專利名稱：治療炎性結(jié)腸疾病的方法
治療炎性結(jié)腸疾病的方法發(fā)明領(lǐng)域和
背景技術(shù)：
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用來自脂肪或胎盤組織的貼壁細(xì)胞治療炎性結(jié) 腸疾病的方法；并且，更具體地，但不排他，涉及使用所述貼壁細(xì)胞治療潰瘍性結(jié)腸炎或克 隆氏病的方法。在日益發(fā)展的醫(yī)學(xué)界，越來越需要大量的成體干細(xì)胞用于細(xì)胞移植和組織工程的 目的。此外，成體干細(xì)胞療法正持續(xù)發(fā)展，用于治療和治愈各種狀況，例如造血障礙、心臟 病、帕金森病、阿爾茨海默病、中風(fēng)、燒傷、肌肉萎縮癥、自身免疫性病癥、糖尿病和關(guān)節(jié)炎。近些年來，大量的研究活動集中在用于包括受損器官例如腦、心臟、骨骼和肝的組 織修復(fù)以及支持骨髓移植(BMT)的各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的治療潛能上。 MSCs是獲自例如骨髓、脂肪組織、胎盤和血液的異源細(xì)胞群，它們能夠依靠來自各種生物活 性因子的影響分化成不同類型的間充質(zhì)成熟細(xì)胞(例如，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪 細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞)。因此，MSCs已在再生醫(yī)學(xué)中被廣泛研究作為構(gòu)造新組織例如骨、軟 骨和脂肪的基礎(chǔ)，用于損傷修復(fù)或置換病變組織以及用于治療遺傳和獲得性疾病。而且， MSCs的多能性、它們的易于分離和培養(yǎng)以及它們的離體高度擴(kuò)增潛能使它們成為有吸引力 的治療工具。炎性腸病(IBD)是一組大腸和小腸的炎性狀況，其包含克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸 炎，并且是未知來源的慢性、復(fù)發(fā)性和緩解性狀況，其在西方國家每1千人中影響至少1人?？寺∈喜?也稱為肉芽腫性結(jié)腸炎和局限性腸炎)是由免疫系統(tǒng)攻擊胃腸道并在 胃腸道中產(chǎn)生炎癥而引起的自身免疫病，是可影響從口腔到肛門的胃腸道的任何部分的炎 性疾病，其引起各種癥狀。它主要引起腹痛、腹瀉、嘔吐和體重減輕，但也可能引起如皮疹、 關(guān)節(jié)炎和眼部炎癥等的胃腸道外并發(fā)癥。目前還沒有已知的藥物或手術(shù)可治愈克隆氏病， 治療選擇限于控制癥狀、保持緩解和防止復(fù)發(fā)(例如，5-氨基水楊酸(5-ASA)制劑，皮質(zhì)類 固醇例如潑尼松和氫化可的松，以及免疫調(diào)節(jié)劑例如硫唑嘌呤和巰基嘌呤)。潰瘍性結(jié)腸炎是結(jié)腸炎的一種形式，其是一種腸病，特別是大腸或結(jié)腸病，其包括 在結(jié)腸中的特征性潰瘍或開放性瘡。活動性疾病的主要癥狀是通?；煊醒慕?jīng)常性腹瀉。 目前潰瘍性結(jié)腸炎的治療包括抗炎藥、免疫抑制以及靶向免疫應(yīng)答特定成分的生物學(xué)療 法。結(jié)腸切除術(shù)(通過手術(shù)部分或全部去除大腸)有時是必要的，并認(rèn)為可治愈該疾病。Okamoto 等[Okamoto 等，如上]禾口 Matsumoto 等[Matsumoto 等， Gastroenterology (2005) 128 :1851-1867]報(bào)道了源自骨髓的細(xì)胞(BMDCs)在放射和骨髓 移植后形成的移植物抗宿主疾病或胃潰瘍后，可使得人類胃腸道上皮得以恢復(fù)。Komori等 2005 [Komori 等，J Gastroenterol (2005) 40 :591-599]還報(bào)道了在大鼠的胃潰瘍和三硝 基苯磺酸(TNBQ-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的愈合過程中，源自骨髓的粘膜上皮細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞 的瞬時增加。此外，Osiris療法(www, osiris. com)正在評價一種源自骨髓MSCs的產(chǎn)品 ftOchymal對克隆氏病的治療。Osiris目前正進(jìn)行多中心試驗(yàn)來評價ftOchymal用于克隆 氏病的安全性和有效性。PCT公開號WO 2008/100498公開了使用胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞治療免疫相關(guān)疾病(例如，炎性腸病，移植物抗宿主疾病)的方法。與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記或原代培養(yǎng) 后的傳代次數(shù)無關(guān)，公開的干細(xì)胞源自哺乳動物胎盤，并附著于組織培養(yǎng)基質(zhì)(例如，組織 培養(yǎng)塑料制品或纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)板)。美國專利公開號20080213227公開了通過施用有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞治療自身 免疫病和炎性疾病(例如，炎性腸病和克隆氏病)的方法。公開的間充質(zhì)細(xì)胞可獲自貼壁 的骨髓或骨膜細(xì)胞或可選地獲自血液、皮膚、臍帶血、肌肉、脂肪、骨或軟骨膜。PCT公開號WO 2007/108003公開了細(xì)胞擴(kuò)增的方法，其包括在支持細(xì)胞擴(kuò)增的三 維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞。還提供了由此產(chǎn)生的細(xì)胞及其用途。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了治療有需要的受試者中的潰瘍性結(jié)腸 炎或克隆氏病的方法，該方法包括給受試者施用治療有效量的來自胎盤或脂肪組織的貼壁 細(xì)胞，從而治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞在制 備經(jīng)鑒定用于治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了制品，其包含包裝材料，該包裝材料包 含用于治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的標(biāo)簽，該包裝材料包裝藥學(xué)有效量的來自胎盤或脂 肪組織的貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞包含選自⑶73、⑶90丄擬9和⑶105的陽 性標(biāo)記表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞包含選自⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA_DR、 CDllb、CD14、CD19、CD34 和 CD79 的陰性標(biāo)記表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，抑制免疫反應(yīng)包括抑制T細(xì)胞活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞獲自三維(3D)培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該三維(3D)培養(yǎng)包括3D生物反應(yīng)器。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，3D培養(yǎng)中的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)在灌注下實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)行到至少10%的貼壁細(xì)胞正在 增殖。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞包含表11所述的基因表達(dá)概況。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞包含在2維QD)培養(yǎng)條件下從胎盤或脂 肪組織培養(yǎng)的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，至少12%的貼壁細(xì)胞處于S和/或G2/M增殖期。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該貼壁細(xì)胞包含表8所述的基因表達(dá)概況。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，與在相同條件下生長并分化的來自骨髓的貼壁細(xì)胞 相比，該貼壁細(xì)胞較少地定型為成骨細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，與在相同條件下生長并分化的來自骨髓的貼壁細(xì)胞 相比，該貼壁細(xì)胞較少地定型為成脂肪細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該制品進(jìn)一步包括用于治療結(jié)腸炎癥的另外的藥物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該制品進(jìn)一步包括免疫抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該制品進(jìn)一步包括抗炎劑。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常的理解相同的含義。盡管與本文所述那些相似或等同的方法和材料可用于 本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施或測試，但是下文仍描述了示例性方法和/或材料。如有矛盾之處， 以專利說明書包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅用于說明且不試圖進(jìn)行必要的限 制。附圖簡述參考附圖，僅以舉例方式，在本文中描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案?，F(xiàn)具體詳細(xì)參考 附圖，強(qiáng)調(diào)的是，通過舉例方式顯示具體內(nèi)容且僅出于說明性討論本發(fā)明的實(shí)施方案的目 的。在這一點(diǎn)上，隨附圖采用的說明使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很明顯地得知本發(fā)明的實(shí)施 方案如何被實(shí)施。附圖中圖IA-B是描繪適于根據(jù)本教導(dǎo)使用的胎盤的2D貼壁細(xì)胞(

