分布在水凝膠中、顆粒中或二者中均有；6)水凝膠+顆粒+多種治療齊U，其中，所述治療劑分布在水凝膠中、水凝膠內(nèi)的顆粒(可能是一組截然不同的顆粒)中，或二者中均有；以及7)水凝膠+顆粒+多種治療劑，其中，具體的多種治療劑分布在水凝膠中、水凝膠內(nèi)的顆粒(可能是一組截然不同的顆粒)中或二者中均有。所述顆粒既可以是微米顆粒也可以是納米顆粒。所述治療劑或多種治療劑能溶解或分散在水凝膠中、顆粒中、或水凝膠與顆粒中均有，從而通過擴散和/或溶解來實現(xiàn)控釋動力學。優(yōu)選基質(zhì)是可注射的，且所述藥物傳遞系統(tǒng)可以通過注射被傳遞到損傷處。但也可以通過其他的方法來給藥所述藥物傳遞系統(tǒng)，包括但不限于手術植入藥物傳遞裝置。所述水凝膠可以是熱敏性生物可降解組合物。本文使用的“熱敏性”指的是水凝膠在低于患者體溫的溫度和患者體溫之間會表現(xiàn)出溶膠-凝膠相變，或者聚合物的混合物在接近患者體溫的溫度下比在更低的溫度下更容易發(fā)生反應形成水凝膠。優(yōu)選所述患者為人類，體溫為37°C，所述更低的溫度可以是室溫(如22°C )。熱敏性水凝膠的臨界溫度可以接近患者的體溫，優(yōu)選為接近37°C。藥物傳遞系統(tǒng)中生物可降解的熱敏性水凝膠可以包括多嵌段共聚物。一個或多個聚合物嵌段可以是生物可降解的、生物相容的、或生物可降解且生物相容的。其中一些聚合物嵌段可以是生物可降解的，而其余的聚合物嵌段為生物相容的。優(yōu)選地，所述水凝膠的成分(如聚合物、單體或分解產(chǎn)物)為生物可降解的、生物相容的、或生物相容且可排出的。所述水凝膠可以含有能從體內(nèi)排泄出來的生物相容的聚合物嵌段。單體嵌段之間酯鍵是可水解的，并能在體內(nèi)發(fā)生降解以釋放出聚合物單體嵌段。含有酯鍵的聚合物是生物可降解的。酰胺鍵、酐鍵和醚鍵也可以是可水解的。這些鍵以及其他的在酶的作用、還原性條件(如，硫代酸酯鍵、硫醚鍵或二硫鍵)或者患者體內(nèi)目前條件下能發(fā)生降解的鍵都可以作為預計在水凝膠或顆粒中使用的聚合物。水凝膠可以含有帶醚鍵的乙二醇的聚合物嵌段、低聚乙二醇或聚乙二醇，他們都是生物相容且可排出的。乙醇酸、乳酸、甘油和癸二酸的聚合物是包括了上述聚合物的生物可降解的水凝膠。丙交酯、乙交酯、聚(甘油-共-癸二酸)(poly (glycerol-co-sebacic acid))共聚物是生物可降解的，并且這些聚合物中的一種或多種可以包括在水凝膠中。預計作為部分水凝膠的聚合物包括但不限于聚(甘油-共-癸二酸)丙烯酸酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)與聚(乙二醇)或低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯的多嵌段共聚物；和聚(甘油-共-癸二酸)與聚(乙二醇)，低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯或聚(N-異丙基丙烯酰胺)的接枝共聚物，乙氧基化三輕甲基丙燒三-3-巰基丙酸酯(ethoxylated trimethyIolpropanetri-3-mercaptopropionate)或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(poly (ethylene glycol)diacrylate)。這些聚合物具有熱敏性。水凝膠可以在物理條件發(fā)生改變時發(fā)生膨脹或收縮，這具有生理學上的重要性。 例如，溫度、PH或離子強度的改變能引起水凝膠發(fā)生膨脹或收縮。優(yōu)選地，注射到脊髓或其他損傷處的水凝膠平衡到損傷處的環(huán)境時不會發(fā)生顯著的膨脹。但是，藥物傳遞系統(tǒng)中也可以含有膨脹的水凝膠。可以將含有具有活性端基的乙二醇單體單元的親水性聚合物用作水凝膠或顆粒中的聚合物，所述活性端基包括但不限于丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、乙烯基、二酰肼基(dihydrazide)或硫醇基。可以使用丙烯酰氯(acrylochloride)、甲基丙烯酰氯(methacrylochloride)、氯乙烯來形成丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的端基。可以用巰基丙酸、半胱氨酸和胱胺來提供硫醇端基?？赏ㄟ^多種合成法(如開環(huán)聚合和活性自由基聚合)來生成用于基質(zhì)的聚合物。水凝膠可由共價和物理交聯(lián)的網(wǎng)絡組成。所述物理交聯(lián)指的是疏水嵌段的聚集。具有丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯、二酰肼或硫醇官能化的化合物的聚合物能夠與其他具有相容的活性端基的聚合物發(fā)生反應，從而形成水凝膠。丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和乙烯活性端基彼此相容并均與硫醇相容。硫醇和丙烯酸酯官能化的聚合物或聚合物嵌段能在溫和條件下(熱或光)發(fā)生反應以形成硫醇-醚。因此，硫醇和丙烯酸酯官能化的水溶性聚合物是用作藥物傳遞系統(tǒng)中水凝膠的合適候選者。某些水凝膠能在凝膠化后的平衡過程中發(fā)生膨脹或收縮，這可能是轉(zhuǎn)化不完全或由于要進行充分迅速的反應所需的反應劑的濃度比隨后在生理學條件下(如溫度、pH、離子強度)凝膠中的平衡濃度要高而造成的。鑒于其快速反應速率以及高水凝膠轉(zhuǎn)化度(extents of conversion to hydrogel),硫醇-丙烯酸酯官能化的聚合物是有吸引力的用作傳遞裝置的聚合物。藥物傳遞系統(tǒng)中使用的水凝膠可以通過混合具有相容的活性端基的聚合物來形成。優(yōu)選地，混合物包括含硫醇的聚合物和含丙烯酸酯的聚合物?；旌虾?，將混合物暴露在足夠的溫度或光照下，生成的硫醇-酯形成了水凝膠。優(yōu)選地，在患者體溫下比在低于患者體溫的溫度下更快地進行硫醇-酯的生成。舉例來說，硫醇-酯的生成在37°C處或附近比在22°C處或附近進行得更快。可以在給藥前或給藥過程中混合具有相容的活性端基的聚合物，優(yōu)選含有硫醇和含有丙烯酸酯的聚合物。在給藥過程中進行混合時，可以在注入的同時將所述聚合物進行混合，或通過連續(xù)或同時注射不同的聚合物來進行混合。所述混合物的一種非限制性實例包括乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的組合。藥物傳遞系統(tǒng)中的水凝膠的壓縮模量優(yōu)選與損傷處周圍組織的接近。例如，設計成向脊髓進行傳遞的藥物傳遞系統(tǒng)的壓縮模量可以與脊髓的壓縮模量接近。藥物傳遞系統(tǒng)中的水凝膠的孔隙率能與待釋放的治療劑的大小相匹配。若藥物傳遞系統(tǒng)中含500道爾頓的治療劑部分，水凝膠的篩孔就應該能允許500道爾頓的治療劑移動穿過凝膠。基質(zhì)可以包括含有顆粒的藥物，且所述顆粒是為了藥物的控釋動力學而被提供的。在一種優(yōu)選的實施方式中，可以將顆粒作為懸浮液注射到受損區(qū)域處，該區(qū)域可以是外周神經(jīng)或脊髓處。所述顆粒可以是微米顆粒，其大小約為1-1000微米。顆?？梢允羌{米顆粒，其大小約為1-1000納米。但可以根據(jù)具體應用來改變顆粒的尺寸。治療劑可以在顆粒上或顆粒內(nèi)，其濃度能有效地實現(xiàn)清除自由基、防止自由基形成或其他抵抗由一氧化碳相關的氧化應激產(chǎn)生的的毒性的作用。在優(yōu)選的實施方式中，顆粒中含有O. 1-30%重量/重量(藥物重量/顆粒與藥物重量之和)的治療劑，進一步優(yōu)選為1-30%重量/重量。所述 治療劑可以通過擴散、溶解和顆粒降解的機制得到釋放。顆粒可以是固體聚合物或凝膠。在一種優(yōu)選實施方式中，顆粒由生物可降解的、生物相容的聚合物制成，所述聚合物例如可以是聚酯。一種能作為顆粒的合適的聚酯為聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，它能通過酯水解而發(fā)生降解。其他合適的材料包括聚丙交酯、聚乙交酯以及聚(羧基苯氧基丙燒)-共-癸二酸)(poly (carboxyphenoxypropane)-co-sebacic acid)(如，購自 MGI 醫(yī)藥品公司的 gliadel wafer )。優(yōu)選地，顆粒的成分(如聚合物、單體或分解產(chǎn)物)是生物可降解、生物相容或生物相容且可排出的?？梢韵蛏鲜鼋M合中提供水凝膠或顆粒，從而能削弱在原位凝膠化過程中的釋放動力學。通過對釋放動力學的削弱，治療劑從顆粒和從水凝膠中釋放出來的速率可能有所不同。在一種優(yōu)選的實施方式中，不同的治療劑可以被包含在水凝膠或顆粒中，或不同類型的顆粒中，從而能使各種特定的治療劑以不同的速率得到釋放。在一種實施方式中，用治療劑對水凝膠或顆粒物質(zhì)進行功能化。可以通過任意類型的鍵來附著治療劑從而功能化顆粒。優(yōu)選地，使聚合物重復單元中的羧基或羥基通過酯鍵、酰胺鍵、醚鍵或縮醛鍵實現(xiàn)附著。在一種優(yōu)選實施方式中，功能性水凝膠含有附著在聚(甘油-共-癸二酸酯)丙烯酸酯(PGSA)上的治療劑。任何治療劑都能用來對水凝膠或顆粒進行功能化，但在一種優(yōu)選實施方式中，治療劑附著在水凝膠上且該治療劑為抗氧化劑。更優(yōu)選地，使抗氧化劑-抗壞血酸(維生素C)與α-生育酚(維生素Ε)附著到水凝膠上。當抗氧化劑維生素C和維生素E組合存在時，能使這兩種物質(zhì)得到循環(huán)利用以及增強抗氧化性能。可以使用其他治療劑的組合以實現(xiàn)在藥物傳遞系統(tǒng)中的循環(huán)利用。PGSA在溫和條件下能形成彈性網(wǎng)絡(自由基聚合反應)，其能防止抗氧化劑在處理中變性。此外，對PGSA采用熔融塑模(melt molding)或無固體形式的快速成型法(rapidprototyping techniques)可以形成任意幾何構型的框架。這能用來定制藥物傳遞系統(tǒng)以滿足特定的受損腔(lesion cavity)(或脊髓腫瘤腔)，從而改善治療損傷(可以是SCI或外周神經(jīng)損傷)的手術干預。下表I列舉了以下示例性的7種藥物傳遞系統(tǒng)的組合制劑1)水凝膠+治療劑；2)水凝膠+多種治療劑的組合；3)顆粒+治療劑；4)顆粒+多種治療劑；5)水凝膠+顆粒+治療劑，其中，治療劑分布在水凝膠中、顆粒中、或二者中均有；6)水凝膠+顆粒+多種治療劑，其中，所述多種治療劑分布在水凝膠中、水凝膠內(nèi)的顆粒(可能是一組截然不同的顆粒)中、或二者中均有；以及7)水凝膠+顆粒+多種治療劑，其中，具體的多種治療劑分布在水凝膠中、水凝膠內(nèi)的顆粒(可能是一組截然不同的顆粒)中、或二者中均有。表I

