專利名稱：抗-β-2-微球蛋白試劑及其用途的制作方法
抗-β -2-微球蛋白試劑及其用途相關(guān)申請的交叉引用本PCT申請要求提交于2008年8月7日的美國臨時專利申請No. 61/087，093 ；及提交于2009年3月18日的美國臨時專利申請No. 61/161，298的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明背景
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總得涉及用于治療癌的方法，及更特別涉及用抑制β 2-微球蛋白功能的試劑(例如，抗體)治療癌的方法。
背景技術(shù)：
β 2-微球蛋白(β2_Μ)是包含119個氨基酸殘基的非-糖基化的蛋白，其有99個氨基酸長的分泌型，其具有11. SKDa的分子質(zhì)量。β 2-Μ由全部有核的細(xì)胞合成，及其可與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)HLA I類抗原的α鏈形成三級復(fù)合物。因為β2_Μ未穩(wěn)固錨定在細(xì)胞膜，其可從細(xì)胞釋放，及與游離的細(xì)胞外β2-Μ蛋白交換。β 2-Μ長期被認(rèn)為是貢獻于宿主免疫的最重要的因子之一。隨著癌細(xì)胞成為免疫-逃避，HLA I類抗原損失，使癌細(xì)胞逃逸攻擊性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，及降低細(xì)胞結(jié)合型的 β 2-Μ蛋白的穩(wěn)定-狀態(tài)水平。但是，已在許多液體腫瘤(例如，淋巴瘤，白血病，及多發(fā)性骨髓瘤)及實體瘤(例如，前列腺，乳腺，腎，及消化道)中報道了增加的血清或尿β2-Μ。 有時，血清β 2-Μ水平可與無關(guān)于患者的腎功能的差的預(yù)后相關(guān)。其他情況中，尿β2-Μ水平與前列腺癌患者中差的存活相關(guān)。例如，β 2-Μ蛋白表達可直接通過雄激素調(diào)節(jié)。臨床樣本中的β2_Μ表達水平與前列腺癌患者中的前列腺癌Gleason分值及轉(zhuǎn)移性狀態(tài)相關(guān)。此外，β2-Μ可為促進培養(yǎng)中的前列腺癌細(xì)胞生長及加速小鼠骨中的前列腺腫瘤生長的主要生長因子及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。除了人前列腺癌之外，β2-Μ是人腎癌細(xì)胞中的主要生長因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。 這些結(jié)果被下列觀察所支持1) β 2-Μ由人雄激素-敏感性LNCaP前列腺癌細(xì)胞響應(yīng)雄激素刺激而分泌；2)作為用于評定雄激素應(yīng)答的標(biāo)記物，β 2-Μ可相比前列腺-特異性抗原 (PSA)(良好-建立的雄激素-應(yīng)答性靶)更特異；幻血清及組織β 2-Μ水平與人前列腺癌的Gleason分值及轉(zhuǎn)移性狀態(tài)相關(guān)；4)在人前列腺及腎癌細(xì)胞兩者中，β 2-Μ顯示是有力的生長因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，及這些細(xì)胞中β 2-Μ的過表達驅(qū)使它們在實驗?zāi)Ｐ椭袣w巢到骨。β2_Μ也可通過活化一些重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如膦酸肌醇3-激酶 (PUK-Akt)，促細(xì)胞分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)，及細(xì)胞周期蛋白)來支持正常成骨細(xì)胞，大鼠及小鼠間質(zhì)成纖維細(xì)胞，及癌細(xì)胞的生長。β 2-Μ可通過增加存活素及雄激素受體的表達來活化存活。此外，β 2-Μ可通過增加VEGF及神經(jīng)氈蛋白(VEGF受體)的表達來促進血管發(fā)生，通過胱天蛋白酶的降低的活化及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化來降低細(xì)胞死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，及通過活化NF-κ B配體(RANKL)的受體活化子來增加骨更新。