圖1A)或根據(jù) TO/2007/108003的教導(dǎo)制備的命名為PLX的貼壁細(xì)胞(圖1B)的細(xì)胞周期分析的圖。將細(xì) 胞在70% EtOH 0. N中固定，離心并重懸于碘化丙錠(PI)溶液，然后通過FACS分析。圖2是描繪適于根據(jù)本教導(dǎo)使用的胎盤的2D貼壁細(xì)胞上的標(biāo)記表達(dá)的柱狀圖。 注意到 CDllb、CD34、HLA-DR、CD14、CD19 和 CD45 記錄到陰性表達(dá)，而 CD29、CD73、CD90 和 ⑶105注意到陽性表達(dá)。圖3是描繪由適于根據(jù)本教導(dǎo)使用的胎盤的2D貼壁細(xì)胞引起的淋巴細(xì)胞應(yīng)答降 低的柱狀圖。用PHA(10yg/ml)刺激源自外周血(PB)的單核細(xì)胞(MNCs)。將4個不同批 次的2D貼壁細(xì)胞之一添加到被刺激的MNCs中。將每組的三個重復(fù)樣品接種于96孔板。圖4A-F是描繪在骨生成或脂肪生成分化條件下骨髓和胎盤細(xì)胞的生長的照片。 將源自骨髓的細(xì)胞(圖4A-C)或源自胎盤的細(xì)胞(圖4D-F)平鋪于用玻連蛋白和膠原包被 的M孔板中的生長培養(yǎng)基(圖4A和4D)、骨生成分化培養(yǎng)基(圖4B和4E)或脂肪生成分 化培養(yǎng)基(圖4C和4F)中。每3-4天更換培養(yǎng)基。在生長期結(jié)束時，如下實(shí)施例部分詳述， 將細(xì)胞固定、染色并拍照。圖5A-F是描繪在經(jīng)更改的骨生成或脂肪生成分化條件下骨髓和胎盤細(xì)胞的生長 的照片。將源自骨髓的細(xì)胞(圖5A-C)或源自胎盤的細(xì)胞(圖5D-F)平鋪于用玻連蛋白和 膠原包被的M孔板中的生長培養(yǎng)基(圖5A和5D)、骨生成分化培養(yǎng)基(圖5B和5E)或脂 肪生成分化培養(yǎng)基(圖5C和5F)中。每3-4天更換培養(yǎng)基。在生長期結(jié)束時，如下實(shí)施例 部分詳述，將細(xì)胞固定、染色并拍照。圖6A-B 描繪了 由 Plurix (命名為 PLX,圖 6B)和由 Celligen (PLX-C，圖 6A)制備 的3D貼壁細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。將細(xì)胞在70% KOH 0. N中固定，離心并重懸于碘化丙錠 (PI)溶液，然后通過FACS分析。圖7A-C描繪了在PLX-C上表達(dá)成纖維細(xì)胞典型標(biāo)記但不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞典型標(biāo)記。 圖7A描繪了內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31的陰性表達(dá)，圖7B描繪了內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記KDR的陰性表達(dá)； 圖7C描繪了人成纖維細(xì)胞標(biāo)記(D7-FIB)的陽性表達(dá)。注意到同種型IgGl(FITC)的紅色直方圖表示陰性對照，而藍(lán)色直方圖表示陽性染色細(xì)胞。圖8A-D描繪了在PLX-C細(xì)胞上刺激分子和共刺激分子的表達(dá)。圖8A描繪了⑶80 的PLX-C表達(dá)；圖8B描繪了⑶86的PLX-C表達(dá)；圖8C描繪了⑶40的PLX-C表達(dá)；圖8D描 繪了 HLA-A/B/C的PLX-C表達(dá)。用相關(guān)同種型熒光分子制備陰性對照。注意到紅色直方圖 表示表達(dá)PLX-C標(biāo)記的細(xì)胞群，藍(lán)色直方圖表示表達(dá)骨髓(BM)標(biāo)記的細(xì)胞群，并且綠色直 方圖表示表達(dá)單核細(xì)胞(MNC)標(biāo)記的細(xì)胞群。圖9A-B描繪了 PLX-C對淋巴細(xì)胞增殖的抑制。圖9A描繪了利用用等量的經(jīng)輻射 的(3000Rad)源自PB的MNC (供體B)刺激hlO5個源自外周血(PB)的單核細(xì)胞(MNC，供 體A)然后向培養(yǎng)物中加入漸增量的PLX-C細(xì)胞進(jìn)行的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測試。每 組的三個重復(fù)樣品接種于96孔板中。通過[3H]胸苷摻入測量增殖速率；圖9B描繪了用 ConAd. 5mg/ml)刺激的源自外周血(PB)的MNC。向培養(yǎng)物中加入漸增量的PLX-C細(xì)胞。每 組的三個重復(fù)樣品接種于96孔板中。通過[3H]胸苷摻入測量增殖速率。圖IOA-C描繪了與外周血細(xì)胞共培養(yǎng)后促炎和抗炎細(xì)胞因子分泌的PLX-C調(diào)節(jié)。 圖IOA-B描繪了用ConA刺激的源自人的MNC(分離自外周血)與PLX-C共培養(yǎng)后IFN γ (圖 10Α)和TNFa (圖10B)的分泌；圖IOC描繪了用LPS刺激的源自人的MNC(分離自外周血) 與PLX-C共培養(yǎng)后IFN y ,TNF α和IL-IO的分泌。收集上清液并采用ELISA進(jìn)行細(xì)胞因子 分析。圖11是描繪由Wallace評分所代表的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的的宏觀評價的圖。 TNBS (結(jié)腸炎模型小鼠)、TNBS+5-ASA (接受金標(biāo)準(zhǔn)治療的結(jié)腸炎小鼠)、TNBS+2D貼壁細(xì)胞 (批次1) ip、TNBS+3D貼壁細(xì)胞(PLX-C，批次2) ip、TNBS+2D貼壁細(xì)胞(批次1) iv和TNBS+3D 貼壁細(xì)胞(PLX-C，批次》iv。由兩位研究者盲法進(jìn)行宏觀評估。圖12是描繪由Ameho評分所代表的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的的微觀評價的圖。 TNBS (結(jié)腸炎模型小鼠)、TNBS+5-ASA (接受金標(biāo)準(zhǔn)治療的結(jié)腸炎小鼠)、TNBS+2D貼壁細(xì)胞 (批次1) ip、TNBS+3D貼壁細(xì)胞(PLX-C，批次2) ip、TNBS+2D貼壁細(xì)胞(批次1) iv和TNBS+3D 貼壁細(xì)胞(PLX-C，批次》iv。由兩位研究者盲法進(jìn)行組織學(xué)評價。圖13是描繪結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中IL-IiimRNA表達(dá)水平的圖。通過直腸內(nèi)施用 TNBS使小鼠患有結(jié)腸炎并通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑施用2D或3D(PLX-C)貼壁細(xì)胞。從不 同實(shí)驗(yàn)組的結(jié)腸組織分離總RNA并通過RT-PCR評價IL-I β表達(dá)水平。圖14是描繪結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織的微觀評價的圖。通過結(jié)腸內(nèi)施用TNBS使大鼠 患有結(jié)腸炎并通過腹膜內(nèi)(ip)或靜脈內(nèi)(iv)途徑施用PLX-C細(xì)胞。本發(fā)明具體實(shí)施方案的描述在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用來自脂肪或胎盤組織的貼壁細(xì)胞治療炎性結(jié) 腸疾病的方法，并且，更具體地，但不排他地，涉及使用所述貼壁細(xì)胞治療潰瘍性結(jié)腸炎或 克隆氏病的方法。通過參考附圖和所附說明可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)解釋本發(fā)明至少一個實(shí)施方案之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明的應(yīng)用不必須受限 于以下說明書所列出的或?qū)嵤├C的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明可具有其他實(shí)施方案或以各種 方式實(shí)施或進(jìn)行。而且，應(yīng)理解的是本文應(yīng)用的措辭和術(shù)語用于描述目的且不應(yīng)被認(rèn)為具 有限制性。
在將本發(fā)明付諸實(shí)施時，本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)來自胎盤組織的貼壁細(xì)胞可 有效用于治療潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病。如下文和之后的實(shí)施例部分所示，如小鼠(實(shí)施例4)和大鼠(實(shí)施例5)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?所述，本發(fā)明人通過艱苦的實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)獲自胎盤或脂肪組織并在2D(實(shí)施例2、或3D培養(yǎng) 條件(實(shí)施例1和3)下培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞可有效地用于治療結(jié)腸炎癥，例如潰瘍性結(jié)腸炎。 本發(fā)明人已顯示，如通過結(jié)腸的宏觀和微觀評價所測定的(圖11、12和14)，本發(fā)明的2D或 3D貼壁細(xì)胞的靜脈內(nèi)(iv)或腹膜內(nèi)(ip)施用引起結(jié)腸組織炎性狀況的主要改進(jìn)。該抗炎 效果與5-ASA金標(biāo)準(zhǔn)治療一樣有效。綜上，本發(fā)明的教導(dǎo)描述了本發(fā)明的貼壁細(xì)胞的抗炎 價值并表明其用于治療炎性結(jié)腸疾病例如潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病的用途。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了治療有需要的受試者中的潰瘍性結(jié)腸炎或克 隆氏病的方法，該方法包括給受試者施用治療有效量的來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞， 從而治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病。本文所用術(shù)語“治療”指預(yù)防、治愈、逆轉(zhuǎn)、減弱、緩解、最小化、抑制或阻止?jié)冃?結(jié)腸炎或克隆氏病的有害效果。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解，可使用各種方法學(xué)和測定 法來評價病理的發(fā)展，且相似地，各種方法學(xué)和測定法可用于評價病理的減少、減輕或減退。本文所用術(shù)語“潰瘍性結(jié)腸炎”指腸的一種醫(yī)學(xué)狀況，即炎性腸病(IBD)的一種形 式，特別是大腸或結(jié)腸的醫(yī)學(xué)狀況，其包括結(jié)腸中的特征性潰瘍或開放性瘡。潰瘍性結(jié)腸炎 疾病通常根據(jù)逐漸發(fā)作的、混有血的經(jīng)常性腹瀉的復(fù)發(fā)癥狀來診斷。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容 的潰瘍性結(jié)腸炎指潰瘍性結(jié)腸炎的任何階段或嚴(yán)重程度(例如，疾病減輕或急性疾病)。本文所用術(shù)語“克隆氏病”指可影響從口腔到肛門的胃腸道的任何部分的炎性狀 況，也稱為肉芽腫性結(jié)腸炎或局限性腸炎，并且是炎性腸病(IBD)的一種形式。克隆氏病是 自身免疫病的一種類型，通常根據(jù)腹痛、腹瀉(可能帶血)、嘔吐、體重減輕、皮疹、關(guān)節(jié)炎和 眼部炎癥的復(fù)發(fā)癥狀而診斷。