水凝膠Ie治療劑其他成分
^nn甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉.
全日入 I 25 重里0/^!!^!31300，/,,,·,PBS, pH 7.4
口 25 重量％PEGDA400 (methylpredmsolone sodmm 水____succinate;； 0.1 m.m.%__
組么 2 25ΜΜ%ΕΤΤΜΡ1300, 皮質(zhì)醇玻拍酸鈉’ PBS, pH 7.4^ ° 25重景腦DA400__二甲胺里四。環(huán)素’ O」重量。/。水_
組合3MooA^foi 皮質(zhì)醇玻拍酸鈉，
PLGA微米顆粒， 甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉，
組合41-100微米，10重量0.1重量％
___%__二甲胺四環(huán)素，0.1重量％__
組合5 25重量°/疋丁丁]^丨300,甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉，PBS, pH 7.4
25重量％PEGDA400 1%1°°微米’ 10重里0.1重量％水
PLGA微米顆粒, 甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉，IZ~.組合6 IlVfpZZZ剛微米’H)重量0.〗重量％ :kBS’PH7.4_ 25 fim%PEGDA4QQ %_ 二甲胺四環(huán)素，0.1 重量％ 7X_
,a 9 *^.0/ρττΛ.ρ1.ΛηPLGA微米顆粒，甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉，pR .
組合 7 25 重里％￡丁丁1^1300,s且 ο I 莆畺。/PBS, pH 7.4
25 S*%PEGDA4001_剛砝術，10 重里 0.1 蚩里。/。
里星%__二甲胺四環(huán)素，0.1重量％爪_表I所示實施例中，重量％按成分的重量除以組合(包括其他成分)的總重進行計算。PBS, pH 7. 4指的是pH等于7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水，它含有144mg/L(l. 06mM)的磷酸二氫鉀(KH2PO4,136g/mol),9000mg/L (155. 17mM)的氯化鈉(NaCl, 58g/mol)和 795mg/L (2. 97mM)的磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 7H20)。任何能起到自由基清除劑或消炎劑作用的分子都是藥物傳遞系統(tǒng)的候選治療劑。該分子優(yōu)選為小分子。優(yōu)選地，所述治療劑能減少體內(nèi)位置的自由基的數(shù)目和/或減少自由基的生成。所述藥物傳遞系統(tǒng)可以含有一種以上的治療劑的組合。所述治療劑可以為抗氧化劑、類固醇(steroid)或它們的組合。在一種優(yōu)選實施方式中，所述治療劑包括一種或多種選自由一種抗氧化劑或多種抗氧化劑、坦波爾(4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-I-氧基)、尿酸、二甲胺四環(huán)素、甲基脫氫皮質(zhì)醇、MnTBAP(錳(III)四(4-苯甲酸)卟啉)和地塞米松所組成的組中的物質(zhì)。所述抗氧化劑可以是但不限于抗壞血酸或α-生育酚。藥物傳遞系統(tǒng)中還可以提供能互相重復利用彼此的治療劑組合。例如，抗壞血酸(維生素C)和α_生育酚(維生素Ε)可以組合使用以重復利用彼此并增強抗氧化性能。所述治療劑并不限于上述物質(zhì)。藥物傳遞系統(tǒng)中可以含有的治療劑的非限制性實例包括NOS或NO產(chǎn)物的抑制劑、抗氧化劑、自旋捕獲劑(spin trap)和過氧亞硝基清除劑。
可以提供在藥物傳遞系統(tǒng)中的NOS或NO產(chǎn)物的抑制劑的非限制性列表包括1400W(N-(3-(氨甲基)芐基)乙脒)；放線菌素 D(actinomycin D) ；AET(C3H11Br2N3S)；ALLM (N-乙?；?亮氨酸-亮氨酸-蛋氨酸(N-acety 1-Leu-Leu-Met)) ；ALLN (N-乙?；?亮氨酸-亮氨酸-正亮氨醒(N-acetyl-Leu-Leu-Norleucinal)) ；NG-烯丙基-左旋精氨酸；氨基胍、半硫酸鹽(hemisulfate) ; 1_氨基_2_輕胍；對甲苯磺酸鹽；2_氨基-4-甲基批P定;AMITU(1_ 氨基-S-甲基異硫服(1-amino-S-methylisothiourea)) ;AMT(2_ 氨基-5,6_ 二氫-6-甲基-4H-1, 3-喔嚷(2-Amino-5,6-dihydro-6-methyl-4H-l, 3-thiazine))；S-節(jié)基異硫脲；甲磺酸溴隱亭(bromocriptine mesylate) ;L_刀豆氨酸硫酸鹽；洋刀豆(canavalia ensiformis);氯丙嗪、鹽酸鹽；姜黃素；姜黃(curcuma longa L);環(huán)己酰亞胺；高純度環(huán)己酰亞胺；環(huán)孢菌素；地塞米松、2，4_ 二氨基-6-羥基嘧啶；#，#-二甲基-左旋精氨酸；NG, NG1-二甲基-左旋精氨酸；二亞苯基碘鐵(diphenyleneiodonium) ;DMHP(二甲庚基卩比喃(dimethylheptylpyran))、S (-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯；S_乙基-N-苯基異硫服；2_ 乙基 _2-硫代假服(2-ethyl-2-thiopseudourea) ;ETPI (S-乙基-N-[4-( 二氣甲基)苯基]異硫服(S-Ethyl N-[4-Triflurormethyl)phenyl] isothiourea));喊性成纖維細胞生長因子；牛堿性成纖維細胞生長因子；重組人堿性成纖維細胞生長因子、GED(雙 (2-胍乙基二硫化物(bis-(2-guanidoethyl)-disulfide));氟哌唳醇(haloperidol)；L-N6-(I- 二乙酰氧乙基)賴氨酸(L-N6-(I-Iminoethyl) lysine)、二鹽酸鹽；L_N5-(1- 二乙酸氧乙基)鳥氨酸(L-N5-(I-Iminoethyl) ornithine) ；LY83583 ；LY231617 ;MEG(乙二醇)；褪黑激素；S-甲基異硫脲硫酸鹽；S-甲基-L-硫瓜氨酸(S-methyl-L-thiodtrulline)、二鹽酸鹽；Ne-單乙基-左旋精氨酸；Ne-單甲基右旋精氨酸一醋酸鹽；Ne-單甲基左旋精氨酸的DiHABS ( 二 -羥基偶氮苯-P,磺酸酯)鹽；Ne-單甲基左旋精氨酸；Ne-單甲基左旋精氨酸的一水合HABS鹽；Ne-單甲基左旋高精氨酸；菌酹酸(mycophenolic acid)、L-NIL ;可誘導的一氧化氮合成酶抑制劑套裝(Calbiochem );神經(jīng)元一氧化氮合成酶抑制劑套裝(set) (Calbiochem ) ；NG-硝基右旋精氨酸；NG-硝基左旋精氨酸；NG-硝基右旋精氨酸甲酯；NG-硝基左旋精氨酸甲酯；對氯化硝基四氮唑蘭(p-nitrolue tetrazolium chloride)；