抗-β 2-M mAbs可通過特異性地靶向β 2_Μ_介導(dǎo)的下游多效信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來用作治療性抗體。例如，抗-β 2-M mAbs可在前列腺及腎癌中調(diào)節(jié)Pi:3K-AKT-，MAPK-，雄激素受體(Al )，及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-介導(dǎo)的存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外，抗-β2-Μ mAbs 可阻斷多發(fā)性骨髓瘤及白血病中由生長因子及趨化因子活化的生長及存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。基于以下觀察，抗-β 2-M mAbs治療不可產(chǎn)生不期望的副作用(1)相比表達完整的β 2-M的對照動物，經(jīng)β 2-M敲落的免疫活性小鼠(生物化學(xué)上相當(dāng)于用抗-β 2-M mAbs 長期處理的小鼠)存活及體重增加。一些β 2-M敲落小鼠發(fā)展弱的自身免疫綜合征，但總體 β 2-M敲落未顯著影響同窩動物的生命期望。(2)抗-β2-Μ mAbs治療不妥協(xié)生命器官中正常細(xì)胞的生長及存活地導(dǎo)致癌細(xì)胞生長的顯著降低。用抗_β2-Μ mAbs治療的免疫-缺陷型小鼠中觀察不到急性毒性或死亡。(3)抗-β 2-M mAbs也引發(fā)直接的對無明顯的針對正常細(xì)胞(例如人血細(xì)胞，免疫妥協(xié)的小鼠中移植的淋巴細(xì)胞，及培養(yǎng)的正常人前列腺上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞)的毒性的癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。β 2-M蛋白可與I類MHC典型及非-典型蛋白形成復(fù)合物。β 2_Μ也可測定這些蛋白的細(xì)胞表面表達。惡性轉(zhuǎn)化之時，MHC I類典型蛋白的表達可降低。β2-Μ作用可由非-典型MHC-樣蛋白介導(dǎo)。目的是所述非-典型MHC-樣分子，血色素沉著癥基因(HFE) (圖1)。血色素沉著癥是可導(dǎo)致鐵過載的常染色體隱性遺傳病癥。結(jié)果，其可導(dǎo)致肝臟硬化，糖尿病，皮膚的黑色素過多色素沉著，心力衰竭，及肝臟癌。與許多形式的此病癥相關(guān)的一個顯著的特征是HFE突變。β 2-M及HFE敲除小鼠及血色素沉著癥患者有時具有促性腺激素低下性性腺功能減退癥。這些病例中β 2-M信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低導(dǎo)致前列腺退行。β 2-M可與HFE相互作用及活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。幾條證據(jù)支持HFE (而非1類 MHC抗原)是推定的β 2-M受體的觀點。例如，⑴β 2-M可在具有不可檢測水平的I類MHC 分子的前列腺癌細(xì)胞中促進生長，及活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而且，如通過流式細(xì)胞術(shù)及蛋白印跡測定，前列腺癌細(xì)胞中由抗-β 2-M mAbs誘導(dǎo)的抑制程度可與I類MHC的細(xì)胞表面表達反相關(guān)。( 不像I類MHC復(fù)合物，其可在惡性轉(zhuǎn)化中被下調(diào)，HFE表達在多種正常細(xì)胞及癌細(xì)胞中仍穩(wěn)定。癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的對抗-β 2-M mAbs-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的差動靈敏度可通過相比正常細(xì)胞，癌細(xì)胞中更高水平的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體I(TFRC)-轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)復(fù)合物來解釋。03)抗-β2-Μ mAbs-誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞死亡可被鐵清除劑，去鐵胺衰減，提示，抗-β 2-M mAbs治療可誘導(dǎo)鐵過載。(4) β 2-M/HFE復(fù)合物可使用抗-β 2-M mAbs共免疫沉淀。(5)使用慢病毒HFE序列-特異性siRNAs的HFE-敲落消除抗-β 2-M mAbs體外誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞死亡的能力，提示，抗- β 2-M mAbs-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡要求HFE。此外，β 2-M/HFE復(fù)合物已知與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用，及發(fā)揮通過抑制TFRC功能的鐵攝取負(fù)調(diào)節(jié)劑的作用(圖1)。TFRC是多數(shù)細(xì)胞中鐵攝取的主途徑。TFRC結(jié)合轉(zhuǎn)移 (TF)，其含鐵。TFRC/TF經(jīng)歷內(nèi)體再循環(huán)及將鐵釋放到細(xì)胞中。