根據(jù)本教導(dǎo)內(nèi)容的克隆氏病指克隆氏病的任何階段或嚴(yán)重程 度(例如，疾病減輕、急性疾病、復(fù)發(fā))。本文所用短語“有需要的受試者”指哺乳動物，優(yōu)選人受試者(任何年齡的男性或 女性)，其已被診斷為可能或確定患有潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病，例如，經(jīng)歷炎性結(jié)腸疾病 的受試者。潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的診斷可包括任何診斷測試，例如，實(shí)驗(yàn)室測試、內(nèi)窺 鏡評價、粘膜活檢(對于潰瘍性結(jié)腸炎)，鋇餐χ-線(barium follow-through x-ray)(對 于克隆氏病)以及CT或MRI掃描(對于克隆氏病)。應(yīng)理解的是本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的貼壁細(xì)胞治療其他結(jié)腸炎性狀況，包括但 不限于慢性炎性腸病(Garcia Herola Α.等，Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan ；23(1) 16)、腹部疾病(Landau YE.和 Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16 ； 138 (2) :122)和回腸 炎。如上文所述，根據(jù)本發(fā)明的該方面，該方法通過給受試者施用治療有效量的來自 胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。本文所用短語“貼壁細(xì)胞”指貼壁依賴的，即需要附著在表面上以體外生長的均質(zhì) 或異質(zhì)細(xì)胞群。本文所用短語“脂肪組織”指包含脂肪細(xì)胞(adipocytes)的結(jié)締組織。
本文所用術(shù)語“胎盤組織”指覆蓋子宮壁里層并在妊娠期間包裹胎兒的哺乳動物 雌性器官的任何部分，胎兒通過臍帶連接于胎盤組織。出生后，胎盤排出(稱為產(chǎn)后胎盤)。 在一個示例性實(shí)施方案中，胎盤指完整的胎盤。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，源自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞可使用二維QD)或三維 (3D)培養(yǎng)條件增殖。本文所用短語“二維培養(yǎng)”指這樣的培養(yǎng)其中將細(xì)胞置于與細(xì)胞生長相容的條件 下同時使得細(xì)胞在一個平面上生長。本發(fā)明二維培養(yǎng)的條件被設(shè)計(jì)為可使貼壁細(xì)胞擴(kuò)增。本文所用短語“三維培養(yǎng)”指這樣的培養(yǎng)其中將細(xì)胞置于與細(xì)胞生長相容的條件 下同時使得細(xì)胞在多于一層上生長。已經(jīng)充分理解的是細(xì)胞在活生物體(或組織)中的原 位環(huán)境是在三維構(gòu)造中。細(xì)胞被其它細(xì)胞圍繞。它們被保持在使得可建立各種局部微環(huán)境 的胞外基質(zhì)納米級纖維的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中。它們的胞外配體不僅介導(dǎo)對基底膜的附著，而且還 可到達(dá)多種血管和淋巴管。氧、激素和營養(yǎng)物質(zhì)被運(yùn)送到細(xì)胞而廢物則被運(yùn)出。本發(fā)明三 維培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)為模擬例如以下進(jìn)一步例證的環(huán)境。應(yīng)理解的是二維和三維培養(yǎng)條件使得能夠擴(kuò)增貼壁細(xì)胞。本文所用術(shù)語“擴(kuò)增(expanding)，，和“擴(kuò)增(expansion)，，指基本上無分化地維 持細(xì)胞及最終細(xì)胞生長，即，使細(xì)胞群增加(例如，至少2倍)而不存在伴隨所述增加的分 化。本文所用術(shù)語“維持(maintaining)，，和“維持(maintenance)，，指基本上無分化 的細(xì)胞更新，即基本上穩(wěn)定的細(xì)胞群而無伴隨所述穩(wěn)定的分化。如所述，本發(fā)明這一方面的貼壁細(xì)胞提取自脂肪或胎盤組織?？蓮淖阍禄蛟绠a(chǎn)胎盤得到胎盤細(xì)胞。優(yōu)選地，一旦胎盤外出血，就收集胎盤。 優(yōu)選以足夠除去殘留細(xì)胞的時間灌注胎盤。本文所用術(shù)語“灌注”(perfuse)或“灌 注”(perfusion)指將流體傾注在器官或組織上或使流體通過器官或組織的行為。胎盤組 織可來自任何哺乳動物；例如胎盤組織是人的。方便的胎盤組織來源是來自產(chǎn)后胎盤(例 如1-6小時)，但是，胎盤組織或細(xì)胞的來源或分離胎盤組織的方法對于本發(fā)明而言并不是 關(guān)鍵的。源自胎盤的貼壁細(xì)胞可獲自胎盤的胎兒(即羊膜或胎盤的內(nèi)部部分，參見實(shí)施例 1)和母體(即基蛻膜和壁蛻膜)部分。在生理緩沖液[例如磷酸緩沖鹽水(PBQ或Hank’s 緩沖液)中洗滌組織標(biāo)本。通過用消化酶處理組織(參見下文)或/和切碎并用洗滌介 質(zhì)將組織部分沖洗經(jīng)過尼龍濾器或通過輕柔吸移(Falcon，Becton, Dickinson, San Jose, CA)，制備單細(xì)胞懸浮液。源自脂肪組織的貼壁細(xì)胞可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方法來分離。例 如，這樣的方法描述于美國專利號6，153，432。脂肪組織可源自網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳腺、性腺或其 它脂肪組織部位。脂肪組織的一種來源為網(wǎng)膜脂肪。在人類中，脂肪通常通過吸脂來分離。源自胎盤或脂肪組織的分離的貼壁細(xì)胞可通過如下方法得到用消化酶例如膠 原酶、胰蛋白酶和/或分散酶；和/或有效濃度的透明質(zhì)酸酶或DNA酶；和乙二胺四乙酸 (EDTA)處理組織；在25-50°C的溫度處理10分鐘到3小時。然后可以讓細(xì)胞通過20微米-1 毫米的尼龍或干酪包布網(wǎng)濾器。然后讓細(xì)胞直接在培養(yǎng)基中或經(jīng)Ficoll或Percoll或其 它顆粒梯度進(jìn)行差速離心。細(xì)胞在4-50°C的溫度以100-3000xg的速度離心1分鐘至1小時(參見美國專利號 , 078，230)。除源自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞外，本發(fā)明還涉及特征在于基質(zhì)干細(xì)胞表型的 來自其它細(xì)胞來源的貼壁細(xì)胞的用途(其將在下文進(jìn)一步闡述)?？蓮钠渲刑崛≠N壁細(xì)胞 的組織來源包括但不限于臍帶血、頭皮、毛囊[例如美國專利申請?zhí)?0060172304所述]、 睪丸[例如 Guan K.等，Nature. 2006 Apr 27 ；440 (7088) :1199-203 所述]、人嗅粘膜[例 如 Marshall，CT.等，Histol Histopathol. 2006 Jun :21(6) :633-43 所述]、胚胎卵黃囊 [例如 Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8 ；427 (6970) :148-54所述]和羊水[Pieternella 等 (2004) Stem Cells. 22 1338-1345]，已知它們都包含間充質(zhì)干細(xì)胞。來自這些組織來源的 貼壁細(xì)胞可以通過在附著表面上培養(yǎng)細(xì)胞來分離，由此從原始群中的其它細(xì)胞分離出貼壁 細(xì)胞。無論來源(例如胎盤或脂肪組織)，優(yōu)選在無菌條件下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞提取。一旦得到 分離的細(xì)胞，就使其附著到附著材料(例如設(shè)置為表面)上，由此分離貼壁細(xì)胞。然后，培 養(yǎng)可在2D條件下(如實(shí)施例部分的實(shí)施例2描述的)進(jìn)行且細(xì)胞可進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至3D條件 (如實(shí)施例部分的實(shí)施例1和3描述的)。本文所用“附著材料”指具有可讓細(xì)胞保持在表面上的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如帶電荷的 表面暴露基團(tuán))的合成、天然存在或其組合的非細(xì)胞毒性(即生物相容)材料?？筛鶕?jù)本發(fā)明的這方面使用的附著材料的實(shí)例包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚亞 烷基(polyalkylene)、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纖維素、玻璃纖維、陶瓷 顆粒、基質(zhì)膠(matrigel)、胞外基質(zhì)組分(例如纖連蛋白、軟骨粘連蛋白、層粘連蛋白)、膠 原、聚L乳酸和惰性金屬纖維。應(yīng)理解的是胎盤或脂肪細(xì)胞的接種通常以3士0. 2xl03個細(xì)胞/cm2的培養(yǎng)密度實(shí) 現(xiàn)。接種后，通常將細(xì)胞培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)箱中在37°C下具有5% CO2的濕潤條件下培養(yǎng)。用本領(lǐng)域熟知方法可實(shí)現(xiàn)純化或富集基質(zhì)干細(xì)胞的其他步驟(例如通過采用基 質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的FACS，其在下文進(jìn)一步描述)?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例包括極限必需培養(yǎng)基 Eagle、ADC-I、LPM(無牛血清白蛋白)、FlO (HAM)、F12 (HAM)、DCCMl、DCCM2、RPMI 1640、BGJ 培養(yǎng)基(進(jìn)行和不進(jìn)行Fitton-Jackson改良)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle (BME-加入Earle’ s鹽 基)、Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM-無血清)、Yamane、IMEM_20、Glasgow 改良 Eagle 培養(yǎng)基(GMEM) ,Leibovitz L-15 培養(yǎng)基、McCoy，s5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199 (M199E-含Earle，s 鹽基)、培養(yǎng)基M199 (M199H-含Hank，s鹽基)、極限必需培養(yǎng)基Eagle (MEM-E-含Earle，s 鹽基)、極限必需培養(yǎng)基fegle (MEM-Η-含Hank’ s鹽基)和極限必須培養(yǎng)基fegle (MEM-NAA， 含非必須氨基酸)，以及數(shù)目眾多的其他培養(yǎng)基，包括培養(yǎng)基199、CMRL 1415,CMRL 1969、 CMRL 1066、NCTC135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams ‘ G、Ne μ man&Tytell、 Higuchi, MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153。用于本發(fā)明的 優(yōu)選培養(yǎng)基為DMEM。這些和其它有用的培養(yǎng)基可購自GIBCO，Grand Island, N. Y.，USA和 Biological Industries,Bet HaEmek，Israel 等等。大量的這些培養(yǎng)基概述于 Methods in Enzymology，第 LVIII 卷，“Cell Culture”，第 6272 頁，William B. Jakoby 和 Ira H. Pastan 編輯，Academic Press, Inc.出版。培養(yǎng)基可補(bǔ)充例如血清，例如?；蚱渌锓N的胎血清，以及任選或可選地補(bǔ)充皮