7-硝基吲唑；7-硝基吲唑的鈉鹽；3_溴-7-硝基吲唑；3_溴-7-硝基吲唑的鈉鹽；N0S抑制劑套裝(Calbiochem )、1，3-PBITU ;羥乙磺酸戊氧苯脒；PPM_18 ;NG-丙基-左旋精氨酸；I-卩比咯燒二硫代羧酸(l-pyrrolidinecarbodithioic acid) ;SKF_525A ;SKF_96365 ;水楊酸鈉；亞精胺；三鹽酸亞精胺；精胺；四鹽酸精胺；L-硫瓜氨酸；N°-甲苯磺?；嚢彼崧燃淄?Na_tosyl_Lys chloromethyl ketone) ;Na-甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲酮(Na -tosyl-Phe chloromethyl ketone) ；TRIM (tripartite motif,三結(jié)構域蛋白)；以及原卟啉IX鋅(II)。藥物傳遞系統(tǒng)中可以含有NOS或NO產(chǎn)物的一種抑制劑或多種抑制劑的藥學可接受鹽?？梢蕴峁┰谒幬飩鬟f系統(tǒng)中的抗氧化物的非限制性列表包括N-乙酰基-L-半胱氨酸；N-乙?；?S-法尼基-L-半胱氨酸；AG 1714;鹽酸氨溴索；抗氧化劑套裝(Calbiochem ) ;L_抗壞血酸；膽紅素、膽紅素游離酸、咖啡酸、CAPE ;卡諾醇(carnsol)；(+)-兒茶酚；血漿銅藍蛋白；人血漿銅藍蛋白；腔腸素；二異丙基水楊酸銅；甲磺酸去鐵胺；R-(-)_鹽酸芐甲炔胺;DMNQ ；DTPA ;雙酐；依布硒啉(ebselen);鞣花酸；脫水鞣花酸；(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯；L-麥角硫因；二水EUK-8 ;去鐵鐵蛋白(apo-ferritin)、馬脾去鐵鐵蛋白；無鎘鐵蛋白；馬脾無鎘鐵蛋白；人肝鐵蛋白；重組人鐵蛋白H-鏈；重組人鐵蛋白L-鏈；芒柄花黃素；還原型谷胱甘肽；還原型谷胱甘肽游離酸；谷胱甘肽單乙酯；α -硫辛酸；二氫-DL-α -硫辛酸(dihydro-DL-α-Iipoic acid));毛地黃黃酮(Iuteolin)、LY 231617 ;青霉胺；MCI_186 ;MnTMPyP、桑色素水合物；NC0-700 ；NDGA ;對氯化硝基四氮唑蘭；0_淳索克斯(Ο-trensox);丙基沒食子酸；白藜蘆醇；迷迭香酸；(+)_蕓香苷水合物；水飛薊素類(silymarin group) ;L_光千金藤定堿(L-stepholidine);河谷地不容(stephania intermedica) ;(±)_紫杉葉素；粉防己堿；DL-硫辛酸；硫氧還蛋白；重組人低內(nèi)毒素硫氧還蛋白(human recombinant low endotoxin thioredoxon);硫氧還蛋白II ;酵母硫氧還蛋白II ;重組酵母硫氧還蛋白II ;DL-a-生育酚；生育酚套裝(Calbiochem ) ;DL_ α -生育酹醋酸酯、生育三烯酸套裝(Calbiochem )、Trolox ;U-74389G ；U-83836E ;尿酸；和維生素E琥珀酸酯。藥物傳遞系統(tǒng)中可以含有一種抗氧化劑或多種抗氧化劑的藥學可接受鹽?？捎糜谒幬飩鬟f系統(tǒng)的自旋捕獲劑試劑包括但不限于N-叔丁基-α苯基硝酸靈、坦波爾和DTCS(鐵(II)N-(二硫代羧酸)肌氨酸Fe2+)。藥物傳遞系統(tǒng)中可以含有一種自 旋捕獲劑或多種自旋捕獲劑的藥學可接受鹽。可用于藥物傳遞系統(tǒng)的過氧亞硝基清除劑包括但不限于依布硒啉；FeTMPyP ；FeTPPS ;還原型谷胱甘肽；還原型谷胱甘肽游離酸；褪黑激素；MnTBAP ；MnTMPyP ;L_硒代蛋氨酸；和Trolox 。藥物傳遞系統(tǒng)中可以含有一種或多種過氧亞硝基清除劑的藥學可接受鹽。可以提供任意濃度的能有效清除自由基、防止自由基形成或能緩解一氧化氮相關應激的毒性的治療劑。優(yōu)選地，所述治療劑在藥物傳遞系統(tǒng)中的濃度為O. 1-30% W/V(藥物的質(zhì)量/藥物傳遞系統(tǒng)的體積)。所選擇的治療劑在藥物傳遞裝置中的濃度列于下表2中。表 2
治療劑建議的濃度范圍建議的濃度
維生素 C0.1-30%(w/v)0.1%(w/v)
維生素C和 ；0.1-30%(w/v)|^]維生素C 0.2%(w/v)(0.1%的維生素C維生素E 和0.1-30%(w/v)的維生素E 和0.1%的維生素E)坦波爾0.1-30%(w/v)0.1%(w/v)
_尿酉愛__0.1-30%(w/v)__O. I %(w/v)
二甲胺四環(huán)素0.1-30%(w/v)0.1%(w/v)
甲基脫氫皮質(zhì)醇0.1-30%(w/v)~0.1%(w/v)
MnTBAP__0.1—30%(w/v)__0.1%(w/v)_
地塞米松0.1—30%(w/v)0.1%(w/v)藥物傳遞系統(tǒng)可以含有例如載體等的藥物添加劑。本文使用的術語“載體”包括可接受的佐劑和載劑(vehicles)。藥用可接受載體可以選自下列清單中的那些但不僅限于此離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白、人血清清蛋白、緩沖物質(zhì)、磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)、精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素系物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、蠟、和聚乙二醇?？梢詫⒅委焺┨峁┰谛×康淖鳛檩d體的稀釋劑中。例如，Iml的甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉(即孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮，21-(3-羧基-I-氧代丙氧基)-11，17_ 二羥基-6-甲基一鈉鹽，(6 α，11β)(分子量496. 53))治療劑溶液可以含有40mg的甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉；1. 6mg的無水磷酸二氫鈉；17. 46mg的干燥的磷酸氫二鈉；25mg的含水乳糖(lactose hydrous);和8. 8mg的苯甲醇作為防腐劑?？梢栽谛枰獣r調(diào)整各配方的pH值。例如，可以加入氫氧化鈉從而使添加后的溶液PH在7-8范圍內(nèi)，并對于40mg/mL的甲基脫氫皮質(zhì)醇琥拍酸鈉溶液來說，張力(tonicity)為O. 50容積滲克分子(osmolar)?？梢詫⒒|(zhì)內(nèi)的環(huán)境設計成與稀釋劑或與向基質(zhì)中加入治療劑之前治療劑存在的溶液相同、接近或者不同。例如，可以將Iml體積的含甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉的基質(zhì)設計成含有與上述作為稀釋劑的含量相同的的甲基脫氫皮質(zhì)醇琥珀酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、含水乳糖、苯甲醇、PH和稀釋劑水。也可以使用其他的稀釋劑?？梢詫⒅委焺┨峁┰谌魏嗡幱每山邮茌d體中。例如，可以將治療劑提供在緩沖稀釋劑中，如磷酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖鹽水。
可以通過使聚合物溶解或浸泡在治療劑溶液中來組裝藥物傳遞系統(tǒng)。當使用不同顆粒的組合或顆粒和水凝膠的組合時，基質(zhì)成分能以混合或獨立的形式與治療劑接觸。若針對各種顆粒、不同子集的顆?；蛩z使用不同的治療劑，這些成分可以在使所有的聚合物成分組合在一起之前分別接觸治療劑。已經(jīng)開發(fā)了降解、藥物釋放以及體內(nèi)分布的計算模型，來預測藥物傳遞系統(tǒng)的時空藥物曲線上不同的設計參數(shù)的效果。所述參數(shù)包括聚合物組成、分子量、多分散性、藥物類型、藥物大小、藥物-聚合物相互作用和藥物傳遞系統(tǒng)的幾何結(jié)構。如下文實施例7中所述地，混合了作為水凝膠的■為400g/mol的聚(乙二醇)二丙烯酸酯和麗為11，600g/mol的PLGA聚合物的欄=1300g/mol的乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯是一個非限制性實施例，該實施例中的水凝膠與顆粒的參數(shù)適合作為藥物傳遞系統(tǒng)的一種實施方式。藥物傳遞系統(tǒng)中也可以使用其他參數(shù)的水凝膠和顆粒?？梢詫⑺幬飩鬟f系統(tǒng)從損傷或炎癥處區(qū)域注射到患者體內(nèi)，或者使其沉積到通過手術而暴露的區(qū)域的位置內(nèi)或該位置上。通過注射(而非手術介入)，藥物傳遞系統(tǒng)可以以侵害性最小的方式進行給藥。在一種優(yōu)選實施方式中，僅需要進行一次給藥來維持持續(xù)劑量。因此，可以直接使藥物傳遞到損傷或炎癥位點上，從而最小化因全身給藥造成的副作用。優(yōu)選但非排除性地，可以在該方法中采用乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的組合制成的水凝膠。所述藥物傳遞裝置的非限制性實例已在表I中列出。一種治療的方法為將藥物傳遞系統(tǒng)注射到脊髓挫傷損傷內(nèi)。該方法可以通過硬膜內(nèi)髓內(nèi)注射來實現(xiàn)。藥物傳遞系統(tǒng)通過注射或植入的方式進入脊髓，藥物或藥物傳遞系統(tǒng)成分都不能穿過硬脊膜，且藥物不能穿過血腦屏障。優(yōu)選地，將藥物傳遞系統(tǒng)設計成能與病理生理性升高同步地在持續(xù)時間段內(nèi)釋放治療劑，從而能暫時地保持損傷處的自由基和自由基產(chǎn)物(部分由于小膠質(zhì)細胞的活化以及嗜中性粒細胞浸潤)的水平。優(yōu)選但非排除性的是，可以在該方法中采用乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的組合制成的水凝膠。所述藥物傳遞裝置的非限制性實例已在表I中列出。