TF是TFRC的激動劑，然而 β 2-M/HFE復(fù)合物是TFRC的拮抗劑。因此，β 2-M/HFE復(fù)合物的缺乏，例如在遺傳性血色素沉著癥患者中，可導(dǎo)致增加的TFRC活性所致的鐵過載。類似地，抗-β2-Μ mAbs治療可誘導(dǎo)鐵過載。其可通過滅活0 2-M/HFE復(fù)合物而作為TFRC的拮抗劑而導(dǎo)致。結(jié)果，可在前列腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵過載(圖1)。如所期望，此效應(yīng)可通過鐵清除劑部分反轉(zhuǎn)。重要的是， 抗-β 2-M mAbs-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性可在正常細(xì)胞中最小化，因為正常細(xì)胞表達低或不可檢測水平的TFRC。相反，TFRC活性可對于癌細(xì)胞生長關(guān)鍵，其可要求用于細(xì)胞分裂的鐵的豐富的供給。因此，通過使用抗-β 2-M mAbs過-活化癌細(xì)胞中的TFRC可導(dǎo)致過量的鐵過載及活性氧類別(ROS)產(chǎn)生，其可導(dǎo)致降低的DNA修復(fù)及導(dǎo)致凋亡的增加的DNA損傷(圖1)。 因此，抗-β2-Μ mAbs可用于特異性地靶向癌細(xì)胞，及不靶向正常細(xì)胞。當(dāng)β2-Μ_介導(dǎo)的多效細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由抗-β2_Μ抗體(多克隆或單克隆抗體)打斷時，結(jié)果可為癌細(xì)胞中，但不是正常細(xì)胞中大量細(xì)胞死亡。例如，在多發(fā)性骨髓瘤 (骨癌)中，抗-β2-Μ mAbs治療可不影響正常細(xì)胞地導(dǎo)致大量人及小鼠骨髓瘤細(xì)胞死亡。 此外，抗-β 2-M抗體可經(jīng)由通過例如，下調(diào)存活因子，雄激素受體(AR)，及其靶基因(例如， 前列腺特異性抗原(PSA)及存活素)消除存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來在人前列腺及腎癌細(xì)胞中、以及在小鼠中生長的建立的前列腺腫瘤中誘導(dǎo)凋亡。在不表達AR或PSA的細(xì)胞內(nèi)，抗-β 2-Μ 抗體可導(dǎo)致癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激，凋亡及下調(diào)的存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。總之，這些發(fā)現(xiàn)作為開發(fā)改善的癌治療的科學(xué)基礎(chǔ)，例如，治療人前列腺及腎癌骨及內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移，其中癌細(xì)胞可特異性地靶向，及對于正常細(xì)胞的副作用可最小化。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及用于治療癌的方法。根據(jù)本發(fā)明的一實施方式的方法包括 用針對β 2-Μ的試劑治療受試者，及用輻射或化學(xué)治療劑治療受試者。針對β2-Μ的試劑可為抗體(多克隆或單克隆)或miRNA。本發(fā)明的另一方面涉及癌治療用試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的一實施方式的試劑盒包括針對β 2-Μ的試劑及化學(xué)治療劑。針對β 2-Μ的試劑可為抗體(多克隆或單克隆)或 miRNAο本發(fā)明的其他方面及優(yōu)點將從以下說明及隨附的權(quán)利要求顯而易見。
圖1是圖示本發(fā)明的一些實施方式的潛在機理的示意圖。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的一實施方式治療后對前列腺癌細(xì)胞的克隆存活的效應(yīng)。圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對前列腺癌細(xì)胞的克隆存活的效應(yīng)。圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對前列腺腫瘤生長的效應(yīng)。圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對蛋白表達的效應(yīng)。圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對微RNA表達的效應(yīng)。圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的一實施方式治療后對C4_2B(KD)細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖8顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對C4_2B(KD)細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對C4_2B(KD)細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對C4_2B(KD)細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖11顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對C4_2B(KD)細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖12顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖13顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖14顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖15顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖16顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖17顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
圖18顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖19顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖20顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖21顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式治療后對PC-3細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖22顯示野生型C57BL/6小鼠，用IgG抗體處理的TRAMP小鼠及用根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式的抗-β 2-M抗體處理的TRAMP小鼠中前列腺腫瘤的近紅外成像。圖23顯示在野生型C57BL/6小鼠，用IgG抗體處理的TRAMP小鼠及用根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式的抗-β 2-Μ抗體處理的TRAMP小鼠中，抗體處理對免疫活性脾臟中免疫細(xì)胞數(shù)的效應(yīng)。發(fā)明詳述本發(fā)明的實施方式涉及用于使用針對β 2-Μ的試劑治療癌的方法。本發(fā)明的一些實施方式涉及用于用針對β 2-Μ的試劑與癌治療的另一模式(例如輻射或化學(xué)治療劑)聯(lián)合治療癌的方法。所述聯(lián)合治療中，由于通過針對β 2-Μ的試劑的癌細(xì)胞致敏，可得到協(xié)同效應(yīng)，導(dǎo)致更有效治療及/或更低毒性。本發(fā)明的實施方式可將應(yīng)用于任意類型的癌及任意類型的抗腫瘤劑(輻射或化學(xué)治療劑)。為清楚起見，以下說明將主要使用前列腺癌及抗腫瘤劑，例如臨床中使用的輻射及一些常見的化學(xué)治療藥。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)同，相同方法可將應(yīng)用于其他類型的癌，例如乳腺，肺，腎及骨肉瘤癌，及它們的組合；及其他類型的化學(xué)治療劑，例如治療性抗體，小分子藥物，基于核酸的藥物，及基于肽的藥物。本發(fā)明的實施方式可包括抗-β 2-M mAbs與化學(xué)治療劑組合用于治療各種癌(包括前列腺，乳腺，肺，腎，及骨肉瘤癌，及它們的組合)的用途?？蓪⑴c抗2-M抗體組合的化學(xué)治療劑可包括，但不限于，PS-341，吉西他濱，順鉬，多柔比星，泰素帝，VP-16(依托泊苷，Etopophos ，或Vepesid )，17-AAG (17-去甲氧基格爾德霉素)等。各這些化學(xué)治療劑的特異性活性均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。例如，泰素帝可穩(wěn)定微管蛋白及，因此， 抑制有絲分裂。吉西他濱可抑制DNA延伸。多柔比星及VP-16可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II功能。 順鉬可通過鰲合DNA抑制DNA合成。PS-341 (硼替佐米，蛋白酶體抑制劑)可抑制NF- κ B 活化及細(xì)胞存活。17-AAG可抑制熱激蛋白90(HSP90)功能。