9克/ml-毫克/ml水平濃度的生長因子、維生素(例如抗壞血酸)、細(xì)胞因子、鹽(例如B-甘 油磷酸鹽)、類固醇(例如地塞米松)以及激素(例如生長激素)、促紅細(xì)胞生成素、促血小 板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、c-kit配體/干細(xì)胞因子、 護(hù)骨蛋白配體、胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長 因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板來源的生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白。應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識到可將另外的組分加入培養(yǎng)基中。這樣的組分可以是抗生素、抗真 菌劑、白蛋白、氨基酸和本領(lǐng)域已知用于細(xì)胞培養(yǎng)的其它組分。此外，需要時可加入組分以 增強(qiáng)分化過程(參見以下進(jìn)一步描述)。應(yīng)理解的是在本發(fā)明的貼壁細(xì)胞被施用給人受試者的情況下，細(xì)胞和培養(yǎng)基(例 如，含有上述培養(yǎng)基添加劑)應(yīng)基本上不含異種成分，即沒有任何動物污染物例如支原體。 例如，培養(yǎng)基可補(bǔ)充血清替代物、人血清和/或合成或重組產(chǎn)生的因子。如所述，一旦取得貼壁細(xì)胞就可將其傳代到2D或3D環(huán)境(參見以下實(shí)施例部分 的實(shí)施例1、2和3)。但是應(yīng)該理解，可在分離后立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3D構(gòu)造的基質(zhì)中，或可 選地，在2D條件之后傳代到3D環(huán)境(如上文所述)。應(yīng)理解的是在2D培養(yǎng)條件中，貼壁細(xì)胞可連續(xù)傳代。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方 案，細(xì)胞可傳代至少4代、至少5代、至少6代、至少7代或至少8代。應(yīng)理解的是通常當(dāng)培 養(yǎng)物達(dá)到約70-80%匯合時，通常在3-5天(1. 5-2倍增)后，將細(xì)胞傳代。此外，在2D培 養(yǎng)條件下，細(xì)胞可在無抗生素補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中從至少第2代、至少第3代或至少第4代生長。因此，在2D培養(yǎng)中，培養(yǎng)進(jìn)行至少約2天、3天、4天、5天、10天、20天、1個月或甚 至更長。也可進(jìn)行傳代來增加細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)理解的是可更換培養(yǎng)基以延長并改進(jìn)培養(yǎng)條件。當(dāng)至少約12%的細(xì)胞增殖時，可收獲2D貼壁細(xì)胞，同時避免不受控制的分化和衰
ο本發(fā)明的一些實(shí)施方案的2D貼壁細(xì)胞包含至少約10%、28%、30%、50%、80%或 更多增殖的細(xì)胞(如可通過FACS監(jiān)測S和/或G2/M期來測定)。如所述，貼壁細(xì)胞可轉(zhuǎn)移到3D環(huán)境。因此，本發(fā)明這方面的附著材料被設(shè)置為用于3D培養(yǎng)，由此提供充分增加用于細(xì) 胞附著的可用附著表面的生長基質(zhì)，以便模擬組織(例如胎盤)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。對于大規(guī)模生產(chǎn)，可在3D生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。這樣的生物反應(yīng)器的實(shí)例包括但不限于活塞流動生物反應(yīng)器、連續(xù)攪拌罐 生物反應(yīng)器、固定床生物反應(yīng)器、CelliGen Plus 生物反應(yīng)器系統(tǒng)(New Brunswick Scientific(NBS))或 BIOFLO 310 生物反應(yīng)器系統(tǒng)(New Brunswick Scientific (NBS)。如實(shí)施例部分的實(shí)施例3所示，Celligen生物反應(yīng)器可在受控條件下(例如，pH、 溫度和氧氣水平)且利用恒定的細(xì)胞生長培養(yǎng)基灌注來進(jìn)行貼壁細(xì)胞的3D擴(kuò)增。而且，可 直接監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖、乳酸鹽、谷氨酰胺、谷氨酸和銨的濃度水平。貼壁細(xì)胞的葡 萄糖消耗速率和乳酸鹽形成速率使得可以測量細(xì)胞生長速率并確定收獲時間。可用于本發(fā)明的其它3D生物反應(yīng)器包括但不限于連續(xù)攪拌罐生物反應(yīng)器，其中 使培養(yǎng)基連續(xù)進(jìn)料到生物反應(yīng)器中，將產(chǎn)物連續(xù)抽出，以維持反應(yīng)器內(nèi)的時間恒定穩(wěn)態(tài)。 帶有纖維床籃的攪拌罐生物反應(yīng)器可購自例如New Brunswick Scientific Co. Edison,NJ、固定床生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器(其中空氣通常通入中央導(dǎo)管的底部，向上流 動同時形成氣泡，在柱頂分離廢氣)、含有Polyactive泡沫的細(xì)胞接種灌注生物反應(yīng)器 (如 Wendt，D.等，Biotechnol Bioeng 84:205-214，(2003)所述)、帶有管狀聚 L-乳 酸(PLLA)多孔支架的徑向流灌注生物反應(yīng)器[如Kitagawa等，Biotechnology and Bioengineering93(5) =947-954(2006)所述]。可根據(jù)本發(fā)明使用的其它生物反應(yīng)器闡述 于美國專利號 6，277，151,6197, 575,6139, 578,6132, 463,5902, 741 和 5，629，186。接種時細(xì)胞接種優(yōu)選達(dá)到100，000-1, 500，000個細(xì)胞/mm。在一個示例性實(shí)施方 案中，接種共150士30xl06個細(xì)胞，接種3-5xl06個細(xì)胞/gr載體，或接種0. 015-0. IxlO6個 細(xì)胞/ml。培養(yǎng)進(jìn)行至少約2天、3天、4天、5天、10天、20天、1個月或甚至更長。應(yīng)理解的 是，在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)可能延長這一階段。在3D培養(yǎng)中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞可在培養(yǎng)基的連 續(xù)流動下實(shí)現(xiàn)。也可進(jìn)行傳代以增加細(xì)胞數(shù)目。應(yīng)理解的是可更換培養(yǎng)基以延長和改進(jìn)培 養(yǎng)條件。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，在3D培養(yǎng)下培養(yǎng)貼壁細(xì)胞可在培養(yǎng)基的灌注下實(shí) 現(xiàn)。通常地，通過貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度來確定灌注速率。因此，根據(jù)本發(fā)明的教 導(dǎo)，當(dāng)葡萄糖濃度為約500mg/L、約550mg/L或約600mg/L時，可更換培養(yǎng)基。當(dāng)至少約10%的細(xì)胞正在增殖時收獲3D貼壁細(xì)胞且同時避免不受控的分化和衰
ο本發(fā)明的一些實(shí)施方案的3D貼壁細(xì)胞包含至少約10%、28%、30%、50%、80%或 更多增殖細(xì)胞(如可通過FACS監(jiān)測S和/或G2/M期來測定)。本發(fā)明一些實(shí)施方案的貼壁細(xì)胞可包含至少一種“基質(zhì)干細(xì)胞表型”。本文所用“基質(zhì)干細(xì)胞表型”指源自骨髓的基質(zhì)(即間充質(zhì))干細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu) 或功能表型。本文所用短語“干細(xì)胞”指沒有最終分化的細(xì)胞。因此，例如，細(xì)胞可能具有紡錘形?？蛇x地或另外地，細(xì)胞可表達(dá)基質(zhì)干細(xì)胞典型 的標(biāo)記或標(biāo)記集合(例如表面標(biāo)記)?；|(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記(陽性和陰性)的實(shí)例包括但 不限于 CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD3-、CD4-、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、 CD20-、CDlIB-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-和FMC7-。其它基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記包括但不限