在一種優(yōu)選實施方式中，將藥物傳遞系統(tǒng)設計成能在治療過程中通過水解發(fā)生降解，并能在不借助進一步手術介入的前提下，自體通過正常途徑排出。優(yōu)選但非排除性的是，可以在該方法中采用乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的組合制成的水凝膠。所述藥物釋放裝置的非限制性實例已在表I中列出。潛在藥物傳遞系統(tǒng)測試可以用本領域公知方法對治療劑、基質(zhì)及其組合進行測試。可以在體外使用一系列的一氧化氮供體(如SIN-I鹽酸鹽)來產(chǎn)生穩(wěn)定水平的過氧亞硝基以及由于過氧亞硝基產(chǎn)生的自由基。繼而，可以采用多種方法(如改良的格里斯試劑(Griess Reagent))通過測量亞硝酸鹽來測定抗氧化劑的活性。典型商購的格里斯試劑為其中含O. 2%的萘二胺二鹽酸鹽(naphthylenediamine dihydrochloride)和2%的對氨基苯磺酰胺的5%的磷酸?？梢允褂脺y量細胞膜完整性的乳酸脫氫酶(LDH)的線粒體活性的MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)或MTS (單溶液細胞增殖分析)分析來測定細胞的體外完整性。參見 Mosmann, T. (1983) Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth andSurvival !Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays (細胞生長和存活 的快速比色分析對增殖和細胞毒性分析的應用).J. Immunol. Meth. 65，55-63 ;和Wilson，A.P. (2000)Cytotoxicity and Viability Assays in Animal Cell Culture :A PracticalApproach(對動物細胞培養(yǎng)物的細胞毒性與生存能力的分析一種實踐的方法)，第三版.(Masters，J. R. W.編輯)牛津大學出版社牛津大學2000，第一卷，通過引用將上述文獻的全部引入本文。還可以測試藥物傳遞系統(tǒng)減少細胞死亡或體外細胞膜損害，以及消除由供體(如SIN-1)產(chǎn)生的亞硝酸鹽的能力。可以在體內(nèi)研究后，通過免疫染色或使用針對過氧亞硝基氧化應激的標記物來測定治療劑、基質(zhì)或藥物傳遞系統(tǒng)的效力。所述標記物包括但不限于3-硝基酪氨酸和4-羥基壬烯醛。大鼠遭受中等挫傷損傷后由過氧亞硝基帶來的氧化損傷在空間和時間上的特征已在 Xiong, Y、Rabchevsky, A. G.和 Hall, E. D. (2007)Role of peroxynitrite insecondary oxidative damage after spinal cord injury (過氧亞硝基在脊髓損傷后的二次氧化損害中的作用).J. Neurochem. 100 (I), 639-649 ( “Xiong等人”)中進行了描述,將該文獻的全部引入本文。Xiong等人提出了 3-硝基酪氨酸-過氧亞硝基的特異性標記物在較早時間點上(1-3小時)迅速聚集，并與假手術大鼠相比，3-硝基酪氨酸的顯著增加持續(xù)到損傷后I周。此外，Xiong等人還指出了與之一致并持續(xù)增長的與蛋白氧化有關的蛋白羰基的水平與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的4-羥基壬烯醛的水平。在損傷后24小時時觀察到3-硝基酪氨酸和4-羥基壬烯醛的峰值增強。在免疫組化結(jié)果中，Xiong等人指出3-硝基酪氨酸和4-輕基壬烯醒的同位性(co-localization)說明了過氧亞硝基參與了脂質(zhì)過氧化和蛋白硝化損害。氧化損害的另一結(jié)果是使細胞內(nèi)鈣超載增劇，這會激活半胱氨酸蛋白酶鈣蛋白酶從而導致多個細胞內(nèi)的目標，包括細胞骨架蛋白U-血影蛋白)，發(fā)生降解。Xiong等人通過對α-血影蛋白分解產(chǎn)物的分析還發(fā)現(xiàn)，特異地由鈣蛋白酶產(chǎn)生的α-血影蛋白的145千道爾頓的碎片在損傷后I小時后馬上顯著增加，盡管峰值增強在損傷后72小時候才出現(xiàn)。Xiong等人由此推斷鈣蛋白酶的后期活化作用很可能與過氧亞硝基介導的鈣穩(wěn)態(tài)的二次氧化損害有關。Xiong等人記載了可以用作標記物測試的候選治療劑、基質(zhì)及其組合?？捎酶鞣N方法對標記物進行測定，包括Xiong等人描述的方法。在Xiong等人描述的方法中包括的外傷性脊髓挫傷大鼠模型，對3-硝基酪氨酸和4-羥基壬烯醛的免疫印跡法分析、對α -血影蛋白分解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡(western blotting)、以及統(tǒng)計分析如下。外傷性脊髓挫傷大鼠模型根據(jù)Xiong等人，其中記載的所有研究均使用體重為200_225g 的年輕雌性成年 Sprague-Dawley 大鼠(Charles River,Portage,Ml,美國)。這些動物處于隨機的生理周期，但在發(fā)情期階段不對其進行測試。隨意地對它們進行喂食和喂水。對TlO椎骨進行椎板切除術前,用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)對大鼠進行麻醉。用 Infinite Horizon 裝置來造成脊髓損傷(Scheff, S. ff.、Rabchevsky, A. G.、Fugaccia,I>Main,J. A.和Lumpp,J. E. Jr. (2003)Experimental modeling of spinal cordinjury characterization of a force-defined injury device (脊髓損傷實驗建模對規(guī)定力損傷裝置的描述).J. Neurotrauma 20,179-193),通過引用將該文獻的全部引入本文)，該裝置用不銹鋼頭的蓄力器(impounder)迅速施加規(guī)定力的沖擊,從而對暴露的脊髓造成實質(zhì)性的挫傷損傷。小心地進行椎板切除術，稍大于2. 5mm的沖擊器末端。用鉗狀骨針夾緊有喙的T9和尾側(cè)Tll椎體來固定脊柱。將脊柱與暴露的脊髓小心的排列在同一水平面上。在沖擊過程中，步進電機推動成對的齒條向暴露的脊髓造成挫傷損傷。施加到脊髓上的力量為200千達因，造成了中等嚴重程度的損傷。沖擊裝置與PC相連，由PC記錄蓄 力器的速度、實際力量以及脊髓的位移。在手術后不同時間點(I小時、3小時、6小時、24小時、48小時、72小時和I周)，
將第一組的動物(每個時間點6只大鼠)用過量戊巴比妥鈉(150mg/kg)殺死。通過椎板切除術迅速地移除包括沖擊中心的20mm的脊髓部分。將得到的組織在冷凍臺上解剖并迅速轉(zhuǎn)移到含有800μ L的Triton裂解緩沖液[20mmol/L的三(羥甲基)氨基甲烷HCl (Tris-HCl)、150mmol/L 的 NaClU % 的 Triton X-100、5mmol/L 的 EGTAUOmmoI/L 的EDTA、20mmol/L的HEPES、10%的甘油溶液和蛋白酶抑制混合劑(Roche有限公司，Nutley，NJ,美國)]的離心管中，并進行短時的超聲處理。去膜(dismembranation)后,將脊髓組織樣品在4°C下以15000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心I小時，收集上清液，用蛋白測定試劑盒(PierceBiotechnology有限公司，Rockford, IL,美國)測定蛋白質(zhì)水平，然后將樣品歸一化至I μ g/ μ L并在測定前儲存在_80°C。用窄縫免疫印跡法(slot immunoblotting)對氧化損害進行評價。將2yg的蛋白樣品加樣到窄縫-印跡設備上測量最佳抗體結(jié)合靈敏度。用兔的多克隆抗 HNE 抗體(I 5000 ；Alpha Diagnostics 國際有限公司，San Antonio, TX, ^國)來實現(xiàn)脂質(zhì)過氧化。用兔的多克隆抗硝基酪氨酸抗體(I 2000 ；Upstate USA有限公司，Charlottesville，VA，美國)來獲得過氧亞硝基產(chǎn)生的3-硝基酪氨酸。使用氧化印跡技術(Oxy-Blot蛋白氧化檢測試劑盒；Chemicon International, Temecula, CA,美國)來檢測蛋白氧化。用Li-Cor奧德賽(Odyssey)紅外成像系統(tǒng)(LI-C0R Biosciences,Lincoln,NE，USA)來分析窄縫印跡分析，它使用了 IRDye800-共軛的山羊-抗-兔IgG(l 5000 ；Rockland, Gilbertsville, PA,美國)作為第二抗體。先進行初步研究來確定每組氧化標記密度計量學(densitometry)曲線的線性范圍，由此證實得到的密度計量學讀數(shù)沒有超出精確量化的范圍。3-硝基酪氨酸與4-羥基壬烯醛的免疫組化根據(jù)Xiong等人，在手術后不同時間點(I小時、3小時、6小時和24小時)，將第二組的動物過量給用戊巴比妥鈉(150mg/kg)，并依次用150mL的O. lmol/L的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和其中含有4%的多聚甲醛的200mL的PBS (pH =7. 4)進行灌注。在不同的時間點切下以損傷中心為圓心的5mm脊髓片斷，形成橫截面圖。損傷24小時候切下包括受沖擊處的15mm的脊髓片斷，形成縱截面圖。采集完畢后，將脊髓浸入含4%多聚甲醛的PBS中4小時。然后將該組織轉(zhuǎn)移到PBS中整夜，并在磷酸鹽緩沖的20%蔗糖溶液中冷藏2天。從橫向平面或縱向平面將脊髓制成20 μ m切片，并且將每第五個切片直接放在Superfrost plus載玻片(Fisher Scientific國際有限公司，漢普頓，NH，美國)上。收集完所有的脊髓切片后，將載玻片置于托盤上，并在4°C下儲存以整夜脫水，然后將其儲存在_20°C下直到染色。染色當天，將冷凍的載玻片從_20°C中取出并在20°C下解凍30分鐘。用O. 2mol/L的PBS進行漂洗后，將切片含3%過氧化氫的O. 