這些化學(xué)治療劑在本文僅以說明目的使用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本發(fā)明的實施方式將認(rèn)同，其他化學(xué)治療劑也可將與抗-β 2-Μ抗體組合用于治療各種類型的癌?？?β 2-M mAbs致敏前列腺癌細(xì)胞于輻射-誘導(dǎo)的體外及體內(nèi)細(xì)胞死亡?？?β 2-M抗體(多克隆或單克隆抗體)已發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤生長，及是用于各癌治療或預(yù)防的潛在的治療劑。例如，圖2顯示克隆形成測定中抗-β 2-M mAbs對前列腺癌細(xì)胞G 種攻擊性雄激素-獨立性前列腺癌細(xì)胞系，例如，ARCaPM，C4-2，PC-3，及DU145)的效應(yīng)。此研究中，將細(xì)胞用的抗-β2-Μ mAbs處理48h。結(jié)果顯示，相比其他細(xì)胞系，ARCaPM 可更抵抗抗-β 2-M mAbs治療，然而DU145細(xì)胞相比其他細(xì)胞系更敏感。不過，抗-β2_Μ mAbs有效抵抗全部這些癌細(xì)胞。從顯示于圖2的結(jié)果來看，顯然，抗-β 2-M mAbs有效抵抗各癌細(xì)胞。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，抗-β 2-M mAbs可用于增強其他癌治療模式的治療性功效。例如，圖3顯示，抗-β 2-Μ mAbs治療致敏ARCaPM，PC-3及C4-2攻擊性前列腺癌細(xì)胞于輻射-介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。
在顯示于圖3的研究中，將前列腺癌細(xì)胞用抗-β 2-M mAbs (3 μ g/ml)處理48h，然后以不同劑量電離輻射治療。然后在輻射治療后進行克隆形成測定。結(jié)果顯示，在全部攻擊性前列腺癌細(xì)胞系中組合的抗-β 2-M mAbs與輻射治療增加細(xì)胞死亡達100倍。例如， DU-145細(xì)胞，其已知相對抗輻射，致使相比其他人前列腺癌細(xì)胞更敏感于輻射(無細(xì)胞存活)。類似輻射致敏研究可通過在動物模型(例如，使用ARCaPsi腫瘤的人前列腺癌異種移植物)中體內(nèi)組合輻射與抗-β 2-M mAbs來進行(見以下圖4)。圖4顯示，相比對照治療，用單個注射的抗-β 2-M mAbs (20 μ g/ml)與輻射的聯(lián)合治療可抑制腫瘤生長。簡言之，給小鼠在兩肋皮下注射ARCaPsi細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達到4mm3尺寸時，在gelform 中用IgG或抗-β2-Μ mAbs處理腫瘤。可將gelform 浸入20 μ g/ml 的抗體，及手術(shù)移植到腫瘤附近。M小時之后，將腫瘤以15Gy照射。隨后每周監(jiān)控腫瘤體積。腫瘤再-生長測定測量初始治療后腫瘤達到150mm3的體積所需的時間。圖4中的結(jié)果顯示對照腫瘤快速再-生長(約4天)，然而經(jīng)抗- β 2-MmAbs及輻射處理的腫瘤生長顯著延遲(約16天)?？?β2-Μ mAbs/輻射聯(lián)合治療在7個不同腫瘤位點阻止生長。單獨用抗-β2-Μ mAbs治療(約12天)或單獨用輻射治療(約8天)不那么有效。重要的是，抗-β2-Μ mAbs治療不對小鼠創(chuàng)建毒性副作用。這些結(jié)果可顯著，因為抗-β 2-M mAbs可普遍地致敏激素難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞于放射治療。因此，抗-β 2-Μ mAbs/輻射聯(lián)合治療可代表用于治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有希望的新模式。為了解抗-β2_Μ mAbs單獨或組合的作用機理，研究了各蛋白表達的變化。尤其是，發(fā)現(xiàn)TFRC，β 2-M，及凋亡蛋白的表達改變。例如，圖5顯示，在模擬體內(nèi)腫瘤的ARCaPsi 前列腺癌類器官(3D模型)中，TFRC表達應(yīng)答抗-β 2-M mAbs，輻射，及組合的抗-β 2-Μ mAbs/輻射治療而改變。這些研究中，ARCaPsi細(xì)胞在3D旋轉(zhuǎn)壁容器中生長48h，以形成類器官。將這些類器官用抗-β2-Μ mAbs (5 μ g/ml)處理Mh，然后以4Gy輻射。在輻射后Mh 時裂解細(xì)胞，然后進行蛋白印跡分析。相比對照，在全部3種治療中β2-Μ蛋白水平降低。 而抗-β2-Μ mAbs治療降低TFRC水平，輻射治療實際上增加了 TFRC水平。重要的是，用抗-β 2-M mAbs前處理阻斷響應(yīng)輻射的TFRC表達誘導(dǎo)。這些觀察與TFRC的涉及一致，如圖1中所示。此外，某些凋亡蛋白，例如胱天蛋白酶9及3，通過聯(lián)合治療，但不通過分離的抗-β2-Μ mAbs或輻射治療顯著增加。