于酪氨酸羥化酶、巢蛋白和H-NF。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案，貼壁細(xì)胞不表達(dá)Oct-4。應(yīng)理解的是根據(jù)本教導(dǎo)產(chǎn)生的胎盤組織的2D貼壁細(xì)胞具有基本上如下文實(shí)施例 部分的表8所述的基因表達(dá)概況。而根據(jù)本教導(dǎo)產(chǎn)生的胎盤組織的3D貼壁細(xì)胞具有基本 上如下文實(shí)施例部分的表11所述的基因表達(dá)概況。根據(jù)一個示例性實(shí)施方案，與在相同條件下生長并分化的來自骨髓的貼壁細(xì)胞相 比，本發(fā)明的2D和3D貼壁細(xì)胞較少地定型為分化為成骨細(xì)胞系或成脂肪細(xì)胞系?；|(zhì)干細(xì)胞典型的功能表型的實(shí)例包括但不限于T細(xì)胞抑制活性(它們不刺激T 細(xì)胞而相反抑制T細(xì)胞)以及造血干細(xì)胞支持活性。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，本發(fā)明的貼壁細(xì)胞能夠抑制受試者中的免疫反應(yīng)。本文所用短語“抑制受試者中的免疫反應(yīng)”指降低或抑制發(fā)生在受試者中的反應(yīng)于抗原(例如，外源細(xì)胞或其部分)的免疫反應(yīng)?？杀毁N壁細(xì)胞抑制的免疫應(yīng)答包括體液 免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其分別涉及通過抗體和T-淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞的增殖)特異識別 病原體抗原。如下文實(shí)施例部分的實(shí)施例4-5所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的2D和3D貼壁細(xì)胞在結(jié)腸炎 性狀況中誘導(dǎo)抗炎效果。將進(jìn)一步理解的是該效果可通過細(xì)胞本身介導(dǎo)或甚至在細(xì)胞不存 在的情況下通過分泌的因子介導(dǎo)因而具有抗炎效果。因此，本發(fā)明的貼壁細(xì)胞可優(yōu)選用于 治療腸炎癥，例如在潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病的狀況中。短語“給受試者施用，，指將本發(fā)明的細(xì)胞引入靶組織。這些細(xì)胞可源自接受者或 來自同種異體或異種供體。這一短語也包含將本發(fā)明的細(xì)胞“移植”、“細(xì)胞替換”或“植入” 受試者中。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，貼壁細(xì)胞可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員之一已知的任 何方法施用給受試者，例如，通過靜脈內(nèi)(iv)，肌內(nèi)(im)或腹膜內(nèi)(ip)施用?？筛鶕?jù)本發(fā)明這一方面施用的細(xì)胞包括上述可在三維或二維環(huán)境中培養(yǎng)的貼壁 細(xì)胞及其間充質(zhì)和非間充質(zhì)的部分或最終分化衍生物。從本發(fā)明的基質(zhì)干細(xì)胞中衍生譜系特異性細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域熟知。參見例如美 國專利號 5，486，359,5, 942，225,5, 736，396,5, 908，784 和 5，902，741。細(xì)胞可以是幼稚的或基因修飾的，從而衍生感興趣的譜系(參見美國專利申請?zhí)?20030219423)。細(xì)胞可以是自體或非自體來源(即同種異體或異種)的新鮮或冷凍(例如，冷藏 的)制劑。因?yàn)榉亲泽w細(xì)胞在施用給身體時會誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所以已開發(fā)了數(shù)種方法以降低 排斥非自體細(xì)胞的可能性。這些包括抑制接受者的免疫系統(tǒng)或在移植前將非自體細(xì)胞膠囊 化在免疫隔離的半透膜中。膠囊化(encapsulation)技術(shù)通常分類為微膠囊化，其涉及小的球狀載體， 和大膠囊化(macroencapsulation)，其涉及較大的平板和中空纖維膜(Uludag, H.等， Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000 ;42 :29-64)。制備微膠囊的方法為本領(lǐng)域已知，包括例如如下文獻(xiàn)公開的方法Lu MZ等， Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamyIidene-acetylate d poly(allylamine). Biotechnol Bioeng.2000，70 :479-83，Chang TM and Prakash S.Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineeredmicroorganisms. Mol Biotechnol. 2001，17 :249-60 禾口 Lu MZ 等，A novel cell encapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamyli deneacetate). J Microencapsul. 2000,17 :245-51。例如，通過將修飾的膠原與甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和 甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元共聚物殼進(jìn)行配合，制備微膠囊，得到2-5 μ m的膠囊厚度。 這樣的微膠囊可進(jìn)一步用另外的2-5 μ m三元共聚物殼膠囊化，以提供帶負(fù)電荷的光滑表 面并使血漿蛋白吸收最小化(Chia，S. Μ.等，Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials. 200223 :849-56)。其它微膠囊基于藻酸鹽、海洋多糖(Sambmis，A. Encapsulated islets indiabetes treatment. Diabetes Technol. Ther. 2003,5 :665-8)或其衍生物。例如,可通過 在氯化鈣存在下聚陰離子藻酸鈉和硫酸纖維素鈉與聚陽離子聚(亞甲基-共-胍)鹽酸鹽 之間的聚電解質(zhì)配合作用來制備微膠囊?？梢岳斫獾氖牵?dāng)使用較小的膠囊時改進(jìn)了細(xì)胞膠囊化。因此，當(dāng)膠囊大小從 Imm減小到400 μ m時，膠囊化細(xì)胞的質(zhì)量控制、機(jī)械穩(wěn)定性、分散特性和體外活性得到改 進(jìn)(Canaple L.等，Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym編輯· 2002 ；13 :783-96)。此外，發(fā)現(xiàn)具有很好地控制的小至7nm的孔徑、定制 的(tailored)表面化學(xué)和精確的微構(gòu)造的納米孔生物膠囊成功地為細(xì)胞免疫隔離出微
(Williams D. Small is beautiful :microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999,10 6~9 ；Desai, Τ.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther.2002,2 633-46)?？墒褂玫拿庖咭种苿┑膶?shí)例包括但不限于氨甲蝶呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、環(huán)孢 霉素A、氯喹、羥氯喹、柳氮磺吡啶(sulphasalazopyrine)、金鹽、D-青霉胺、來氟米特、硫唑 嘌呤、阿那白滯素(anakinra)、英夫利昔單抗(REMICADE)、依那西普(etanerc印t)、TNF α 阻斷劑、靶向炎性細(xì)胞因子的生物制劑以及非類固醇抗炎藥(NSAIDs)。NSAIDs的實(shí)例包括 但不限于乙酰水楊酸、水楊酸膽堿鎂、二氟尼柳、水楊酸鎂、雙水楊酸酯、水楊酸鈉、雙氯芬 酸、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、萘普生、萘丁 美酮、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、對乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制劑和曲馬多。根據(jù)醫(yī)學(xué)狀況，可用另外的化學(xué)藥物(例如免疫調(diào)節(jié)藥、化療藥、抗炎藥等)或細(xì) 胞施用給受試者。為了治療炎性結(jié)腸狀況，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病，可使用本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員之一已知的任何治療，包括例如，氨基水楊酸鹽(Aminosalicylates)(例如 柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮、奧沙拉秦)，皮質(zhì)類固醇(例如可的松、潑尼松、潑尼松 龍、Cortifoam、氫化可的松、甲基潑尼松龍、倍氯米松、布地奈德)，免疫抑制藥物(例 如巰嘌呤、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、他克幕司)，生物治療(例如英夫利昔單抗、維西珠單抗 (Visilizumab))、低分子量肝素(LMWH)、飲食調(diào)整(例如纖維)和手術(shù)。也可給受試者施用抗炎劑，例如但不限于阿氯芬酸、二丙酸阿氯米松、丙縮阿爾 孕酮、α淀粉酶、安西法爾、安西非特、安分酸鈉、鹽酸氨普立糖、阿那白滯素、阿尼羅酸、阿 尼扎芬、炎爽痛、巴柳氮二鈉、芐達(dá)酸、苯惡洛芬、鹽酸炎痛靜、菠蘿蛋白酶、溴哌莫、布地奈 德、卡洛芬、環(huán)洛芬、辛噴他宗、克利洛芬、丙酸氯倍他索、丁氯倍他松、氯吡酸、丙酸氯硫卡 松、醋酸可米松、可托多松、地夫可特、地奈德、去羥米松、二丙酸地塞米松、雙氯芬酸鉀、雙 氯芬酸鈉、二乙酸二氟拉松、二氟米酮鈉、二氟尼柳、二氟潑尼酯、地弗他酮、二甲基亞砜、 羥西奈德、恩甲羥松、恩莫單抗、依諾利康鈉、依匹唑、依托度酸、依托芬那酯、聯(lián)苯乙酸、非 那莫、芬布芬、芬氯酸、苯克洛酸、芬度柳、苯吡帕酮、芬替酸、夫拉扎酮、氟扎可特、氟芬那 酸、Flumizole、醋酸氟尼縮松、氟尼辛、氟尼辛葡甲胺、氟可丁酯、醋酸氟米龍、氟喹宗、氟 比洛芬、氟瑞托芬、丙酸氟替卡松、呋喃洛芬、呋羅布芬、哈西奈德、丙酸鹵倍他索、醋酸鹵潑 尼松、異丁芬酸、布洛芬、布洛芬鋁、布洛芬吡啶甲醇、伊洛達(dá)普、吲哚美辛、吲哚美辛鈉、吲 哚洛芬、吲哚克索、吲四唑、醋酸異氟潑尼松、伊索克酸、伊索昔康、酮洛芬、鹽酸洛非咪唑、Lomoxicam、氯替潑諾碳酸乙酯、甲氯芬那酸鈉、甲氧芬那酸、二丁酸洛非咪唑、甲芬那酸、 5-氨基水楊酸、美西拉宗、磺庚甲潑尼松龍、Momiflumate、萘丁美酮、萘普生、萘普生鈉、萘 普索、尼馬宗、奧沙拉秦鈉、奧古蛋白、奧帕諾辛、惡哌拉嗪、羥布宗、鹽酸瑞尼托林、戊聚硫 鈉、保泰松甘油酸鈉、吡非尼酮、吡羅昔康、肉桂酸吡羅昔康、吡羅昔康乙醇胺、吡洛芬、潑那 扎特、普立非酮、普羅度酸、普羅喹宗、普羅沙唑、檸檬酸普羅沙唑、利美索龍、氯馬扎利、柳 膽來司、沙那西定、雙水楊酯、血根氯銨、司克拉宗、絲美辛、舒多昔康、舒林酸、舒洛芬、他美 辛、他尼氟酯、他洛柳酯、特丁非隆、替尼達(dá)普、替尼達(dá)普鈉、替諾昔康、替昔康、替昔米德、四 氫甲吲胺、硫平酸、替可的松匹伐酯、托美丁、托美丁鈉、三氯氟松、三氟米酯、齊多美辛、佐 美酸鈉。在本文所述任一方法中，可以施用細(xì)胞本身，或優(yōu)選作為進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受 載體的藥物組合物的一部分來施用。