2mol/L的PBS中孵育30分鐘，然后在封閉緩沖液(含5 %的山羊血清，O. 25 %的Triton-X，I %奶粉的O. 2mol/L的PBS)中孵育I小時，接著與兔多克隆抗_4_羥基壬烯醛(I 5000)或抗-3-硝基酪氨酸抗體(I 2000)接觸整夜。第二天將切片在20°C下與生物素化的山羊-抗-兔第二抗體(I : 200, Vector ABC-AP 試劑盒；Vector Labs, Burlingame, CA, USA)孵育2小時。漂洗后，將切片與VECTASTAIN ABC試劑(抗生物素蛋白DH和生物素化辣根過氧化物酶，Vector Labs)孵育I小時,接著用維克多布魯法(Vector blue method)在黑暗處進行 10-30分鐘的染色(Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate試劑盒；VectorLabs)。反應后,用核快紅(nuclear fast red)對脊髓切片進行復染色(Vector Labs),脫 水后用 Olympus Magnafire 數(shù)碼相機(Olympus America 有限公司，Melville, NY, USA)拍下其在Olympus Provis A70顯微鏡下的照片。對α-血影蛋白分解產(chǎn)物的蛋白印跡法=Xiong等人指出將15微克的樣品在含三(輕甲基)氨基甲燒醋酸鹽電泳緩沖系統(tǒng)(running buffer system)的十二燒基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠[3-8% (w/v)丙烯酰胺，Bio-rad Criterion XT預制膠]上跑電泳，然后通過半干電轉(zhuǎn)移單元(Bio-Rad實驗室，Hercules, CA，美國)在20mA，15分鐘下將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用小鼠單克隆抗α-血影蛋白抗體對印跡進行探測(I 5000，Affiniti 有限公司，F(xiàn)t. Lauderdale, FL,美國:Biomol International, LP Plymouth,PA，USA的部分)，該探針能識別針對280千道爾頓的母α -血影蛋白以及每一個150千道爾頓和145千道爾頓的蛋白水解片斷上的抗原決定部位。與第一抗體接觸后，在黑暗中使用IRDye800-共軛的山羊-抗-小鼠IgG(I 5000 ；Rockland)第二抗體處理I小時。使用Li-Cor奧德賽紅外成像系統(tǒng)進行蛋白印跡的成像分析，以定量分析145千道爾頓和150千道爾頓的α-血影蛋白分解產(chǎn)物(SBDP 145與SBDP 150)的量。每一個蛋白印跡包括標準化蛋白上樣對照，以允許參考印跡和印跡之間的強度差進行校準。在其他研究中也使用了這種定量的方法((Kupina, N. C, Nath R, Bernath Ε. Ε.，Inoue J.，MitsuyoshiA. , Yuen, P. ff. , Wang, K. K.和 Hall E. D. (2002)Neuroimmunophilin ligand V-10,367is neuroprotective after 24-hour delayed administration in a mouse model ofdiffuse traumatic brain injury(在彌散性外傷性腦損傷小鼠模型中進行24小時延遲給藥后，神經(jīng)免疫親和素配體V-10,367具有神經(jīng)保護性).J. Cereb. Blood Flow Metab. 22，1212-1221 ；Hall E. D. , Sullivan, P. G. , Gibson, T. R. , Pavel, K. M. , Thompson, B. M.和Scheff, S. ff. , (2005)Spatial and temporal characteristics of neurodegenerationsafter controlled cortical impact in mice more than a focal brain injury(對小鼠進行受控腦皮層沖擊后的神經(jīng)退行性變的時空特性不僅是中心腦損傷).J. Neruotrauma22，252-265，將上述兩篇文獻的全部內(nèi)容引入本文。統(tǒng)計分析=Xiong等人采用了定量密度計量學分析來讀出窄縫印跡和蛋白免疫印跡分析。使用STATVIEW軟件包(JMP Software，Cary，NC，美國)來進行統(tǒng)計分析。所有的數(shù)值被表示為平均數(shù)土SEM。先進行雙因素方差分析法(two-way analysis ofvariance)。如果對變量的分析反映了顯著性(p<0.05)效果，則進行事后測試(post hoctesting),利用 F 測驗保護最小顯著差數(shù)法(Fisher' s protected least significantdifference (PLSD)),比較個體外傷后的時間點和假手術、未受傷組的時間點。在所有情況下，P < O. 05被認為是顯著的。采用Xiong等人列舉的以及上文描述的測試，能對任何治療劑、基質(zhì)或藥物傳遞系統(tǒng)進行測試。治療劑、基質(zhì)或藥物傳遞系統(tǒng)可以通過手術植入或者在SCI后通過注射植入，然后可以繼續(xù)進行標記物測試(如Xiong等人中記載的)。同樣地，可以對免疫應答標記物(如Glial Fibrilary酸性蛋白(GFAP))進行監(jiān)測以追蹤炎癥應答?？梢詫φ麄€損傷范圍用蘇木精或曙紅進行染色以監(jiān)測治療的效果。
本文描述的基質(zhì)可以單獨使用、接種細胞使用、與藥物結(jié)合使用或與其他聚合物共混使用以得到最優(yōu)化的功能?？梢宰顑?yōu)化的功能包括降解速率、機械性能以及小尺寸特征。最優(yōu)化的方法包括將顆粒、水凝膠或顆粒與水凝膠配置成可注射支架(scaffold)的至少一部分，該可注射支架可作為假體或組織工程學位點。水凝膠和/或顆粒能攜帶細胞、藥物或其他有利于組織工程學的聚合物。顆粒和/或水凝膠可以含有多肽序列來促進細胞粘著(如RGB或IKVAV)，該多肽序列可以通過交聯(lián)作用而引入聚合物網(wǎng)絡成為聚合物單體的一部分，或被物理約束在網(wǎng)絡中。美國專利號NO. 5，759，830 ；N0. 5, 770, 417 ；NO. 5，770，193 ；N0. 5，514，378 ；N0. 6，689，608 ；N0. 6，281，015 ；N0. 6，095，148 ；NO. 6，309，635 ;和NO. 5，654，381中涉及了聚合物的合成、使聚合物最優(yōu)化、將聚合物接種細胞、以及組織支架的制備，在此，通過引用將這些專利中記載的全部內(nèi)容引入本文。雖然對脊髓損傷進行治療代表了一種優(yōu)選實施方式，本藥物傳遞系統(tǒng)還可以用來治療外周神經(jīng)損傷、中風、心肌梗死、慢性心力衰竭、糖尿病、循環(huán)休克、慢性炎癥性疾病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病。本藥物傳遞系統(tǒng)還可以用來治療的其他疾病包括但不限于在 Pacher, P. , Beckman, J. S. , Liaudet, L. (2007)Nitric oxide and peroxy nitrite inhealth and disease (健康與患病人群中的一氧化氮和過氧亞硝酸鹽).Physiol. Rev. 87,315-424中進行了記載的那些，通過引用將該文獻記載的全部內(nèi)容引入本文。為了對這些病況(包括脊髓損傷)中的任何一種進行治療，將所述藥物傳遞系統(tǒng)給藥在由疾病引起的損傷部位處。給藥可以通過各種方式，包括但不限于手術植入或注射。本領域技術人員可以理解的是，兩種或多種的上述實施方式可以是彼此相容的并且可以互相組合實施。在另一種替代實施方式中，可以按上文描述將自由基清除劑(如抗壞血酸)加入基質(zhì)中，且該組合能作為食品和包裝工業(yè)中的防腐劑加以利用。比如說，能將可食用的抗氧化劑提供在可食用的基質(zhì)中，優(yōu)選將維生素C提供在聚乳酸系聚合物基質(zhì)中。實施例實施例I-多嵌段共聚物的合成PGA-PEG_PGA(聚(乙交酯)_b_聚(乙二醇)-b_聚(乙交酯))
該聚合物為熱敏性嵌段共聚物的實例，它含有共聚在親水性聚合物兩端的疏水性端基。它是一種用作熱敏性水凝膠的兩親性三嵌段共聚物。該例中，通過開環(huán)聚合來構建疏水性的端鏈。材料I 克的聚乙二醇，MW 4000 = O. 00025mol ；O. 05mol的乙交酯=5. 805克的乙交酯；以及辛酸亞錫作為催化劑，O. 025重量％= I. 7mg的辛酸亞錫，密度=I. 251g/mL, I. 36微升方法I、將干燥的PEG與乙交酯置于烘干的schlenk燒瓶內(nèi)，在真空下用攪拌棒攪拌40 分鐘。2、使PEG與乙交酯在150°C下熔融，逐滴加入15微升含催化劑的丙酮。3、將該反應進行到熔融物變成琥珀色且具有粘性為止。實施例2-多嵌段共聚物的合成PLGA-PEG_PLGA(聚(丙交酯-共-乙交酯)_b_聚(乙二醇)-b-聚(丙交酯-共-乙交酯))這是另一個用于熱敏性水凝膠的兩親性三嵌段共聚物的實例。材料PEG-4000 0. 000125mol，0. 5g ；乙交酯0.00625mol，O. 725625g ；D, L-丙交酯0. 00625mol,0. 9008125g ;以及辛酸亞錫作為催化劑總進料的O. 05% = O. 85mg的辛酸亞錫，密度=I. 251g/mL，O. 68微升。方法I、將PEG、乙交酯與丙交酯加入燒瓶中。將該燒瓶置于真空下后向其中充滿氬氣。2、使PEG、乙交酯與丙交酯在150°C下熔融，并逐滴加入15微升含催化劑的丙酮。3、使該反應進行I小時45分鐘。圖I、圖2和圖3證實成功合成了 CP-PLGA-pPEG-PLGA-Ι三嵌段共聚物。