此結(jié)果提示，使用抗-β 2-M mAbs與輻射(及其他癌治療模式)的聯(lián)合治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。除了蛋白表達變化之外，抗-β2_Μ mAbs也上調(diào)ARCaPsi細(xì)胞中的miRNA。微 RNA(miRNA)可為基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。通過結(jié)合到mRNAs，這些miRNA可通過抑制 mRNAs的翻譯和/或增加mRNAs的降解來影響基因表達。各miRNA可靶向幾種mRNAs。MiRNA篩選可通過多次進行定量實時PCR分析來進行。使用高度敏感性多次進行的，定量實時PCR，可測試來自前列腺癌細(xì)胞系的90種誘導(dǎo)性miRNA。簡言之，抗-β2_Μ mAbs治療(3 μ g/ml)后可監(jiān)控一組90種miRNA的表達水平變化。例如，細(xì)胞可處理Mh， 然后提取miRNA?？蓪NU6B用作內(nèi)部對照，因為組之間其表達水平無變化。將ARCaPE細(xì)胞用作對照，用于ARCaP細(xì)胞的上皮變體。miRNA表達水平變化可表示為倍數(shù)變化。結(jié)果顯示某些miRNA的表達水平變化。如圖6中所示，抗-β 2-M mAbs治療特異性地增力miR_135b，miR-200a,及miR-200b水平。這些miRNA的上調(diào)導(dǎo)致控制細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移的基因(例如低氧誘導(dǎo)性因子-Ia (HIF-Ia)，細(xì)胞周期蛋白D2，pim2，磷脂酶Cy 1，TFRC，^Bl及的下調(diào)。注意，這些抗-β 2-M mAbs-誘導(dǎo)的miRNA可發(fā)揮類似于抗-β 2_M mAbs的β 2_Μ拮抗劑的作用。即，這些miRNA本身可用作對抗β2-Μ功能的試劑。miR-135b的重要性可歸因于其下調(diào)癌基因及生長/轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(例如， HIF-Ia，細(xì)胞周期蛋白D2，pim-2，及磷脂酶CyI)的能力。與此觀點一致，C4-2及C4-2B 骨轉(zhuǎn)移性LNCaP人前列腺癌上皮變體相比PrEC(正常人前列腺上皮細(xì)胞系)表達少100 倍的miR-135b。因此，抗-β 2-M mAbs治療可增加miR_135b水平，其進而可降低內(nèi)源性 HIF-IamRNA水平。與HIF-I α可相關(guān)于輻射抗性的發(fā)現(xiàn)一致，HIF-I α抑制劑(例如， miR-135b)可在C4-2細(xì)胞中響應(yīng)輻射降低10倍。此外，在ARCaPM 3-D類器官中可觀察到 HIF-Ia表達響應(yīng)輻射增加。因此，抗-β2-Μ mAbs可通過上調(diào)miR_135b增強輻射致敏，其進而可下調(diào)HIF-I α，致使細(xì)胞敏感于輻射。此可為抗-β 2-MmAbs可與輻射協(xié)同而促進癌細(xì)胞死亡的機理之一。miR-200家族成員的表達可通過在ARCaPM前列腺癌細(xì)胞中的抗-β 2-M mAbs處理來特異性地誘導(dǎo)。miR-200家族成員也可靶向TFRC。miR-200家族成員的其他靶包括控制上皮至間葉轉(zhuǎn)變(EMT)及轉(zhuǎn)移的基因，例如^Bl，ZEB2，神經(jīng)氈蛋白，及其他。如所述， 抗- β 2-MmAbs可通過增加miR-200的表達水平來抑制^Bl及^B2。EMT中E-鈣粘蛋白的降低可貢獻于細(xì)胞運動性及侵襲性。因為ZEBl及發(fā)揮E-鈣粘蛋白的抑制劑的作用，由miR-200家族成員的觀Bl及觀82抑制可，因此，恢復(fù)E-鈣粘蛋白。結(jié)果，EMT可被抑制，及間葉至上皮轉(zhuǎn)變(MET)被促進。因此，抗-β 2-M mAbs可通過抑制EMT用于選擇性地靶向前列腺癌細(xì)胞。miR-200也可下調(diào)TFRC。因此，抗-β2_Μ mAbs治療可通過兼上調(diào) miR-200家族及下調(diào)TFRC(其可相關(guān)于輻射抗性)致敏前列腺癌細(xì)胞于輻射。因為抗-β 2-M mAbs及輻射對TFRC的相反的效應(yīng)(圖5)，癌殺傷可通過基于細(xì)胞中TFRC的誘導(dǎo)及鐵-調(diào)節(jié)的氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)適當(dāng)調(diào)度用于抗2-M mAbs及輻射的遞送來最大化。以上顯示，抗-β2_Μ mAbs及輻射治療的組合可產(chǎn)生增強的抗-腫瘤效應(yīng)。涉及抗-β2-Μ mAb效應(yīng)的機理明顯不依賴于輻射或任何特定抗-癌治療模式。因此，預(yù)計抗-β2-Μ mAbs致敏癌細(xì)胞于其他抗癌劑的能力應(yīng)等同應(yīng)用于與其他抗癌劑(包括化學(xué)治療劑)的聯(lián)合治療。