本文所用“藥物組合物”指含有其它化學(xué)組分例如藥 學(xué)適用的載體和賦形劑的本發(fā)明的貼壁細(xì)胞(即來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞，其獲自 2D或3D培養(yǎng))的制劑。藥物組合物的目的是方便將細(xì)胞施用給受試者。下文所用術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”指載體或稀釋劑，其不會引起對受試者的明顯 刺激，并且不消除所施用化合物的生物學(xué)活性和特性。載體的非限制性實(shí)例為丙二醇、鹽 水、乳液和有機(jī)溶劑與水的混合物。本文所用術(shù)語“賦形劑”指加入藥物組合物中以進(jìn)一步方便施用化合物的惰性物 質(zhì)。賦形劑的非限制性實(shí)例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、 明膠、植物油和聚乙二醇。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，藥學(xué)載體為鹽的水溶液。配制禾口施用藥物的技術(shù)可在 “Remington' s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，其通過引用并入本文?？梢匀矸绞绞┯盟幬锝M合物(如上文所述)?；蛘?，可局部施用藥物組合物，例 如，通過直接將藥物組合物注射到患者的組織區(qū)。可通過本領(lǐng)域熟知的方法來制備本發(fā)明藥物組合物，例如通過常規(guī)的混合、溶解、 制粒、制成糖錠、磨細(xì)、乳化、膠囊化、包埋或凍干方法。因此，可用一種或更多種包含賦形劑和助劑的生理學(xué)可接受的載體以常規(guī)方式來 配制用于根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物，所述載體促進(jìn)將活性成分加工成可在藥學(xué)上使用 的制劑。合適的制劑取決于所選擇的施用途徑。對于注射而言，可在水溶液，優(yōu)選在生理相容的緩沖液例如Hank’ s溶液、 Ringer' s溶液、生理鹽緩沖液或包含冷凍保護(hù)劑的冷凍介質(zhì)中配制藥物組合物的活性成 分。對于經(jīng)粘膜施用，制劑中使用適于待滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常為本領(lǐng) 域所知。治療有效量的確定是完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的，特別是根據(jù)本文提 供的詳細(xì)公開內(nèi)容。對于用于本發(fā)明方法中的任何制劑而言，可從體外和細(xì)胞培養(yǎng)測定中初步估計(jì)治 療有效量或劑量。優(yōu)選在動物模型中定制劑量以達(dá)到所需的濃度或滴度。這樣的信息可用 于更準(zhǔn)確地確定人的有用劑量。可通過體外、在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序測定本文所述活性成分的毒性和療效。從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可用于定制供人類使 用的劑量范圍。劑量可根據(jù)所用劑型和所用施用途徑而變化?？赏ㄟ^單個醫(yī)生考慮患者 狀況選擇確切的制劑、施用途徑和劑量(參見例如Fingl等，1975，The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1 章第 1 頁)0可單獨(dú)調(diào)整劑量和間隔，以達(dá)到以下活性成分水平即，其足以通過植入的細(xì)胞有 效調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成。達(dá)到所需效果所必須的劑量將依賴于個體特征和施用途徑。檢測測 定可用于測定血漿濃度。根據(jù)待治療狀況的嚴(yán)重程度和反應(yīng)性，可單次或多次施用，且療程持續(xù)若干天到 若干周，或達(dá)到減輕疾病狀態(tài)。當(dāng)然，待施用的組合物的量將依賴于接受治療的個體、病痛的嚴(yán)重程度、施用方 式、主治醫(yī)生的判斷等等。施用劑量和時間安排應(yīng)該對個體改變狀況的仔細(xì)和連續(xù)監(jiān)測作 出反應(yīng)。炎性結(jié)腸疾病模型包括潰瘍性結(jié)腸炎的動物模型，例如但不限于，大鼠和小鼠中 的三硝基苯磺酸(TNBS)-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[Komori 等，J Gastroenterol (2005)40 :591-599 ； 和下文實(shí)施例4-5]。包括配制在相容性藥物載體中的本發(fā)明制劑的組合物也可以經(jīng)制備、置于合適的 容器中；并標(biāo)記用于指出的狀況的治療。若有需要，本發(fā)明組合物可以存在于包(pack)或分配裝置(dipenser device), 例如FDA批準(zhǔn)的試劑盒中，其可包含含有活性成分的一個或更多個單位劑型。所述包可例 如包含金屬或塑料箔，例如氣泡包(blister pack)。所述包或分配裝置可附有施用說明書。 包或分配裝置還可提供公告，其附于由管理藥物生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式 的容器，所述公告反映該機(jī)構(gòu)對組合物形式或人或獸醫(yī)施用的批準(zhǔn)。這樣的公告例如可以 是由美國食品和藥品管理局對處方藥物批準(zhǔn)的標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁。本發(fā)明的貼壁細(xì)胞可適當(dāng)?shù)嘏渲瞥煽珊线m地包裝為制品的藥物組合物。這樣的制 品包括用于治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的標(biāo)簽，該包裝材料包裝藥學(xué)有效量的來自胎盤 或脂肪組織的貼壁細(xì)胞。將理解的是，該制品可進(jìn)一步包含治療結(jié)腸炎性狀況的另外的藥物，包括例如，抗 炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑和其他治療炎性結(jié)腸狀況的藥物(如下文進(jìn)一步詳述)。本文所用術(shù)語“約”指士 10%。術(shù)語“包括”、“包含”、“含有”、“具有”及其變化形式是“包含但不限于”。術(shù)語“由…組成”意思是“包含且限于”。術(shù)語“基本由…組成”意思是組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括另外的成分、步驟和/或 部分，但是僅在另外的成分、步驟和/或部分不能實(shí)質(zhì)性地改變所要求保護(hù)的組合物、方法 或結(jié)構(gòu)的基本特征和新特征的條件下。本文所用單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文明確地指出 另外的意思。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一個化合物”可包括多個化合物，包括其混 合物。在本申請中，本發(fā)明的各種實(shí)施方案可以范圍形式表示。應(yīng)理解的是范圍形式的 描述的目的僅在于方便和簡要，不應(yīng)解釋為對發(fā)明范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應(yīng)認(rèn)為具有具體公開的全部可能的子范圍以及在那個范圍中的各個數(shù)值。例如，范圍例如1-6 的描述應(yīng)認(rèn)為具有具體公開的子范圍，例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及那個范圍 中的各個數(shù)字，例如1、2、3、4、5和6。不管范圍的寬度如何，這都適用。當(dāng)本文指出數(shù)字范圍時，意欲包含在所指出范圍中任意引用的數(shù)值(分?jǐn)?shù)或整 數(shù))。短語“在第一個指出的數(shù)字與第二個指出的數(shù)字之間”以及“從第一個指出的數(shù)字到 第二個指出的數(shù)字”在本文可互換使用，意欲包含第一個和第二個指出的數(shù)字以及在它們 之間的所有分?jǐn)?shù)或整數(shù)。本文所用術(shù)語“方法”指為了完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，其包含但不 限于，化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者已知的那些方式、手段、技術(shù)和 程序，或者化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者可容易地從已知的方式、手 段、技術(shù)和程序開發(fā)的方式、手段、技術(shù)和程序。可以理解，為了清楚起見，在分開的實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的某些 特征也可在單個實(shí)施方案中組合提供。反過來，為了簡要起見，在單個實(shí)施方案的上下文中 所描述的本發(fā)明的各種特征也可在本發(fā)明的任何其他所述實(shí)施方案中單獨(dú)地、或以任何合 適的亞組合或以合適的方式來提供。各種實(shí)施方案的上下文中所述的某些特征不應(yīng)認(rèn)為是 那些實(shí)施方案的必要特征，除非該實(shí)施方案沒有那些要素則不起作用。如上文描繪和下文權(quán)利要求部分所要求保護(hù)的本發(fā)明各個實(shí)施方案和方面可在 下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例現(xiàn)在參考以下實(shí)施例，其與上述說明一起以非限制方式闡明本發(fā)明。本文所用命名法和本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)操作通常包括分子、生化、微生物學(xué)和重 組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見例如‘‘Molecular Cloning A laboratory Manual “ Sambrook 等，(1989) ； “ Current Protocols in Molecular Biology "第 I-III 卷，Ausubel，R.M.編輯(1994) ；Ausubel 等，“Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley 禾口 Sons,Baltimore,Maryland(1989) ；Perbal, " A Practical Guide to Molecular Cloning " , John Wiley & Sons, New York(1988)； Watson 等，"Recombinant DNA" , Scientific American Books, New York ；B irren 等 (編輯)"Genome Analysis :A Laboratory Manual Series “,第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)；如美國專利第 4，666，8 號、第 4，683，202 號、第 4，801，531 號、第 5，192，659 號和第 5，272，057 號提出的方法；“CellBiology =A Laboratory Handbook"，第 I-III 卷 Cellis，J. Ε.編輯(1994) ； “ Current Protocols in Immunology “第 I-III 卷 Coligan J. Ε.編輯(1994) Jtites 等(編輯)，“Basic and Clinical Immunology “(第 8 版)，Appleton&Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishell 禾口 Shiigi (編輯)，“Selected Methods in Cellular Immunology" , W. H. Freeman 禾口 Co.，NewYork(1980)；可用的免疫測定法廣泛闡述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見例如美國專 利第 3，791，932 號、第 3，839，153 號、第 3，850，752 號、第 3，850，578 號、第 3，853，987 號、 第 3，867，517 號、第 3，879，262 號、第 3，901，654 號、第 3，935，074 號、第 3，984，533 號、 第 3，996，345 號、第 4，034，074 號、第 4，098，876 號、第 4，879，219 號、第 5，011，771 號和