3.5_3.7ppm處(4個氫)的位移顯不了 PEG中的亞甲基,4. 6-4. 9ppm處(2個氫)的位移顯示了 PGA中的亞甲基，以及5. 2ppm處(I個氫)的位移顯示了 PLA中的次甲基。這些峰值具有下列面積PEG= 15. 57/4 = 3. 8925 ；PGA = 3. 6/2 = 1.8;以及 PGA=I。PEG(Fluka)的聚合物分子量=4000g/mol，其中單體MW = 44，因此聚合度=91。PLA單體的 MW = 72，聚合度=91/3. 8925 = 23. 38，且聚合物 MW= 1683. 24。PGA 單體 MW = 58，聚合度=91/(3. 8925/1. 8) = 42. 08，且聚合物 MW = 2440. 69。PLGA-PEG-PLGA 總分子量8881. 38g/mol。PEG嵌段的分子量約為4000g/mol。每個PLGA嵌段約為4881. 38g/mol，其中PLGA中乳酸與乙醇酸單體的比值約等于36 64。實施例3-多嵌段共聚物的合成CTA-CP-PLGA-pPEG-PLGA-CTA該聚合物用作多嵌段共聚物的可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合的巨鏈轉(zhuǎn)移劑(macro-chain-transfer-agent)的實例。本例中，所述巨鏈轉(zhuǎn)移劑為三嵌段的，并且能用來制備具有5個或更多個嵌段的兩親性多嵌段共聚物。
材料上述CP-PLGA-pPEG-PLGA，或任何其他具有雙功能性羥基端基的聚合物；S-(硫代苯甲酰)-硫代乙醇酸(CTA)或其他的酸性鏈轉(zhuǎn)移劑(acid chaintransfer agent);以及活化鏈轉(zhuǎn)移劑的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。方法I、將 IOOmg 的 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1 (I. 126X l(T5mol，8881. 38g/mol)溶解在 ImL的無水二氯甲烷中。2、將兩倍于 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1 摩爾數(shù)的 DCC(4. 65mg)與五倍于CP-PLGA-pPEG-PLGA-1摩爾數(shù)的CTA(11. 95mg)在攪拌下加入圓底燒瓶內(nèi)。 3、將燒瓶在真空下放置I小時。4、用氬氣替代真空。5、向燒瓶中加入ImL的無水二氯甲烷。6、將溶解的聚合物逐滴加入到燒瓶中，然后在室溫下攪拌過夜(300rpm)。7、使獲得的溶液在IOOmL乙醚中進行沉淀。8、通過真空過濾器用濾紙對混合物進行過濾，并將沉淀干燥。參見圖4，鏈轉(zhuǎn)移劑的存在在IH-NMR分析中并不明顯。但實施例4的的精煉過程增強了將鏈轉(zhuǎn)移劑耦合到具有羥基端基的聚合物上的效果。實施例4-多嵌段共聚物的合成DJS-CP-CTA-C1使用酰氯形式的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑來增加與具有羥基端基的聚合物的反應活性。如前文描述，這能在不希望使用堿性催化劑(如4-二甲基氨基吡啶(DMAP))的時候有效地促進酸性鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)的耦合，原因在于堿性催化劑會增加大分子單體中α-羥基-酸聚合物嵌段(alpha-hydroxy-acid polymer block)或其他可能的酯嵌段在堿催化下發(fā)生酯水解的風險。材料S-(硫代苯甲酰)_硫代乙醇酸或其他的CTA草酰氯方法I、在50mL的干燥的圓底燒瓶中，使O. 5g的S-(硫代苯甲酰)-硫代乙醇酸在攪拌下溶解于無水二氯甲烷中，并將其浸沒在冰水浴中冷卻至0°C。2、在氮氣下緩慢加入I. 2mol當量的草酰氯，然后使溶液至室溫，攪拌3小時。3、對溶液進行減壓濃縮以生成酰氯，或使其殘留在二氯甲烷中。圖5闡述了得到的S-(硫代苯甲酰)硫代乙醇酰氯DJS-CP-硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-I的IH-NMR譜。實施例5-多嵌段共聚物的合成使CTA-Cl耦合到CP-PLGA-pPEG-PLGA-1上該方法證實了能成功地利用酰氯形式的鏈轉(zhuǎn)移劑(用于耦合聚合物)來產(chǎn)生用于對形成熱敏性共聚物的嵌段進行RAFT共聚反應的巨鏈轉(zhuǎn)移劑。方法I、將 ImL 的含 IOOmg 干燥 CP-PLGA-pPEG-PLGA-l 的無水二氯甲烷置于 Schlenk燒瓶中，然后加入7. 84微升的三乙胺。2、然后在惰性氣體下將混合物冷卻至0°C。3、緩慢地加入DJS-CP-硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-I (5倍于聚合物摩爾數(shù)的酰氯，在O. 346mL的二氯甲烷中)。4、反應溫度至室溫,并反應24小時。5、對溶液進行過濾以除去三乙胺鹽。6、使過濾后的溶液在乙醚中進行沉淀以除去未反應的酰氯和三乙胺。7、過濾后，對沉淀進行真空干燥。圖6顯示了 CP-PLGA-pPEG-PLGA-1共聚物能成功地被RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑端基(7. 6， 8. Oppm)官能化，從而產(chǎn)生用于RAFT共聚反應的巨鏈轉(zhuǎn)移劑來加成更多的聚合物嵌段。RAFT共聚反應過程可以向所述三嵌段中加成低聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，生成能用于可注射的水凝膠藥物傳遞裝置或可注射的組織工程學支架的、具有熱敏性的生物相容且生物可降解的五嵌段共聚物。實施例6-多嵌段共聚物的合成=PGS-CTA聚(甘油-共-癸二)酸中的羥基基團可以被RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑官能化，如前文所述地，利用酸或酰氯形式的鏈轉(zhuǎn)移劑使CP-PLGA-pPEG-PLGA-1官能化。例如，聚(甘油_共-癸二)酸的羥基能通過與低聚(乙二醇甲基丙烯酸甲酯)進行RAFT從而被官能化，進而生成能形成熱敏性彈性網(wǎng)絡的接枝共聚物。材料I聚(甘油-共-癸二酸)；S-(硫代苯甲酰)_硫代乙醇酸鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)或其它的酸性CTA ；活化CTA的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)；以及作為堿性催化劑的DMAP。方法II、使O. 5g的PGS(約I. 95mmol的輕基基團)溶解于5mL的無水二氯甲燒中。2、將與PGS中的羥基基團等摩爾的DCC(0. 402g)和大于PGS的量的CTA(O. 414g)在攪拌下加入到圓底燒瓶中。然后加入O. Imol的DMAP (相較于PGS中羥基基團)。3、將燒瓶在真空下放置I小時。4、用氬氣替代真空。5、向燒瓶中加入無水二氯甲烷以使DCC、CTA和DMAP溶解。6、將步驟I中已溶解的PGS聚合物逐滴地加入到燒瓶中，并在室溫下攪拌過夜(300rmp)。7、使得到的溶液在250mL的乙醚中進行沉淀。8、用濾紙對產(chǎn)物進行真空過濾，并干燥沉淀。材料2聚(甘油-共-癸二酸)DJS-CP硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-I或其他的酰氯鏈轉(zhuǎn)移劑；以及作為堿性催化劑的三乙胺。方法2
I、將ImL的含IOOmg干燥PGS的無水二氯甲烷置于Schlenk燒瓶中。然后加入三乙胺(與酰氯的摩爾數(shù)相等)。2、在惰性氣體下，將混合物冷卻至0°C。3、緩慢加入DJS-CP-硫代苯甲酰-硫代乙醇酰氯-I (相對于期望的聚合物羥基基團的官能度的摩爾數(shù)2倍摩爾數(shù)的酰氯)。4、反應溫度至室溫，并反應24小時。5、對溶液進行過濾以除去三乙胺鹽。6、使過濾后的溶液在乙醚中進行沉淀以除去未反應的酰氯和三乙胺。7、過濾沉淀并真空干燥。