為顯示這正確，以下描述展示使用抗2-M mAbs與其他化學(xué)治療劑的聯(lián)合治療的協(xié)同效應(yīng)的實驗。特別是，使用抗_β2-Μ mAbs與化學(xué)治療劑，以及在β2-Μ 敲落(KD)細(xì)胞中使用化學(xué)治療劑顯示協(xié)同效應(yīng)。β2-Μ敲落模擬抗-β2-Μ mAbs的效應(yīng)。例如，雄激素-獨立性及雄激素受體-陰性人前列腺癌細(xì)胞系(PC-3)及β 2-M-敲落雄激素-獨立性細(xì)胞系(C4-2B)可用于展示協(xié)同作用。例如，可將每孔6千(6，000)細(xì)胞平鋪于96孔平板，其可培養(yǎng)于含1 % DCC-FBS (葡聚糖-包被的，炭-處理的胎牛血清)的培養(yǎng)基(C4-2B)或無血清T培養(yǎng)基( 03)，在5%0)2于371過夜。然后可將細(xì)胞用抗_ β 2-M mAbs處理48h。然后可將化學(xué)治療劑(例如PS-341，吉西他濱，順鉬，多柔比星，泰素帝，或 17-AAG)加入培養(yǎng)基。處理后2到4天時，細(xì)胞生長可使用CellTiter96含水One溶液細(xì)胞增殖測定(!Iomega)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明通過MTS測定來測定。來自這些用各化學(xué)治療劑的實驗的結(jié)果顯示于圖7-21。
相比在正常小鼠中的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在β 2-Μ-敲落小鼠中，化學(xué)治療劑具有顯著增強的效應(yīng)。例如，圖7顯示，相比新-對照細(xì)胞，C4-2B(KD)(i32-M-敲落PC-3)細(xì)胞更敏感于由吉西他濱誘導(dǎo)的生長抑制。結(jié)果顯示，吉西他濱以較低劑量(10 μ M或更低)不是特別有效。但是，β 2-Μ-敲落顯著增強吉西他濱的效應(yīng)。類似地，圖8顯示，相比新-對照細(xì)胞，C4_2B(KD)細(xì)胞更敏感于由PS-341誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制。即使PS-341以IyM或更高濃度獨自有效，β 2-M-敲落仍產(chǎn)生顯著的增強。增強不僅見于β 2-Μ-敲落小鼠，而且見于用拮抗或抑制β 2-Μ功能的試劑(例如針對β2-Μ的抗體)處理的正常小鼠。例如，圖9顯示，抗-β2Μ抗體(0.5，1μβ/πι1)可致敏C4-2B(KD)細(xì)胞于PS-341的細(xì)胞毒性。顯示于圖8及圖9的結(jié)果之間的比較證實增強的確由于β 2-M功能的抑制或敲落所致。用各化學(xué)治療劑觀察到增強。例如，圖10顯示，C4-2B(KD)細(xì)胞相比新-對照細(xì)胞更敏感于由順鉬(例如，10 μ M)誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制。圖11顯示，C4-2B(KD)細(xì)胞相比新-對照細(xì)胞更敏感于由泰素帝誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制。此外，也用不同癌細(xì)胞觀察到增強。圖12及圖13顯示抗-β 2M抗體治療致敏PC-3 細(xì)胞于順鉬的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果類似于在C4-2B(KD)細(xì)胞中用順鉬的結(jié)果。為進一步確證抗-β 2-M抗體在增強其他治療劑的效應(yīng)中的一般應(yīng)用，測試了其他化學(xué)治療劑。圖14及圖15顯示抗-β 2Μ抗體治療致敏PC-3細(xì)胞于多柔比星的細(xì)胞毒性。 圖16及圖17顯示抗-β 2Μ抗體治療致敏PC-3細(xì)胞于吉西他濱的細(xì)胞毒性。圖18及圖19 顯示抗- β 2Μ抗體治療致敏PC-3細(xì)胞于泰素帝的細(xì)胞毒性。圖20及圖21顯示抗- β 2Μ 抗體治療致敏PC-3細(xì)胞于17-AAG的細(xì)胞毒性?？傊@些結(jié)果顯示β 2-Μ功能抑制貢獻于致敏癌細(xì)胞于癌治療，放射治療或化學(xué)治療。因此，任何可阻斷或降低β2-Μ功能的試劑(例如，上述抗-β2-Μ mAbs或miRNA) 可用于增強其他癌治療模式(例如輻射或化學(xué)治療劑(例如，PS-341，吉西他濱，順鉬，多柔比星，泰素帝，及17-AAG，等))的效應(yīng)?？墒褂萌魏吾槍Ζ?2-M的抗體，包括單克隆抗-β 2M抗體及多克隆抗-β 2M抗體。例如，在以上體外研究及用裸鼠實驗的研究中，使用來自Santa Cruz Biotechnology 的單克隆抗- β 2M抗體(ΒΒΜ. 1)。就TRAMP小鼠研究而言，使用來自ATCC的雜交瘤產(chǎn)生 mAbs(BBM. 1)，將其注射給小鼠，以產(chǎn)生抗_ β 2_M單克隆抗體作為腹水。收集腹水，及使用 IgG純化試劑盒純化，及在注射之前定量。除了治療效果之外，抗-β 2-M抗體也發(fā)現(xiàn)具有預(yù)防效果。