16第 5，281，521 號；“Oligonucleotide Synthesis" Gait, Μ. J.編輯(1984) ； “ Nucleic Acid Hybridization “ Hames, B. D.,禾口 Higgins S. J.編輯(1985) ； “ Transcription and Translation “ Hames，B. D.，和 Higgins S. J.編輯(1984) ； “ Animal Cell Culture "Fr e shney, R. I.編輯(1986) ； “ Immobilized Cells and Enzymes " IRL Press, (1986) ；〃 A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.，(1984)和〃 Methods in Enzymology“第 1-317 卷，Academic Press ； " PCR Protocols :A Guide To Methods and Applications" , Academic Press,San Diego,CA (1990) ；Marshak 等，"Strategies for Protein Purification and Characterization-Α Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；以上所有如同在本文完全闡述一樣通過引用并于本文。貫穿本文件提供了其 它一般的參考資料。認(rèn)為其中的程序?yàn)楸绢I(lǐng)域熟知，提供它們是為了方便讀者。其中所包 含的所有信息通過弓I用并入本文。實(shí)施例1產(chǎn)生源自胎盤的3D貼壁細(xì)胞的方法在含有3D載體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中如前所述產(chǎn)生貼壁細(xì)胞(參見 TO/2007/108003)，以產(chǎn)生3D-貼壁細(xì)胞(本文命名為PLX)。材料和實(shí)驗(yàn)操作源自胎盤的貼壁細(xì)胞在無菌條件下切下足月分娩胎盤的內(nèi)部部分(Bnei Zion醫(yī)學(xué)中心，Haifa， Israel)，用 Hank，s 緩沖液洗滌 3 次，在 37°C用 0. 1 %膠原酶(lmg/ml 組織；Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO)孵育3小時。輕輕抽吸，然后用補(bǔ)充了 10% FCS、青霉素-鏈霉素-制霉菌 素混合物(100U/ml 100 μ g/ml 1. 25un/ml)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗滌懸浮的細(xì) 胞，接種到75cm2燒瓶中并于37°C在含有5% CO2的濕潤條件下于組織培養(yǎng)箱中孵育。二維QD)細(xì)胞生長使細(xì)胞附著在塑料表面72小時，然后每3-4天更換培養(yǎng)基。2-3代后，將細(xì)胞冷 藏，解凍和接種在燒瓶中進(jìn)行二次生長。當(dāng)達(dá)到60-80%匯合時，用0. 25%胰蛋白酶-EDTA 使細(xì)胞從生長燒瓶上分離，并接種到新燒瓶中(通常每3-5天)，進(jìn)行另外的2-5次傳代。 此后收集培養(yǎng)的細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)。PluriX 活塞流動生物反應(yīng)器用由聚酯的非編織纖維基質(zhì)制成的I-IOOml填充的3D porrosive載體(直徑 4mm)裝填PluriX 活塞流動生物反應(yīng)器(Pluristem，Haifa, Israel ；也參見美國專利號 6，911，201和W0/2007/10800;3)。這些載體使得在相對小的體積內(nèi)可繁殖大的細(xì)胞數(shù)。玻璃 器皿由Pluristem(Pluristem，Haifa，Israel)設(shè)計(jì)并制造。生物反應(yīng)器保持于37°C培養(yǎng)箱 中，且由閥門和蠕動泵調(diào)節(jié)并監(jiān)測流速。生物反應(yīng)器包含取樣和注射點(diǎn)，使得可連續(xù)接種細(xì) 胞。從儲存器中供給PH 6. 7-7. 4的培養(yǎng)基。向該儲存器供給含有不同比例的空氣/C02A)2 的已過濾氣體混合物，其由生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度而定。A的比例適合生物反應(yīng)器出口 的溶解的O2水平，其由監(jiān)測器測定。經(jīng)由硅酮管或擴(kuò)散器(Degania Bet, Emek Hayarden, Israel)將氣體混合物提供給所述儲存器。培養(yǎng)基通過能夠收集循環(huán)的非貼壁細(xì)胞的分離 容器。通過蠕動泵得到培養(yǎng)基循環(huán)。生物反應(yīng)器進(jìn)一步配有附加的取樣點(diǎn)和用于連續(xù)交換 培養(yǎng)基的容器。
生產(chǎn)3D-貼壁細(xì)胞(PLX)用胰蛋白酶消化按上文所述培養(yǎng)的非匯合原代人貼壁2D細(xì)胞培養(yǎng)物，洗滌，重懸 在補(bǔ)充了 10% FBS、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100U/ml 100ug/ml 1. 25un/ml) 和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中，經(jīng)由注射點(diǎn)接種(IO3-IO5個細(xì)胞/ml)到無菌活塞流動生物 反應(yīng)器中的 3D 載體上。接種前，將 PBS-Ca-Mg(Biological Industries, Beit Ha' emek, Israel)填入生物反應(yīng)器，高壓滅菌(120°C，30分鐘)，用含有10%熱滅活的胎牛血清和青 霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100U/ml 100ug/ml 1. 25un/ml)的Dulbecco，s生長 培養(yǎng)基洗滌。流速保持在0. l-5ml/分鐘。接種過程涉及停止循環(huán)2-48小時，由此使得細(xì) 胞沉積到載體上。生物反應(yīng)器保持在受控的溫度(37°C )和pH條件(pH = 6. 7-7. 4)下；根 據(jù)需要使用供給了無菌空氣和CO2的培養(yǎng)箱。每周更換2-3次生長培養(yǎng)基。用新鮮的DMEM 培養(yǎng)基每4小時至7天更換循環(huán)培養(yǎng)基。在密度為IxlO6-IxIO7個細(xì)胞/ml (生長12-40天 后)時，從生物反應(yīng)器取出總培養(yǎng)基體積，用PBS將生物反應(yīng)器和載體洗滌3-5次。然后 用胰蛋白酶-EDTA 從載體分離 3D-貼壁細(xì)胞；(Biological Industries, Beit Ha' emek, Israel ；輕輕振蕩3_15分鐘，1-5次)，此后重懸于DMEM并冷藏。實(shí)施例2生產(chǎn)適于根據(jù)本教導(dǎo)內(nèi)容使用的2D貼壁細(xì)胞的方法和由此生產(chǎn)的2D貼壁細(xì)胞產(chǎn)生2D貼壁細(xì)胞，其顯示不同于上述3D貼壁細(xì)胞(PLX，實(shí)施例1)的特征。下一 步，將來自骨髓或胎盤來源的2D貼壁細(xì)胞在骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化刺激條件下生長。材料和實(shí)驗(yàn)程序2D貼壁細(xì)胞的生產(chǎn)方法人組織的接收所有獲得的胎盤均在赫爾辛基醫(yī)療機(jī)構(gòu)委員會的批準(zhǔn)下獲自產(chǎn)科病房。因此，所 有的胎盤供體簽署了知情同意書并進(jìn)行供體篩選和供體檢測(IPCl)。從供體取得胎盤(在 剖腹產(chǎn)程序中)后立即將其置于無菌塑料袋中，然后置于有冰袋WMyrofoam盒中。運(yùn)送 胎盤并立即置于隔離區(qū)直到質(zhì)量控制OiC)和質(zhì)量保證(QA)批準(zhǔn)使用。所有之后的生產(chǎn)步 驟均在隔離的潔凈室設(shè)備中進(jìn)行直到支原體測試結(jié)果的QC批準(zhǔn)到達(dá)，并且釋放細(xì)胞用于 2D細(xì)胞生長。貼壁細(xì)胞的回收和加工為了起始該過程，在層流通風(fēng)櫥下于無菌條件下將胎盤切碎，以Hank’ s緩沖液洗 滌并在37°C用0. 1 %膠原酶(Img膠原酶/ml組織)孵育3小時。加入2D細(xì)胞培養(yǎng)基(包 含補(bǔ)充了 10% FBS,0. 25 μ g/ml兩性霉素和50 μ g/ml慶大霉素的DMEM的2D-培養(yǎng)基)并 將被消化的組織粗略地濾過無菌金屬濾網(wǎng)，收集在無菌燒杯中并離心(10分鐘，1200RPM， 40C )。輕輕抽吸，然后用補(bǔ)充了抗生素的2D-培養(yǎng)基洗滌懸浮的細(xì)胞，接種在SOcm2燒瓶中 并在組織培養(yǎng)箱中于補(bǔ)充了 5% CO2的濕潤條件下37°C孵育。2-3天后，使細(xì)胞附著至燒 瓶表面，用PBS將它們洗滌并加入2D-培養(yǎng)基。二維QD)細(xì)胞生長在第一次傳代前，將隔離中的總燒瓶數(shù)的10%的生長培養(yǎng)基樣品合并并進(jìn)行支原 體測試(IPC2)。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的支原體(EZ-PCR支原體試劑盒，Biological Industries,Israel)為陰性，將細(xì)胞從隔離區(qū)釋放。另外傳代1_2代后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2D生產(chǎn)潔凈室 (2DP)中。