如圖7所示地，該方法能產(chǎn)生被S-硫代苯甲酰-硫代乙醇酸鏈轉(zhuǎn)移劑官能化的CP-PGS-CTA聚(甘油-共-癸二酸)。實施例7-在體外和體內(nèi)測試的可注射水凝膠在體外測試的可注射水凝膠水溶性聚合物化合物的定義是，它能在生理學病況下迅速膠凝，并展現(xiàn)了可調(diào)的膨脹特性。這些聚合物包括以下I、乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯(ETTMP1300)，CAS 345352_19_4。MW1300g/molο Bruno Bock GmbH, Marschacht，德國。2、乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯(ETTMP700)，CAS 345352-19-4。MW700g/mol, Bruno Bock GmbH, Mar schacht,德國。3、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA400)，CAS 26570-48-9。MW 400g/mol，Polysciences, Warrington, PA,美國。4、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA400)，CAS 26570-48-9。MW 4000g/mol，Polysciences, Warrington, PA,美國。配制ETTMP1300 與 ETTMP700 含有 3 個硫醇官能團。PEGDA400 and PEGDA4000 含有兩個丙烯酸酯官能團?？梢允惯@些化合物結(jié)合起來使硫醇與丙烯酸酯官能團的比例等摩爾。然后將上述化合物以20質(zhì)量/體積/ %、25質(zhì)量/體積/ %、30質(zhì)量/體積/ % (溶液中全部的聚合物)溶解于PH為7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) (Gibco,Carlsbad,CA)中?？梢允褂萌魏魏┧狨ズ土虼嫉木酆衔锝M合。但是越高分子量的丙烯酸酯會造成越大的膨脹。故為了降低膨脹，可以利用較低分子量的丙烯酸酯(如具有與PEGDA400的分子量接近的分子量)。溶膠向凝膠的轉(zhuǎn)化速率將200微升的不同濃度的聚合物與鹽水溶液(ETTMP1300/PEGDA400)置于I. 5mL的微量離心管(Eppendorf tubes)內(nèi)，并在37°C下孵育或者置于22°C的室溫中，無光。下表I示出了從溶膠轉(zhuǎn)化為凝膠的時間，當溶液不再流動時，認為已經(jīng)發(fā)生了，這通過上下翻轉(zhuǎn)管子并用手搖動進行監(jiān)測(每組3個樣品)。表I轉(zhuǎn)化率作為硫醇-丙烯酸酯在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水中的濃度的函數(shù)
權利要求
1.一種在患者損傷處對損傷進行治療的方法，其特征在于，該方法包括在損傷處向患者給藥含有基質(zhì)和一種或多種治療劑的藥物傳遞系統(tǒng)。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中，所述給藥的步驟包括在損傷處將藥物傳遞系統(tǒng)注射到患者體內(nèi)。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述基質(zhì)包括熱敏性水凝膠。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠包括多嵌段共聚物，其中所述共聚物選自由含乙二醇聚合物、含低聚乙二醇聚合物、含聚乙二醇聚合物、丙交酯聚合物、乙交酯聚合物和聚(甘油-共-癸二酸)所組成的組中的一種或多種。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠包括具有相容的活性端基的聚合物的組合。
6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠包括含硫醇聚合物與含丙烯 酸酯聚合物的硫羥酸酯。
7.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠包括選自由聚(甘油-共-癸二酸)丙烯酸酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)與聚(乙二醇)或低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯的多嵌段共聚物；聚(甘油-共-癸二酸)與聚(乙二醇)、低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯或聚(N-異丙基丙烯酰胺)的接枝共聚物；和乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基 丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羥酸酯所組成的組中的一種或多種聚合物。
8.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠包括乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羥酸酯。
9.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠為生物可降解的且該水凝膠的成分為生物可降解的或生物相容的且可排出，或者該水凝膠含有生物可降解成分與生物相容且可排出成分的混合物。
10.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述基質(zhì)包括顆粒。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述顆粒為微米顆粒、納米顆粒或微米顆粒與納米顆粒的組合。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述顆粒包括生物可降解聚合物，可排出的生物相容聚合物，或含有生物相容且可排出成分的生物可降解聚合物。
13.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述顆粒包括聚酯。
14.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述顆粒包括選自由聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚丙交酯、聚乙交酯；和聚(羧基苯氧基丙烷)_共-癸二酸)所組成的組中的一種或多種聚合物。
15.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述顆粒為包括聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米顆粒。
16.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括選自由NOS或NO產(chǎn)物的抑制劑、抗氧化劑、自旋捕獲劑和過氧亞硝基清除劑，或它們的藥學可接受鹽所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
17.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括選自由一種抗氧化劑或多種抗氧化劑、坦波爾(4-羥基_2，2,6,6-四甲基哌啶-I-氧基)、尿酸、二甲胺四環(huán)素、甲基脫氫皮質(zhì)醇、MnTBAP和地塞米松，或它們的藥學可接受鹽所組成的組中的物質(zhì)。
18.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇或其藥學可接受鹽。
19.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括二甲胺四環(huán)素或其藥學可接受鹽。
20.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇和二甲胺四環(huán)素，或它們的藥學可接受鹽。
21.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述基質(zhì)被一種或多種治療劑或它們的藥學可接受鹽官能化。
22.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述損傷處位于脊髓內(nèi)，且所述注射的步驟包括硬膜內(nèi)髓內(nèi)注射。
23.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述損傷處為外周神經(jīng)。
24.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述基質(zhì)包括熱敏性水凝膠和顆粒。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑溶解或分散于熱敏性水凝膠中、顆粒中或熱敏性水凝膠與顆粒中均有。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑為多種治療劑，且該多種治療劑中的一種或多種溶解或分散在水凝膠中，而該多種治療劑中其它的一種或多種溶解或分散在顆粒中。
27.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中，所述熱敏性水凝膠包括乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羥酸酯，且所述顆粒包括含有聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米顆粒；且 所述一種或多種治療劑包括選自由NOS或NO產(chǎn)物的抑制劑、抗氧化劑、自旋捕獲劑和過氧亞硝基清除劑或它們的藥學可接受鹽所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇或其藥學可接受鹽。
29.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括二甲胺四環(huán)素或其 藥學可接受鹽。
30.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇和二甲胺四環(huán)素，或它們的藥學可接受鹽。
31.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑溶解或分散于微米顆粒中。