在TRAMP小鼠模型中展示這些預(yù)防效果。TRAMP模型使用大鼠雄激素-依賴性前列腺堿性蛋白基因啟動子驅(qū)使在前列腺上皮中猿猴病毒40 (SV40)大T及小t抗原的表達。因此，SV40抗原的表達特異于前列腺，及激素性及發(fā)育性地調(diào)節(jié)。TRAMP小鼠將自發(fā)發(fā)展前列腺癌。圖22顯示在TRAMP小鼠中響應(yīng)抗-β 2-M mAbs的腫瘤成像研究。在此實驗中， 使用TRAMP小鼠及它們的背景對照C57BL/6小鼠。TRAMP小鼠(n = 4)用對照IgG抗體或抗-β 2-M mAbs處理。小鼠連日用200 μ g/ml純化的mAbs處理2個月，然后連日lmg/ml mAbs的2次注射。治療后一周時，處死小鼠。成像研究顯示，抗- β 2-M mAb治療在TRAMP 小鼠中預(yù)防前列腺腫瘤的自發(fā)發(fā)展，表明抗-β 2-M抗體可具有預(yù)防效果。這些觀察通過H/ E染色確認(rèn)。
圖23顯示在TRAMP小鼠中響應(yīng)抗-β 2-M mAbs的免疫學(xué)毒性研究。在這些小鼠脾臟中進行免疫研究?？俆及B細(xì)胞數(shù)不受響應(yīng)抗-β 2-M mAb治療的影響，提示，抗-β2-Μ 治療將不干擾宿主免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的實施方式的優(yōu)點可包括以下一或多個。本發(fā)明的方法可無影響正常細(xì)胞的副作用地特異性地致敏癌細(xì)胞于輻射-和/或化學(xué)治療劑藥-誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。因此， 本發(fā)明的方法可最大化治療功效及，同時，最小化不期望的副作用。盡管使用有限數(shù)量的實施例闡釋了本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)同本發(fā)明的實施方式不限于這些實施例。因為β 2-Μ涉及不特異于任何特定類型的癌的共同的機理，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)同本發(fā)明的實施方式也可將應(yīng)用于其他類型的癌。此外，如上所述，抗-β2-Μ mAbs可致使癌細(xì)胞更敏感于輻射和/或化學(xué)治療劑。因此，協(xié)同效應(yīng)不期望特異于任何特定化學(xué)治療劑。換言之，如上所述的協(xié)同效應(yīng)普遍，及不限于特定癌或特定化學(xué)治療劑。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅由附加的權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.用于治療癌的方法，包括用針對β-2-微球蛋白的試劑治療受試者；及用輻射或癌治療劑治療受試者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述針對β-2-微球蛋白的試劑是抗體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述針對0-2-微球蛋白的試劑是時1^八。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述miRNA是選自下列的至少一種miR-135，miR-200a，及 miR-200bo
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌是前列腺癌，乳腺癌，肺癌，腎癌，骨肉瘤癌，或它們的組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中化學(xué)治療劑是選自下列的至少一種PS-341，吉西他濱，順鉬，多柔比星，泰素帝，VP-16，及17-AAG。
9.癌治療用試劑盒，其包括針對β_2-微球蛋白的試劑；及化學(xué)治療劑。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述針對β-2-微球蛋白的試劑是抗體。
11.針對β-2-微球蛋白的試劑用于增強輻射或化學(xué)治療劑的癌-治療效果的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述針對β-2-微球蛋白的試劑是抗體。
全文摘要
用于治療癌的方法，包括用針對β-2-微球蛋白的試劑治療受試者；及用輻射或癌治療劑治療受試者。針對β-2-微球蛋白的試劑，其包括抗-β2-M抗體及miRNA。
文檔編號A61P35/00GK102223896SQ200980132038
公開日2011年10月19日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者H·E·趙, L·W·K·常, S·卓森, W-C·黃 申請人:埃默里大學(xué), 西塞醫(yī)療中心