一旦進(jìn)入2DP室，細(xì)胞繼續(xù)傳代3-5代(注意細(xì)胞生長于補(bǔ)充了抗生素的2D-培 養(yǎng)基中直到第二代，然后細(xì)胞生長于不含抗生素的培養(yǎng)基中)。第四次傳代后取IPC-3樣品 用于免疫表型檢測。在整個過程中，培養(yǎng)物在含有5% C02的濕潤條件下在37°C生長于組 織培養(yǎng)箱中?？偣矀鞔?-8代(9-16次細(xì)胞倍增)后，收集細(xì)胞并作為2D-細(xì)胞原種QDCS) 冷藏。通常在10-15天后進(jìn)行第一次傳代。從第2代開始持續(xù)至6-8代，通常在3_5 天后(1.5-2次倍增)，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到70-80 %匯合時將細(xì)胞傳代。用0.25%胰蛋白 酶-EDTA(37°C，4分鐘)從燒瓶分離細(xì)胞并以3士0. hlO3個細(xì)胞/cm2的培養(yǎng)密度接種。組 織培養(yǎng)瓶的大小隨著傳代進(jìn)行而增大。培養(yǎng)過程起始于80cm2的組織培養(yǎng)瓶，接著在175cm2 的組織培養(yǎng)瓶中，然后在500cm2的組織培養(yǎng)瓶(Triple瓶)中，最后將細(xì)胞接種至Cell Factory 10 盤(6320cm2)中。在冷藏之前，在2DCS生長期結(jié)束時，收集生長培養(yǎng)基并制備樣品送至經(jīng)批準(zhǔn)的 GLP實(shí)驗(yàn)室用于支原體測試(IPC 4)。2D-細(xì)胞-原種產(chǎn)品的冷藏程序?qū)τ?DCS冷藏，在無菌條件下用0. 25%胰蛋白酶-EDTA收集2D-培養(yǎng)的細(xì)胞。將 細(xì)胞離心(1200RPM，10’，4°C )、計(jì)數(shù)并重懸于2D培養(yǎng)基中。對于冷凍，用2D-冷凍混合物(終濃度為10 % DMS0、40 % FBS和50 % 2D-培養(yǎng) 基)1 1稀釋細(xì)胞懸液。從一個胎盤生產(chǎn)約1.5-2.切109個細(xì)胞。將細(xì)1細(xì)胞以終濃度 10x107ml保存在5ml冷藏聚丙烯小瓶中。將小瓶標(biāo)記并轉(zhuǎn)移至具有可控速率的冷凍機(jī)中 進(jìn)行逐漸降溫的過程(1°C /min)，之后將它們轉(zhuǎn)移以保存在位于冷藏室的液氮冷凍機(jī)的氣 相中。將這一材料稱作2D-細(xì)胞原種QDCS)批次。細(xì)胞周期分析用70 % EtOH將2D貼壁細(xì)胞和PLX細(xì)胞固定，離心并重懸于包含2 μ g/ml PI (Sigma)、0· 2mg/ml RNA 酶 A(Sigma)和 0· 1% (v/v) Triton(Sigma)的碘化丙錠(PI)溶 液中并持續(xù)30分鐘。通過FACS分析細(xì)胞周期?；虮磉_(dá)陣列(微陣列)貼壁細(xì)胞獲自人足月胎盤并通過2D培養(yǎng)或根據(jù)W0/2007/108003的教導(dǎo)(如實(shí)施 例1-2中詳述)擴(kuò)增。從各擴(kuò)增方法獲得三個不同批次的細(xì)胞用于進(jìn)一步檢驗(yàn)。從細(xì)胞提取RNA^liagen-foieasy微試劑盒)并應(yīng)用至Affymetrix完整基因組表 達(dá)陣列 GeneChip Human Exon 1. OST 陣列(Affymetrix，Santa Clara，California，USA)。膜標(biāo)記的FACS分析用如前所述的單克隆抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色。簡言之，將400，000-600，000個 細(xì)胞懸浮于5ml試管中的0. Iml流式細(xì)胞儀緩沖液中并于室溫(RT)在暗處用以下各 單克隆抗體(Mab)孵育15分鐘FITC-綴合的抗人CD^MAb (eBioscience)、PE綴合的 抗人 CD73MAb (Becton Dickinson)、PE 綴合的抗人 CD 105MAb (eBioscience)、PE 綴合 的抗人 CD90MAb (Becton Dickinson)、FITC-綴合的抗人 CD45MAb (IQProducts)、PE-綴 合的抗人 CD19 MAb (IQProducts)、PE 綴合的抗人 CDl4MAb (IQProducts)、FITC 綴合的 抗人 HLA-DRMAb (IQProduct)、PE 綴合的抗人 CD34MAb (IQProducts)、FITC 綴合的抗人CD31MAb(eBioscience)、FITC 綴合的抗人 KDR MAb (R&Dsystems)、抗人成纖維細(xì)胞標(biāo)記 (D7-FIB)MAb (ACRIS)、FITC-綴合的抗人 CD80MAb (BD)、FITC-綴合的抗人 CD86MAb (BD)、 FITC-綴合的抗人CD40MAb (BD)、FITC-綴合的抗人HLA-ABC MAb (BD)、FITC綴合的同種型 IgGl (IQ Products)、PE 綴合的同種型 IgGl (IQProducts)。用流式細(xì)胞儀緩沖液將細(xì)胞洗滌兩次，重懸于500 μ 1流式細(xì)胞儀緩沖液中并采 用FC-500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。用相關(guān)的同種型熒 光分子制備陰性對照。免疫調(diào)節(jié)測定從外周血中分離源自人的單核細(xì)胞(MNCs)。在存在20，000個2D貼壁細(xì)胞的情況 下，在37°C，含有5% (X)2的濕潤條件下，用10 μ gPHA/ml (SIGMA)刺激每200 μ 1培養(yǎng)基(每 96孔中含有20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基)200, 000個MNCs的懸浮液5天。使用四種不 同批次的2D貼壁細(xì)胞。每組三個重復(fù)接種在96孔板中。在5天培養(yǎng)的最后18小時中，用 IPC 3H-胸苷脈沖細(xì)胞并進(jìn)一步經(jīng)玻璃纖維濾器收集細(xì)胞。用閃爍計(jì)數(shù)器定量胸苷攝取。在2D貼壁細(xì)胞中誘導(dǎo)骨生成根據(jù)Chemicon骨生成試劑盒(目錄號scr028，MiIlipore，MA，USA)進(jìn)行骨生成。骨牛成誘導(dǎo)培養(yǎng)基在每次培養(yǎng)基更換之前使用試劑盒成分(參見下表1)新鮮地制備骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。表1 骨生成培養(yǎng)基成分
權(quán)利要求
1.治療有需要的受試者中的潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的方法，該方法包括給所述受 試者施用治療有效量的來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞，從而治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏 病。
2.來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞在制備經(jīng)鑒定用于治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病 的藥物中的用途。
3.制品，其包含包裝材料，該包裝材料包含用于治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的標(biāo)簽， 該包裝材料包裝藥學(xué)有效量的來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞包含選自⑶73、⑶90、 ⑶四和⑶105的陽性標(biāo)記表達(dá)。
5.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞包含選自⑶3、⑶4、⑶45、 CD80、HLA-DR、CD lib、CD14、CD19、CD34 和 CD79 的陰性標(biāo)記表達(dá)。
6.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)。
7.權(quán)利要求6的方法、用途或制品，其中所述抑制免疫反應(yīng)包括抑制T細(xì)胞活性。
8.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞獲自三維(3D)培養(yǎng)。
9.權(quán)利要求8的方法、用途或制品，其中所述三維(3D)培養(yǎng)包括3D生物反應(yīng)器。
10.權(quán)利要求8的方法、用途或制品，其中所述3D培養(yǎng)中的所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)在灌注 下實(shí)現(xiàn)。
11.權(quán)利要求8的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。
12.權(quán)利要求8的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)行到至少10%的所述 貼壁細(xì)胞正在增殖。
13.權(quán)利要求8的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞包含表11所述的基因表達(dá)概況。
14.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞包含在2維QD)培養(yǎng)條 件下從胎盤或脂肪組織培養(yǎng)的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法、用途或制品，其中至少12%的所述貼壁細(xì)胞處于S和/或G2/ M增殖期.
16.權(quán)利要求14的方法、用途或制品，其中所述貼壁細(xì)胞包含表8所述的基因表達(dá)概況。
17.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中與在相同條件下生長并分化的來自骨 髓的貼壁細(xì)胞相比，所述貼壁細(xì)胞較少地定型為成骨細(xì)胞系。
18.權(quán)利要求1、2或3的方法、用途或制品，其中與在相同條件下生長并分化的來自骨 髓的貼壁細(xì)胞相比，所述貼壁細(xì)胞較少地定型為成脂肪細(xì)胞系。
19.權(quán)利要求3的制品，其進(jìn)一步包含用于治療結(jié)腸炎癥的另外的藥物。
20.權(quán)利要求3的制品，其進(jìn)一步包含免疫抑制劑。
21.權(quán)利要求3的制品，其進(jìn)一步包含抗炎劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了在需要其的受試者中治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病的方法。該方法包括向所述受試者施用治療有效量的來自胎盤或脂肪組織的貼壁細(xì)胞，從而治療潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病。
文檔編號A61P37/00GK102123717SQ200980129576
公開日2011年7月13日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者M·梅倫 申請人:普拉里斯坦有限公司