32.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述損傷處位于脊髓內(nèi)，且所述注射的步驟包括硬膜內(nèi)髓內(nèi)注射。
33.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述損傷處為外周神經(jīng)。
34.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，水凝膠和微米顆粒之一或二者被一種或多種治療劑官能化。
35.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一種或多種治療劑包括維生素C和維生素 E0
36.一種藥物傳遞系統(tǒng),其特征在于,該藥物傳遞系統(tǒng)含有基質(zhì)和一種或多種治療劑。
37.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述基質(zhì)包括熱敏性水凝膠。
38.根據(jù)權利要求37所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述熱敏性水凝膠包括多嵌段共聚物，其中該聚合物選自由含乙二醇聚合物、含低聚乙二醇聚合物、聚乙二醇聚合物、丙交酯聚合物、乙交酯聚合物和聚(甘油-共-癸二酸)所組成的組中的一種或多種。
39.根據(jù)權利要求37所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述熱敏性水凝膠包括具有相容的活性端基的聚合物的組合。
40.根據(jù)權利要求37所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述熱敏性水凝膠包括含硫醇聚合物與含丙烯酸酯聚合物的硫羥酸酯。
41.根據(jù)權利要求37所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述熱敏性水凝膠包括選自由聚(甘油-共-癸二酸)丙烯酸酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)與聚(乙二醇)或低聚(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯的多嵌段共聚物；聚(甘油-共-癸二酸)與聚(乙二醇)、低聚(乙二 醇)甲基丙烯酸甲酯或聚(N-異丙基丙烯酰胺)的接枝共聚物；和乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羥酸酯所組成的組中的一種或多種聚合物。
42.根據(jù)權利要求37所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述熱敏性水凝膠包括乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羥酸酯。
43.根據(jù)權利要求37所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述熱敏性水凝膠為生物可降解的且該水凝膠的成分為生物可降解的或生物相容且可排出的，或者該水凝膠含有生物可降解成分與生物相容且可排出成分的混合物。
44.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述基質(zhì)包括顆粒。
45.根據(jù)權利要求44所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述顆粒為微米顆粒、納米顆?；蛭⒚最w粒與納米顆粒的組合。
46.根據(jù)權利要求44所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述顆粒包括生物可降解聚合物，可排出的生物相容聚合物，或含有生物相容且可排出成分的生物可降解聚合物。
47.根據(jù)權利要求44所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述顆粒包括聚酯。
48.根據(jù)權利要求44所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述顆粒包括選自由聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚丙交酯、聚乙交酯；和聚(羧基苯氧基丙烷)_共-癸二酸)所組成的組中的一種或多種聚合物。
49.根據(jù)權利要求44所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述顆粒為包括聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米顆粒。
50.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括選自由NOS或NO產(chǎn)物的抑制劑、抗氧化劑、自旋捕獲劑和過氧亞硝基清除劑，或它們的藥學可接受鹽所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
51.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括選自由一種抗氧化劑或多種抗氧化劑、坦波爾(4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-I-氧基)、尿酸、二甲胺四環(huán)素、甲基脫氫皮質(zhì)醇、MnTBAP和地塞米松，或它們的藥學可接受鹽所組成的組中的物質(zhì)。
52.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇或其藥學可接受鹽。
53.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括二甲胺四環(huán)素或其藥學可接受鹽。
54.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇和二甲胺四環(huán)素，或它們的藥學可接受鹽。
55.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述基質(zhì)被一種或多種治療劑或它們的藥學可接受鹽官能化。
56.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述基質(zhì)包括熱敏性水凝膠和顆粒。
57.根據(jù)權利要求56所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑溶解或分散于熱敏性水凝膠中、顆粒中或熱敏性水凝膠與顆粒中均有。
58.根據(jù)權利要求57所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑為多種治療齊U，且該多種治療劑中的一種或多種溶解或分散在水凝膠中，而該多種治療劑中其它的一種或多種溶解或分散在顆粒中。
59.根據(jù)權利要求56所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中， 所述水凝膠包括乙氧基化三羥甲基丙烷三-3-巰基丙酸酯與聚(乙二醇)二丙烯酸酯的硫羥酸酯，且所述顆粒包括含有聚(丙交酯-共-乙交酯)的微米顆粒；且 所述一種或多種治療劑包括選自由NOS或NO產(chǎn)物的抑制劑、抗氧化劑、自旋捕獲劑和過氧亞硝基清除劑或它們的藥學可接受鹽所組成的組中的一種或多種物質(zhì)。
60.根據(jù)權利要求59所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇或其藥學可接受鹽。
61.根據(jù)權利要求59所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括二甲胺四環(huán)素或其藥學可接受鹽。
62.根據(jù)權利要求59所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括甲基脫氫皮質(zhì)醇和二甲胺四環(huán)素，或它們的藥學可接受鹽。
63.根據(jù)權利要求59所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑溶解或分散于微米顆粒中。
64.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，水凝膠和微米顆粒之一或二者被一種或多種治療劑官能化。
65.根據(jù)權利要求36所述的藥物傳遞系統(tǒng)，其中，所述一種或多種治療劑包括維生素C和維生素E。
全文摘要
提供了一種治療氧化應激的藥物傳遞系統(tǒng)。該藥物傳遞系統(tǒng)可以含有治療劑和基質(zhì)。所述治療劑可以包括抗氧化劑或類固醇。所述基質(zhì)可以包括水凝膠、顆粒、微米顆?；蚣{米顆粒。還提供了一種治療損傷的方法，所述損傷包括外周神經(jīng)損傷或脊髓損傷。該方法包括在損傷處注射所述藥物傳遞系統(tǒng)。
文檔編號A61K35/30GK102858353SQ200980144694
公開日2013年1月2日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權日2008年9月25日
發(fā)明者C·D·普里查德, R·S·蘭格, F·M·雷諾茲, E·J·伍達德 申請人:英偉活康復醫(yī)療有限公司